TỔNG QUAN
TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC CÂY BẢY LÁ MỘT HOA
Hình 1.1 Các bộ phận sinh dưỡng và sinh sản của Bảy lá một hoa – Paris polyphylla var chinenis [20]
A Cây; B Một lá; C Thân rễ; D Lát cắt ngang thân rễ; E Đài hoa; F Cánh hoa;
G Nhị; H Nhụy; I Quả; K Hạt Tên gọi : Cây Bảy lá một hoa [8][20]
Tên khoa học là: Paris polyphylla var chinensis Franchet (PPC)
Tên đồng nghĩa là Paris chinensis Franchet, thuộc họ Trọng lâu (Trilliaceae) Các tên gọi khác là: Tảo hưu, Thất diệp nhất chi hoa hay Cúa dô (H’Mông) [3][15]
Phân giới thực vật bậc cao [8]
Phân lớp Loa kèn (Lilidae)
Họ Bảy lá một hoa (Trilliaceae)
Chi Bảy lá một hoa, Tảo hưu (Paris)
Bảy lá một hoa là cây thân thảo lâu năm, cao từ 40-100 cm với thân rễ hình trụ ngắn nằm ngang Thân cây thẳng đứng, không phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân và tàn lụi vào mùa đông Cây ra hoa từ tháng 3 đến tháng 7 và có quả từ tháng 8 đến tháng 12 Lá cây xếp thành vòng, có 5-7 lá, màu xanh, hình trứng ngược, kích thước 5-7 cm với 5-7 gân chính Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, lớn và lưỡng tính, cuống hoa dài từ 15-40 cm Đài hoa có 5-7 lá, hình mũi giáo, màu xanh, trong khi cánh hoa có 5-7 chiếc, màu vàng, dạng dải, kích thước đồng đều.
Chiều dài của nhị dẹp từ 0,5-1,2 cm, gắn tại gốc mảnh bao hoa, trong khi bao phấn có hình thuôn, đính ở gốc với 2 ô mở bằng khe dọc Đỉnh bao phấn kéo dài thành hình kim, dài từ 1-2,5 mm Bầu nhụy có hình trứng, chứa nhiều noãn và đính bên, vòi nhụy gồm 5-6 nhụy dính nhau ở phần gốc, với đầu nhụy có 5 phần.
6 Quả nang, mở ở lưng Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nước hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc, hình cầu hoặc hình trứng [8]
Bảy lá một hoa là cây ưa ẩm, thích bóng râm, thường mọc ở những nơi đất ẩm, nhiều mùn gần bờ nước, khe suối hoặc trong hốc đá dưới tán rừng thường xanh ở độ cao trên 600m Thân rễ của cây này có 1-2 chồi ngủ, tồn tại qua mùa đông và sẽ mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau.
Ra hoa vào tháng 3 – 7, có quả vào tháng 8 – 12 [8] [16]
1.1.3.3 Phân bố Ở Việt Nam, cây Bảy lá một hoa phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc như: Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Phú Thọ, Thái Nguyên, Hà Nội (Ba Vì), Hòa Bình, Nghệ An, Ninh Bình [8] [16]
Thế giới: cây Bảy lá một hoa phân bố chủ yếu ở các nước châu Á như Trung Quốc, Myanmar, Ấn Độ, … [29]
Cây Bảy lá một hoa, một loại thuốc quý hiếm ở Việt Nam, đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng do nạn phá rừng và khai thác cạn kiệt để buôn bán Việc bảo tồn loài cây này trở thành một yêu cầu cấp thiết nhằm bảo vệ môi trường sống của nó và duy trì nguồn gen quý giá cho tương lai.
1.1.4 Thành phần hóa học của cây Bảy lá một hoa
Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Paris bắt đầu từ năm 1938, khi Dutt và cộng sự đã phân lập thành công hai hợp chất parid và paristyphnin từ loài P Quadrifolia Đến năm 1983, Nakano và Chen đã công bố các hợp chất saponin, flavonoid glycosid, sterol, β-phytoecdyson và polysaccharid Tiếp theo, vào năm 2002, Hisashi Matsuda cùng cộng sự đã phân lập được bốn loại spirostanol saponin steroid.
To date, over 100 saponins have been isolated from species within the Paris genus, including P axialis, P polyphylla var yunnanensis, P polyphylla var chinensis, P delavayi Franch., P vietnamensis, P dunniana, P luquanensis, Paris polyphylla var pseudothibetica, and P quadrifolia These compounds include steroid saponins such as spirostan saponins, furostan saponins, pseudo-spirostanol saponins, pregnan saponins, and triterpenoid saponins, along with flavonols and various other glycosides.
Các báo cáo gần đây về các thành phần trong thân rễ cây Bảy lá một hoa đã chỉ ra rằng saponin steroid là thành phần chính trong các chất chiết xuất từ cồn của loại cây này.
