Xác định hàm lượng các axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng bắc trung bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

Đối tƣợng nghiên cứu

Nghiên cứu xác định hàm lượng axit amin trong các loài nấm tự nhiên được thu thập từ rừng Quốc gia Pù Mát và Phong Nha Kẻ Bàng, thuộc vùng Bắc Trung Bộ.

H1: Mẫu nấmPL1 H2: Mẫu nấm PL2 H3:Mẫu nấm TH

(Phellinus Pachyphloeus) ( Phellinus igniarius) (Phellinus nilgheriensis)

Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tổng quan về nấm, các axit amin và phương pháp định ượng axit amin

- Xác định các điều kiện tách và định ƣợng axit amin bằng HPLC

- Xây dựng đường chuẩn của các axit amin

- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định ượng (LOQ) của phương pháp

- Đánh giá thống kê phương pháp phân t ch

- Định ượng axit amin bằng phương pháp HPLC

TỔNG QUAN

Nấm

Giới nấm (Fungi) là nhóm sinh vật nhân chuẩn với thành tế bào làm từ kitin Chúng phát triển chủ yếu dưới dạng các sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae), tạo thành hệ sợi (mycelium), trong khi một số loại khác lại tồn tại ở dạng đơn bào Nấm sinh sản qua bào tử, được hình thành trên các cấu trúc đặc biệt hoặc thể quả Một số loài nấm đã mất khả năng tạo ra cấu trúc sinh sản đặc biệt và thực hiện sinh sản sinh dưỡng.

Nấm là thuật ngữ bao quát tất cả các loại nấm lớn, có thể bao gồm cả những loại nấm ăn được và có giá trị chữa bệnh Theo định nghĩa của Chang và Miles (1992), nấm là những quả thể lớn, dễ thấy bằng mắt thường và có thể thu hoạch bằng tay, không nhất thiết phải là nấm đảm hay có thịt Nấm có thể thuộc lớp nấm túi hoặc nấm nang, không chỉ giới hạn ở những loại có giá trị dinh dưỡng Định nghĩa này, mặc dù không hoàn hảo, vẫn hữu ích để đánh giá sự đa dạng của nấm trên thế giới (Hawksworth, 2001) Tại Việt Nam, nấm đã được sử dụng từ lâu trong ẩm thực và y học Nhà bác học Lê Quý Đôn (1726 - 1784) đã nhấn mạnh giá trị của nấm Linh chi trong tác phẩm của ông, coi đây là sản vật quý hiếm với nhiều tác dụng như bảo vệ gan, cải thiện sức khỏe tim mạch, hỗ trợ tiêu hóa, và tăng cường tuổi thọ.

Nấm có nhiều ứng dụng trong đời sống và sản xuất, đặc biệt trong công nghệ thực phẩm, như làm thức ăn và trong quá trình lên men Ngoài ra, nấm còn được sử dụng làm chất kháng sinh, hormone trong y học và nhiều loại enzyme Tuy nhiên, một số loại nấm chứa mycotoxin, như ancaloit và polyketid, có thể gây độc cho động vật và con người Một số loại nấm cũng được sử dụng trong các nghi lễ truyền thống để tác động đến trí tuệ và hành vi con người Đồng thời, một số loại nấm có thể gây bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, ảnh hưởng đến an ninh lương thực và kinh tế.

Nấm là một nhóm sinh vật độc đáo với khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã được mô tả 69.000 loài (Hawksworth, 1991) Chúng tồn tại khắp nơi trên Trái Đất, từ hốc tường đến thực vật, động vật và con người, bao gồm nấm men, nấm mốc và các loại nấm lớn Nấm thuộc nhóm eukaryote, có vách tế bào chứa chitin, chất béo và protein Không có chất diệp lục, nấm không thể quang hợp và phải hấp thu dinh dưỡng từ các nguồn khác Chúng sinh sản bằng cả phương pháp hữu tính và vô tính, với cấu trúc sinh dưỡng chủ yếu là sợi nấm phân nhánh.