1.1.5 Tác dụng dược lý và công dụng của Bảy lá một hoa
Saponin steroid, đặc biệt là diosgenin và pennogenin, được chiết xuất từ cây Bảy lá một hoa, đã được chứng minh có khả năng cầm máu hiệu quả Nghiên cứu của L Guo và cộng sự cho thấy rằng saponin từ cây này giúp giảm chảy máu bất thường ở tử cung nhờ vào tác dụng tăng cường co thắt cơ tử cung.
Nghiên cứu của Theo Ying Wang và cộng sự cho thấy rằng phân đoạn n-butanol từ dịch chiết etanol 30%, 50% và 70% của loài Pari bashanensis có khả năng giảm thời gian máu chảy và thời gian đông máu trên chuột thực nghiệm Thành phần hóa học chính trong các dịch chiết này là saponin steroid, chủ yếu là saponin pennogenin, có thể là nguyên nhân mang lại tác dụng cầm máu cho dịch chiết.
Chiết xuất từ thân rễ của Pari.polyphylla Smith và các loại khác có khả năng làm giảm nguy cơ mắc các loại ung thư Đặc biệt, P.polyphylla var yunnanensis đã được nghiên cứu một cách sâu rộng trong lĩnh vực này.
P polyphylla, một loại thảo dược từ Trung Quốc, đã được phát hiện có khả năng chống ung thư mạnh mẽ Các dịch chiết nước, ethanolic và methanolic của cây này cho thấy hoạt động chống ung thư đối với nhiều loại tế bào ung thư khác nhau Nghiên cứu hóa học và dược lý đã chỉ ra rằng saponin steroid là thành phần chính có hoạt tính chống ung thư, đặc biệt là trong việc điều trị ung thư gan.
Polyphyllin VII (PVII) là một trong những saponin steroid là hợp chất hoạt động trong việc chống ung thư gan ở người Khi PVII được kiểm tra độc tính tế bào trên 05 dòng tế bào ung thư ở người (MCF7, Caco2, SKOV3, A549 và HepG2), ở các nồng độ khác nhau trong 24 giờ, thì kết quả cho thấy sự ức chế trong sự tăng trưởng của tất cả các dòng tế bào được xác định bằng cách thử với Methyl thiazolyl tetrazol (MTT) PVII gây ra apoptosis thông qua việc tạo ra các loại oxy phản ứng nội bào (ROS) trong các tế bào Nó gây ra stress oxy hóa trong các tế bào HepG2 Sản xuất ROS này dẫn đến khử cực tiềm năng màng ty thể, DNA và cuối cùng là apoptosis [55]
Hoạt động chống ung thư của Paris polyphylla var yunnanensis đã cho thấy kết quả hứa hẹn trong nghiên cứu trên chuột được gây ung thư bằng diethylnitrosamine (DEN) Sau khi tiêm DEN với liều 70mg/kg, chuột phát triển ung thư tế bào gan tương tự như ung thư biểu mô tế bào gan ở người Sau hai tháng, chuột bị viêm gan và xơ gan, nhưng khi được điều trị bằng saponin từ Paris polyphylla, tình trạng sức khỏe của chúng đã cải thiện Sau 20 tuần, kiểm tra mô bệnh học cho thấy trọng lượng cơ thể giảm và tổn thương gan nhưng không có bất thường ở chuột bình thường Điều này cho thấy saponin từ cây Bảy lá một hoa có khả năng giảm tổn thương gan và ức chế sự phát triển của ung thư gan.
TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ
Ung thư là bệnh liên quan đến sự phát triển bất thường của tế bào Trong cơ thể, các tế bào khỏe mạnh có tuổi thọ nhất định và tuân theo quy trình phát triển, lão hóa và chết Khi các tế bào chết, chúng sẽ được thay thế bằng tế bào mới Cơ thể có cơ chế kiểm soát nghiêm ngặt quá trình này để duy trì số lượng tế bào ổn định cho mỗi cơ quan và tổ chức.
Ung thư, hay còn gọi là u ác tính, là một nhóm bệnh lý đa dạng xuất phát từ các tế bào khác nhau, với khả năng di căn và phương pháp điều trị khác nhau Điểm chung của tất cả các loại ung thư là sự tăng sinh không kiểm soát, dẫn đến sự phát triển vô tổ chức, xâm lấn các mô và cơ quan xung quanh, hoặc di chuyển đến các vị trí xa hơn trong cơ thể.
Nếu không được điều trị kịp thời, nhiều loại ung thư có thể dẫn đến tử vong Tuy nhiên, một số bệnh ung thư có thể được kiểm soát và chữa khỏi nếu được phát hiện sớm và điều trị đúng cách.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai trên toàn cầu, với 8,8 triệu người chết vào năm 2015 Tại Việt Nam, số ca mắc mới ung thư đang gia tăng liên tục, từ 68.000 ca mỗi năm.
Từ năm 2000 đến năm 2010, số ca mắc ung thư đã tăng từ 2000 lên 126.000, và đến năm 2018, con số này đã lên gần 165.000 ca trên tổng dân số 96,6 triệu người Trong đó, gần 70% trường hợp tử vong, tương đương 115.000 ca, khiến Việt Nam xếp hạng 99/185 quốc gia và vùng lãnh thổ về tỷ lệ mắc ung thư, đạt 151,4 ca/100.000 dân, đứng thứ 19 tại châu Á và thứ 5 trong khu vực Đông Nam Á.
Nguyên nhân gây ung thư bao gồm yếu tố di truyền, môi trường sống và lối sống, trong đó chế độ ăn uống cũng đóng vai trò quan trọng Tại Việt Nam, năm loại ung thư phổ biến nhất là ung thư gan (25.000 ca, chiếm 15,4%), ung thư phổi (14,4%), ung thư dạ dày (10,6%), ung thư vú và ung thư đại tràng Ở nam giới, ung thư phổi dẫn đầu với tỷ lệ 21,5%, tiếp theo là ung thư gan (18,4%), ung thư dạ dày, ung thư đại tràng và ung thư hầu họng Trong khi đó, ở nữ giới, ung thư vú là loại phổ biến nhất, tiếp theo là ung thư đại tràng, ung thư phổi và ung thư gan.
Hình 1.2: Biểu đồ số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam năm 2018 [57]
1.2.2 Các giai đoạn phát triển của ung thư
Giai đoạn 1 của ung thư là giai đoạn đầu, khi tế bào ung thư mới xuất hiện, còn nhỏ và chưa lan rộng, do đó chưa có triệu chứng rõ ràng Phát hiện sớm có thể giúp nâng cao khả năng chữa lành lên tới 80%, vì vậy bác sĩ khuyến khích người bệnh bắt đầu điều trị ngay Người bệnh nên thực hiện các phương pháp chăm sóc sức khỏe như bổ sung dinh dưỡng, thay đổi chế độ ăn uống lành mạnh, luyện tập thể lực và xây dựng thói quen sinh hoạt tốt Nếu tế bào ung thư có dấu hiệu phát triển, phẫu thuật có thể được yêu cầu để loại bỏ triệt để Quá trình điều trị ở giai đoạn này thường ít gây đau đớn và tác dụng phụ.
Giai đoạn 2 của ung thư cho thấy các tế bào ung thư đã phát triển rõ ràng, nhưng mức độ nguy hiểm vẫn chưa nghiêm trọng Nếu được phát hiện và điều trị kịp thời, bệnh nhân có khả năng hồi phục nhanh chóng, với tỷ lệ chữa khỏi toàn cầu đạt 80% Tuy nhiên, tại Việt Nam, tỷ lệ này chỉ khoảng 70% do thói quen phát hiện bệnh muộn.
Giai đoạn 3 của ung thư đánh dấu sự di chuyển và xâm nhập của tế bào ung thư vào các mô, máu và bạch huyết xung quanh, dẫn đến sự hình thành hàng triệu tế bào và khối u ác tính lan rộng trong cơ thể Tùy thuộc vào vị trí và mức độ phát triển của tế bào, bệnh nhân có thể lựa chọn các phương pháp điều trị như hóa trị, xạ trị, miễn dịch trị hoặc phẫu thuật.
Giai đoạn 4 của ung thư, hay còn gọi là “ung thư giai đoạn cuối”, đặc trưng bởi khả năng nhận biết và chẩn đoán cao, nhưng tỷ lệ điều trị thành công lại rất thấp Một trong những mối lo ngại lớn nhất là hiện tượng ung thư di căn, khi tế bào ung thư lan rộng sang các bộ phận khác như xương, phổi, gan và não, gây ra các triệu chứng nghiêm trọng như khó thở, buồn nôn, và rụng tóc Bên cạnh đó, bệnh nhân thường trải qua những thay đổi hóa học và vật lý trong cơ thể, dẫn đến tâm lý nhạy cảm, dễ tức giận, sợ hãi, và có thể có hành vi bạo lực với người xung quanh.
1.2.3 Các đặc tính của tế bào ung thư
So với tế bào bình thường thì tế bào ung thư có các đặc tính khác biệt như sau:
- Tế bào ung thư có khả năng biệt hóa kém do đó phân chia rất nhanh và liên tục
Qua quá trình phân chia tế bào, hệ gen có thể bị thay đổi, dẫn đến những đặc tính tế bào bất thường và nhanh chóng, làm thay đổi hoặc mất chức năng của chúng Về mặt hình thái, tế bào ung thư khác biệt so với tế bào bình thường, đặc biệt là số lượng sợi phân bào nhiều hơn để phục vụ cho quá trình phân chia.