Năm 1969 nhà khoa học người Mỹ R.H Whittaker[25]đã đưa ra hệ thống phân loại sinh vật thành năm giới sau đây:

- Giới khởi sinh: Bao gồm vi khuẩn và tảo lam

- Giới nguyên sinh: Bao gồm một số oài đơn bào, một số nấm đơn bào có roi và nhóm các động vật nguyên sinh

1.1.3 Đặc điểm dinh dƣỡng của nấm

1.1.3.1 Chất khô, giá trị năng lượng

Hàm lượng chất khô trong nấm tươi rất thấp, thường chỉ từ 60-140g/kg, chủ yếu bao gồm carbohydrate, protein, chất xơ và khoáng chất Thông thường, hàm lượng chất khô 100 g/kg được sử dụng để tính toán khi giá trị thực tế không rõ ràng Hàm lượng nước cao trong nấm ảnh hưởng đến kết cấu và góp phần vào tuổi thọ ngắn của quả thể.

Low lipid and dry matter content contribute to the low energy values of mushrooms Reported energy values for species such as A bisporus, Lactarius deliciosus, Leucopaxillus giganteus, Sarcodon imbricatus, and T portentosum are 86.4, 165, 126, 101, and 112 kJ/100g of fresh mushrooms (Barros et al., 2007a) Additionally, energy values of 118, 87.3, 131, and 159 kJ have been found for Cantharellus cibarius, L nuda, Lycoperdon perlatum, and Ramaria botrytis (Barros, Venturini, Baptista, Estevinho, & Ferreira, 2008).

Theo nghiên cứu của Ses i và Da man (2007), loài A rubescens có giá trị năng lượng là 155 kJ, trong khi loài L Nuda đạt 259 kJ Điều này cho thấy nấm là một nguồn thực phẩm có giá trị năng lượng thấp.

Nấm là nguồn protein phong phú và có giá trị dinh dưỡng cao Hàm lượng protein trong nấm được đánh giá là vượt trội hơn so với protein từ thực vật, theo nghiên cứu của FAO (1991).

Sự phát triển của nấm không chỉ bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và các giai đoạn trưởng thành của quả thể, mà còn phụ thuộc vào sự đa dạng của các loài khác nhau (Colak, Faiz, & Sesli, 2009).

Hàm lượng protein trong bốn loài nấm ăn phổ biến gồm agaricus bisporus (nấm mỡ), lentinula edodes (nấm hương), pleurotus spp (nấm sò) và volvariella volvacea (nấm rơm) đã được công bố, với tỷ lệ chiếm từ 1,75-3,63% trọng lượng tươi của nấm Đặc biệt, hàm lượng protein trong nấm hoang thường cao gấp hai lần so với măng tây và cải bắp, và gấp bốn lần so với các loại rau củ khác.

Nấm chứa từ 19-35% protein khô, cao hơn so với gạo (7,3%) và mì (13,2%), nhưng thấp hơn so với đậu tương (39,1%) và sữa (25,2%) Mặc dù hàm lượng protein thô của nấm không đạt mức của hầu hết các loại thịt động vật, nó vẫn vượt trội hơn so với nhiều thực phẩm khác, bao gồm cả sữa.

Hàm ƣợng protein thô trong các loài nấm khác nhau cũng đƣợc báo cáo bởi

Theo nghiên cứu của Bauer-pettrovska (2001), hàm lượng protein thô trung bình của 47 loài nấm hoang ở Hy Lạp đạt 32,6% chất khô Loài nấm có hàm lượng protein cao nhất là Calocybe gambosa và Macrolepiota mastoidea với mức 48,8% và 51,2% chất khô, trong khi loài C Cibarius có hàm lượng thấp nhất chỉ đạt 16,2% chất khô.

Hàm lượng protein trong chất khô của nấm gần như không thay đổi khi sấy khô ở 40°C hoặc làm lạnh đến -20°C; tuy nhiên, việc đun sôi nấm tươi dẫn đến sự giảm đáng kể hàm lượng protein (Barros, Baptista, Correia, Morais, & Ferreira, 2007b).