Tế bào ung thư có khả năng sinh sản ngoài sự kiểm soát, khác với tế bào bình thường phát triển và chết theo một lập trình chặt chẽ Tế bào ung thư phân chia bất thường, nhanh hơn và không trưởng thành, dẫn đến việc tế bào con không bị chết như tế bào bình thường Nguyên nhân chính là do telomere, chuỗi ADN lặp lại ở đầu nhiễm sắc thể, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và ổn định của nhiễm sắc thể Khi tế bào phân chia, telomere ngắn lại, gây lão hóa và chết tế bào Tuy nhiên, tế bào ung thư không bị ngắn telomere sau mỗi lần phân chia, nên chúng không lão hóa và tồn tại lâu dài.
- Tế bào ung thư có khả năng thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ thể
Trong hệ miễn dịch của cơ thể, tế bào Natural Killer Cell có khả năng nhận diện và tiêu diệt ngay lập tức các tế bào lạ xâm nhập Tuy nhiên, tế bào ung thư, mặc dù có sự khác biệt so với tế bào bình thường, lại có khả năng ẩn mình, giúp chúng trốn tránh sự phát hiện và tiêu diệt của hệ miễn dịch Theo nghiên cứu của Darnell và cộng sự, tế bào ung thư có khả năng ngụy trang để vượt qua sự nhận biết của các tế bào Lympho, khiến cơ thể không thể tiêu diệt chúng.
- Tế bào ung thư có khả năng xâm lấn và di căn.
Tế bào ung thư hình thành do tác động của các yếu tố nội bào và ngoại bào, sau đó chúng phân chia liên tục tạo thành khối u Những khối u này ngày càng lớn, chiếm chỗ và chèn ép các cơ quan lân cận Các tế bào ung thư trong khối u không ngừng tăng sinh, mất đi khả năng cảm nhận giới hạn với tế bào xung quanh, và sản xuất nhiều cytokine cùng enzyme protease, dẫn đến phá hủy màng đệm và môi trường ngoại bào Kết quả là, các tế bào ung thư dễ dàng tách ra khỏi khối u mẹ, di chuyển qua hệ mạch máu và bạch huyết, bám vào các tổ chức và cơ quan mới, và tiếp tục tăng sinh Quá trình này được gọi là di căn.
1.2.4 Các đặc tính phát triển nuôi cấy tế bào của tế bào ung thư
Các tế bào ung thư có khả năng sống sót và phát triển trong môi trường nuôi cấy in vitro mà không cần chế độ dinh dưỡng phức tạp, trong khi các tế bào bình thường chỉ tồn tại trong thời gian ngắn do yêu cầu môi trường phức tạp hơn Các tế bào non như nguyên bào sợi có thể sống lâu hơn nhưng cũng sẽ chết sau một thời gian nhất định Ngược lại, tế bào ung thư chỉ cần các yếu tố dinh dưỡng đơn giản như carbohydrate, protein, vitamin và muối khoáng Nhiều tế bào ác tính được gọi là "bất tử" vì chúng có thể duy trì sự sống vô hạn trong môi trường nuôi cấy.
MỘT SỐ KHÁI NIỆM VỀ ĐỘC CHẤT HỌC
Khái niệm về độc tính: Được dùng để miêu tả tính chất gây độc của chất độc đối với cơ thể sống
Độc lực là khái niệm chỉ lượng chất độc có khả năng gây ảnh hưởng độc hại hoặc biến đổi sinh học có hại cho cơ thể trong những điều kiện nhất định Khi nghiên cứu độc lực, cần chú ý đến mối quan hệ giữa liều lượng chất độc và phản ứng của cơ thể bị ngộ độc Theo quy định quốc tế, liều lượng chất độc được tính bằng milligram (mg) chất độc trên 1kg khối lượng cơ thể, nhằm xác định ảnh hưởng sinh học cụ thể.
Một số khái niệm về liều lượng được sử dụng để xác định độc lực của chất độc:
- ED50 (Effective Dose) là liều có tác dụng với 50% động vật thí nghiệm
Liều tối đa không gây độc (HNTP) là lượng thuốc hoặc chất độc cao nhất mà cơ thể có thể tiếp nhận mà không gây ra các biến đổi bệnh lý.
- Liều thấp nhất có thể gây độc (TDL - Toxic Dose Low) là liều khi cho gấp đôi liều này sẽ không gây chết động vật
- Liều gây độc (TDH - Toxic Dose High) là liều lượng sẽ tạo ra những biến đổi bệnh lý, khi cho gấp đôi liều này sẽ gây chết động vật
Liều chết (LD - Lethal Dose) là lượng chất tối thiểu có khả năng gây tử vong cho động vật, với các tỷ lệ khác nhau như LD1, LD50 và LD100, tương ứng với tỷ lệ tử vong 1%, 50% và 100% trong số các cá thể động vật.
Ngộ độc là tình trạng rối loạn hoạt động sinh lý bình thường của cơ thể do tác động của chất độc, gây ức chế các phản ứng sinh hóa và chức năng enzym Chất độc có thể dẫn đến sự mất cân bằng trong hormone, hệ thần kinh và các chức năng tế bào, từ đó tạo ra những triệu chứng và phản ứng bất thường trong cơ thể.
Ngộ độc cấp tính là tình trạng xảy ra khi cơ thể tiếp xúc với chất độc trong một khoảng thời gian ngắn, dẫn đến các biểu hiện ngộ độc xuất hiện sớm Thời gian xuất hiện triệu chứng có thể từ 1-2 phút đến 30-60 phút sau khi hấp thu chất độc, thường xảy ra trong vòng 24 giờ, tùy thuộc vào loại chất độc và cách thức xâm nhập vào cơ thể.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY BẢY LÁ MỘT HOA TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
Bảy lá một hoa là một trong những cây thuốc quý hiếm của Việt Nam, mang lại nhiều lợi ích cho ngành dược và kinh tế nông hộ Nghiên cứu và phát triển cây thuốc này không chỉ giúp bảo tồn dược liệu bản địa mà còn tạo ra cơ hội trồng trọt hiệu quả trong vườn nhà và vườn rừng vùng núi cao Từ năm 2013 đến 2016, chương trình Quỹ Gen đã hỗ trợ việc nghiên cứu về cây thuốc Bảy lá một hoa.
Bộ Khoa học và Công nghệ đã giao nhiệm vụ nghiên cứu và phát triển nguồn gen cây Bảy lá một hoa (Paris chinensis Franch.) và Huyết rồng lào (Spatholobus suberectus Dunn.) làm nguyên liệu sản xuất thuốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng đã tập trung xây dựng vườn cây gốc, vườn nhân giống và vườn trồng cây thuốc tại Vườn Quốc gia Pù Mát và Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn Theo Quyết định số 2048/QĐ-BKHCN ngày 01 tháng 08 năm 2017, đã hoàn thành báo cáo tổng quan về đặc điểm nông sinh học và giá trị sử dụng của cây Bảy lá một hoa, xây dựng quy trình nhân giống bằng hạt và thân rễ, cùng với tiêu chuẩn cơ sở cho cây giống và dược liệu Hiện tại, đã có 6 mô hình trồng Bảy lá một hoa với tổng diện tích 4500m² vườn giống gốc, 2000m² vườn nhân giống và 7 ha vườn sản xuất cây dược liệu dưới tán rừng.
Theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” (tập I), thân rễ Bảy lá một hoa chứa 7 – 9 % đường, 2% glycosid là α – paridin và α – paristyphnin [1]
Năm 2015, Châu Thị Nhã Trúc và các cộng sự đã phân lập thành công 4 saponin sterol từ thân rễ loài Paris yunnanensis thu hoạch tự nhiên tại Kon Tum, bao gồm diosgenin, gracillin, và hỗn hợp stigmasterol-3-O-β-D-glucosid cùng với sistosterol-3-O-β-D-glucosid, được công bố trên Tạp chí Dược liệu.
Năm 2016, Nguyễn Thị Duyên và cộng sự đã công bố nghiên cứu trên Tạp chí Khoa học và Công nghệ về thành phần hóa học của Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinensis Franchet) thuộc họ Trọng lâu (Triliaceae) Nghiên cứu đã phân lập được 5 hợp chất từ chiết xuất n-butanol, bao gồm diosgenin, stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid, este glycerol, dioscin và paris saponin VII, với cấu trúc được xác định qua phân tích phổ MS và NMR Đây là báo cáo đầu tiên về các hợp chất từ phần trên mặt đất của Bảy lá một hoa được trồng tại Sapa, Lào Cai.
Công trình nghiên cứu của Phạm Nguyễn Duy Bình năm 2016 về cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla Smith, Trilliaceae) tại Nghệ An đã chỉ ra sự hiện diện của các hợp chất như saponin, acid amin và chất khử trong bột thân rễ của cây Nghiên cứu cũng xác nhận tác dụng bảo vệ gan của cây Bảy lá một hoa thông qua cơ chế chống oxy hóa, được thử nghiệm trên mô hình gây độc tính gan chuột bằng cyclophosphamid.
Cao cồn Bảy lá một hoa không làm tăng hàm lượng MDA trong gan chuột, nhưng có tác dụng bảo vệ gan khỏi tổn thương do cyclophosphamid gây ra Cơ chế bảo vệ gan của cao cồn này là ức chế peroxy hóa lipid và phục hồi hàm lượng glutathion, chất chống oxy hóa nội sinh, tương tự như tác dụng của silymarin, một hợp chất nổi tiếng trong việc bảo vệ gan.
Thông tin về thành phần hóa học của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam hiện vẫn còn hạn chế, đặc biệt là về công dụng của nó, với rất ít công bố và nghiên cứu được thực hiện cho đến nay.
1.4.2 Thế giới Đối với chi Paris
Trong nhiều năm qua, các loài chi Paris đã được sử dụng để hỗ trợ điều trị nhiều loại ung thư nhờ vào các saponin có trong dược liệu Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng tác dụng chống ung thư chủ yếu của các saponin này là kích thích quá trình chết theo chương trình tế bào (apoptosis) Năm 2009, Man Shuli và cộng sự đã phát hiện tác dụng chống ung thư phổi của Paris polyphylla var yunnanensis (Fr.) Hand-Mazz, khi dịch chiết saponin từ thân rễ loài này ức chế sự phát triển và di căn của tế bào ung thư phổi LA795 trên chuột thực nghiệm Cơ chế hoạt động liên quan đến việc kích thích apoptosis và tăng cường hoạt động của MMP-2, MMP-9, cũng như điều hòa TIMP-2 Hợp chất chính trong dược liệu bao gồm saponin diosgenin và penogenin, tuy nhiên, nhóm nghiên cứu vẫn chưa xác định được thành phần chính có tác dụng.
Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Yan đã khảo sát tác dụng chống ung thư phổi của diosgenin và 8 saponin từ loài thực vật, cho thấy tất cả các hợp chất đều ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư biểu mô phổi LA795 với mức độ khác nhau Saponin diosgenin có hiệu quả tốt hơn saponin pennogenin, và số lượng phân tử đường glycosid hóa tại C-3 của saponin spirostan ảnh hưởng đến khả năng gây độc tế bào ung thư, với cơ chế tác động thông qua con đường chết theo chương trình.
Năm 2010, nghiên cứu của Li Xi đã phát hiện rằng saponin từ thân rễ của Paris polyphylla var yunnanensis (PPY) có khả năng ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư đại tràng SW480 Cơ chế hoạt động của saponin này là do chúng ngăn chặn quá trình tổng hợp protein và ADN trong các tế bào ung thư, từ đó làm giảm sự phân bào và tăng trưởng của tế bào SW480.
Năm 2013, Chen Guang Lie và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của saponin từ loài PPY (paris saponin) đối với ung thư cổ tử cung và khả năng điều hòa miễn dịch ở chuột Kết quả cho thấy saponin có khả năng ức chế đáng kể dòng tế bào ung thư cổ tử cung U14 cả in vitro và in vivo, giúp kéo dài thời gian sống của chuột, đồng thời tăng nồng độ IFN-γ và giảm nồng độ IL-4 trong huyết thanh chuột mang khối u Trong thử nghiệm in vitro, paris saponin thể hiện tác dụng ức chế phụ thuộc vào thời gian và nồng độ với mức liều từ.
Theo nghiên cứu của Fu-Rong Li và cộng sự (2012), dịch chiết etanol 95% từ thân rễ Paris polyphylla Smith có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thực quản ECA109 Hiệu quả này được giải thích bởi việc tăng cường biểu hiện của gen ức chế ung thư conneci 26 ở cả mức độ mARN và protein, dẫn đến quá trình chết tế bào thông qua việc gia tăng yếu tố kích thích giải phóng cytochrom c Bax và giảm yếu tố ức chế Bcl-2.
Từ phân đoạn etyl axetat của dịch chiết etanol 70% thân rễ Paris polyphylla
Nhóm nghiên cứu của Yu Wang, Hand-Mazz, đã phân lập falcarindiol và các hợp chất saponin, sau đó đánh giá tác dụng kháng khối u in vitro trên hai dòng tế bào L929 và Hela bằng phương pháp MTT Kết quả cho thấy các hợp chất saponin có tác dụng ức chế đối với cả hai dòng tế bào này Hơn nữa, falcarindiol có khả năng tiêu diệt chọn lọc tế bào ung thư đại tràng, ức chế sự phát triển của khối u trong mô hình gây u ngoại lai bằng tế bào HTC116, và còn làm tăng cường hiệu quả diệt tế bào ung thư trực tràng của 5-fluorouracil.
Năm 2006, Huang Y và cộng sự đã phân lập 11 hợp chất từ Paris vietnamensis, chủ yếu là saponin diosgenin và pennogenin Các hợp chất này đã được nghiên cứu và cho thấy tác dụng gây độc tế bào đối với các dòng ung thư HepG2 và SGC-7901.
Năm 2014, Wenjie Zhang và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống ung thư của saponin từ thân rễ Paris polyphylla, cho thấy hợp chất này có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư cổ tử cung Hela với giá trị IC50 là 2,62 ± 0,11 μM.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG
Cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var Chinensis) được nghiên cứu và thu thập từ đỉnh núi Fu Xai Lai Leng, tọa lạc tại xã Na Ngoi, huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An, với độ cao 2711 m so với mực nước biển Tọa độ lấy mẫu là 19°11'52"N và 104°10'57"E.
Hình 2.1: Bảy lá một hoa tại đỉnh núi Fu Xai Lai Leng
(xã Na Ngoi, huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An)
- Tế bào ung thư vú (MCF7)
- Tế bào ung thư phổi SK-LU-1
- Tế bào ung thư ruột kết HT-29
- Tế bào ung thư gan HepG2
Các dòng tế bào ung thư do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và
GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp
Chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không phân biệt giống, không mắc bệnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, có khối lượng từ 24-26g
2.1.4 Hóa chất v Hóa chất nghiên cứu thành phần hóa học
- Dung môi chiết xuất: cồn dược dụng 96 % (gọi là ethanol 96%)
Dung môi hữu cơ như etyl axetat, butanol, aceton, và ether dầu hỏa thường được sử dụng trong quá trình chiết phân đoạn Ngoài ra, các hóa chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong các thử nghiệm nhằm gây độc tế bào ung thư.
- Chất tham khảo: Ellipticine (Sigma, USA),
Và một số hóa chất thông thường khác
2.1.5 Thiết bị và dụng cụ v Dùng trong chiết xuất và phân lập
- Cân điện tử độ nhạy 0,1 g
- Máy cô quay chân không
- Một số dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm v Dùng trong thử nghiệm độc chất học
- Kim uống thuốc với đầu cong, ống tiêm 1 ml
- Vĩ đựng thức ăn, ống uống nước của chuột v Dùng trong thử nghiệm gây độc tế bào ung thư
- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA)
- Máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad)
- Máy tính có cài phần mềm máy tính TableCurve
- Thu mẫu cây Bảy lá một hoa tại đỉnh núi Fu Xai Lai Leng, thuộc xã Na Ngoi, huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An
- Chiết dịch cây Bảy lá một hoa tại Trung tâm Thực hành – Thí nghiệm trường Đại học Vinh
Phòng thử nghiệm sinh học tại Viện Công nghệ Sinh học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tiến hành thử nghiệm tế bào ung thư và thử độc cấp trên động vật.
- Theo dõi chuột tại Phòng thử nghiệm sinh học - Viện công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Làm tiêu bản vi thể chuột tại bệnh viện Ung bướu tỉnh Nghệ An.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Thu hái mẫu Đào lấy thân rễ cây Bảy lá một hoa, đem rửa sạch, cắt đoạn 1 cm và sấy khô ở nhiệt độ 60 o C
2.2.2 Chiết xuất cao toàn phần và chiết các phân đoạn cây Bảy lá một hoa
Phương pháp chiết ngấm kiệt
2.2.2.1 Sơ chế nguyên liệu: Thân rễ cây Bảy lá một hoa tươi sau khi thu hái, loại bỏ những thân rễ dập nát, hư hỏng, sau đó rửa sạch, cắt khúc chừng 1cm và sấy khô ở nhiệt độ 60 0 C với mục đích bảo quản nguyên liệu khỏi bị nhiễm mốc, vi khuẩn và hạn chế các biến đổi hóa học có thể xảy ra trong nguyên liệu như bị thủy phân, oxy hóa
Dung môi được sử dụng là hỗn hợp ethanol và nước với tỷ lệ 7/3, giúp giữ lại hầu hết các hợp chất trong nguyên liệu Hơn nữa, dung môi này có chi phí thấp, dễ tìm và ít độc hại cho con người cũng như môi trường.
2.2.2.3 Chiết cao toàn phần cây Bảy lá một hoa
- Bước 1: Nguyên liệu sau khi sơ chế được xay thô để được kích thước khoảng
Khi kích thước nguyên liệu nhỏ hơn, bề mặt tiếp xúc với dung môi tăng, dẫn đến quá trình khuếch tán và chiết xuất diễn ra nhanh hơn Tuy nhiên, nếu nguyên liệu được xay quá mịn, sẽ gây ra tình trạng bết dính, tạo thành bột nhão và vón cục, làm chậm quá trình chiết xuất và gây khó khăn trong việc rút dịch chiết Ngoài ra, việc xay quá mịn cũng làm hỏng nhiều tế bào nguyên liệu, khiến dịch chiết bị lẫn tạp chất, gây khó khăn cho quá trình tinh chế và bảo quản Do đó, chúng tôi khuyến nghị xay mẫu thô đến kích thước bằng hạt gạo, sử dụng sàng có lỗ 3mm.
- Bước 2: Chiết cao toàn phần với dung môi ethanol
Cho nguyên liệu vào bình thủy tinh rồi đổ ngập dung môi, ngâm trong thời gian 2 tuần, để ở nhiệt độ phòng Sau đó chiết, thu dịch lỏng
Thêm 2 lần dung môi vào bình ngâm nguyên liệu ngâm trong thời gian 1 ngày, sau đó chiết thu dịch lỏng (Lúc này màu chiết đã rất nhạt => đã kiệt)
Dịch chiết thu được, hay còn gọi là dịch chiết thô, bao gồm dung môi và chất chiết Bước tiếp theo là loại bỏ dung môi để thu được chất chiết tinh khiết hơn.
- Bước 3: Loại bỏ dung môi
Dịch chiết được cất loại bỏ dung môi ở áp suất thấp bằng mấy cô quay chân không, thu được cao tổng
Nguyên lý: Áp suất được tạo ra bằng bơm, hút khí nên dịch chiết sôi ở nhiệt độ thấp
Hình 2.2: Máy cô quay chân không 2.2.2.4 Chiết các phân đoạn Bảy lá một hoa
- Nguyên liệu: Cao toàn phần Bảy lá một hoa chiết được theo quy trình trên
Nguyên tắc chiết phân lớp dựa vào tính tan của các chất trong các dung môi phân cực và không phân cực, nhằm lựa chọn dung môi phù hợp cho quá trình chiết xuất.
Cụ thể dịch Bảy lá một hoa được chiết trong các dung môi: n-hexan (eter dầu hỏa), etyl axetat, n- butanol, nước
Quy trình tách chiết cao toàn phần bắt đầu bằng việc hòa tan vào nước, trong đó một số hợp chất sẽ tan và phần còn lại sẽ lắng xuống đáy Tiếp theo, thêm n-hexan để tạo ra hai lớp: lớp dưới là nước và lớp trên là hexan.
Phần không và ít phân cực sẽ tan vào n- hexan Sau đó ta chiết phần dịch chiết với n- hexan ra, thu được cặn còn gọi là phân đoạn ETE
Phần dịch trong nước được chiết xuất với etyl axetat, một dung môi phân cực nhẹ, dẫn đến sự phân tách thành hai lớp Quá trình chiết rút này giúp thu được các chất phân cực nhẹ, và sau đó, cao etyl axetat có hoạt tính cao được cô đặc bằng máy quay chân không.
Thêm n-butanol vào phần dịch nước còn lại, sẽ tạo ra hai lớp do butanol tan ít trong nước Là một dung môi phân cực, butanol có khả năng hòa tan các hợp chất hữu cơ phân cực, giúp lấy các chất phân cực còn lại trong nước Cuối cùng, tách và cất thu hồi dung môi để thu được cao butanol.
Hình 2.3: Sơ đồ chiết cao tổng (cao toàn phần) và chiết phân đoạn Bảy lá một hoa
2.2.3 Khảo sát sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin trong thân rễ Bảy lá một hoa
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết cao toàn phần chứa saponin với tỉ lệ cao có tác dụng ức chế tế bào ung thư Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin trong thân rễ cây Bảy lá một hoa.
- Mẫu thử nghiệm: Cao toàn phần (được chiết trong ethanol)
Mỗi loại dược liệu chứa các nhóm hợp chất cụ thể, và dựa vào tính chất của những hợp chất này, chúng ta có thể nhận diện chúng thông qua các phản ứng hóa học đặc trưng như phản ứng màu, phản ứng kết tủa và phản ứng tạo bọt.
- Định tính saponin thông qua phản ứng tạo bọt
Cho dịch chiết cao toàn phần vào ống nghiệm và bịt kín bằng ngón cái Lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong 5 phút, sau đó để yên và quan sát cột bọt sau 15 phút Nếu quá trình tạo bọt diễn ra mạnh mẽ và cột bọt bền vững sau 15 phút, thì dược liệu chứa saponin.
2.2.4 Phương pháp nghiên cứu độc cấp và bán trường diễn của cây Bảy lá một hoa 2.2.4.1 Phương pháp nghiên cứu tính độc cấp của dịch chiết Bảy lá một hoa
Đối tượng nghiên cứu là chuột nhắt trắng BALB/c khỏe mạnh, không phân biệt giới tính, có trọng lượng khoảng 24 – 26 gram Những con chuột này được nuôi tại khu vực nuôi chuột của phòng Thực nghiệm Sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đảm bảo đạt tiêu chuẩn về nhiệt độ và ánh sáng.
- Phương pháp: Thực hiện theo phương pháp thử độc cấp của Abraham
+ Số lượng chuột thí nghiệm: 42 con, được chia làm 7 lô, mỗi lô 6 con và bị bỏ đói hoàn toàn 16 giờ trước khi cho uống liều thử nghiệm
+ 6 lô chuột thử nghiệm ( từ lô 1- 6) được cho uống duy nhất một lần ở các nồng độ 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500 mg/kg thể trọng chuột
+ Lô 7 - lô chuột đối chứng uống nước cất
Thể tích tối đa với dạ dày chuột trong khoảng từ 1.5 – 2 ml/con
Sau khi cho chuột uống trong 1-2 giờ, chúng được nuôi dưỡng bình thường trở lại, được cho ăn uống tự do và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số lượng chuột chết trong từng lô, từ đó tính giá trị LD50 theo công thức đã quy định.
Công thức tính giá trị LD50
Trong đó: LD50: liều chết 50% động vật thí nghiệm ồ -
Số lượng chuột sử dụng trong từng lô mi được xác định bằng cách đếm số động vật chết trong vòng 72 giờ theo dõi Các thông số quan trọng bao gồm số lô chuột và khoảng cách giữa các mức liều.
Xk: L iều thuốc thấp nhất gây chết 100% động vật thí nghiệm
- Phương pháp pha mẫu thử