Trong nghiên cứu của Chang và Miles, nấm được xếp hạng theo axit amin thiết yếu, với điểm số gần 100, chỉ dưới thịt và cao hơn rau bina Nấm chứa hầu như đầy đủ các loại axit amin, bao gồm 8 loại cần thiết cho con người Thành phần axit amin trong nấm tương đương hoặc cao hơn so với protein đậu nành, và một số loài nấm thậm chí có thành phần gần giống như trứng gà (Yin và Zhou 2008).

Theo FAO/WHO, nấm chứa nhiều axit glutamic, axit aspartic và arginine, nhưng lại thiếu methionine và cysteine L edodes, P ostreatus và P eryngii có hạn chế về leucine và lysine Đặc biệt, nấm cũng chứa hai axit amin không phổ biến là axit γ-amino butyric và ornithine, có vai trò sinh học quan trọng Mặc dù hàm lượng axit amin tự do trong nấm chỉ khoảng 1% khối lượng, chúng vẫn góp phần vào hương vị của nấm, với axit glutamic và alanine là phổ biến trong T portentosum và T terreum (Díez & Alvarez, 2001).

Axit amin

1.1.2 Định nghĩa và cấu trúc

Axit amin (amino axit) là hợp chất hữu cơ tạp chức, chứa đồng thời nhóm amin (NH2) và nhóm cacboxyl (COOH) Trong hóa sinh, thuật ngữ này thường chỉ alpha axit amin, tức là các axit amin mà nhóm amin và nhóm cacboxyl gắn vào cùng một nguyên tử cacbon, được gọi là α–cacbon.

Nhóm COOH trong axit amin có tính axit, trong khi nhóm NH2 mang tính bazơ, dẫn đến việc axit amin ở trạng thái kết tinh tồn tại dưới dạng ion lưỡng cực Trong dung dịch, một phần nhỏ của dạng ion lưỡng cực này sẽ chuyển thành dạng phân tử.

Dạng phân t dạng ion ƣỡng cực

Tất cả các axit amin đều có ít nhất hai nhóm ion hóa, và điện tích chuẩn của chúng phụ thuộc vào giá trị pH Nhóm COOH của nguyên tử Cα có pKa khoảng 1,8 – 2,8, cho thấy độ axit mạnh hơn so với các axit monocacboxylic thông thường khác.

NH 2 ở nguyên t Cα cũng thay đổi, pk a vào khoảng 8,8 – 10,6 tùy thuộc vào từng axit amin

Trong tự nhiên, axit amin chủ yếu tồn tại dưới dạng α-axit amin, với bốn phần khác nhau có khả năng thay thế tại vị trí C-2 (C α) Do C α không có trung tâm đối xứng, các axit amin có đồng phân quang học là L- và D-axit amin, ngoại trừ glycin không có đồng phân quang học (R = H) Hầu hết axit amin tự nhiên là L-axit amin, trong khi D-axit amin chỉ được tìm thấy trong vi khuẩn và vách tế bào vi khuẩn.

Bảng 2.1: Cấu trúc của 20 axit amin tiêu chuẩn

L-Alanin L-Arginin L-Asparagin Axit L-Aspartic L-Cystin

L-Histidin L-Glutamin L-Glycin Axit L-Glutamic L-isoleucin

L-Serin L-Thrionin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin

Trong tự nhiên, có hơn 100 axit amin, trong đó 20 loại được mã hóa bởi mã di truyền chuẩn, gọi là axit amin proteinogenic Sự kết hợp của các axit amin tiêu chuẩn này tạo ra protein thiết yếu cho cấu trúc cơ thể người Axit amin là đơn vị cấu trúc cơ bản xây dựng nên các khối protein.

Có nhiều cách để phân loại axit amin: các axit amin có thể phân loại theo hai quan điểm: Quan điểm hoá học và quan điểm sinh vật học

 Quan điểm hoá học : ( Xét về mặt cấu tạo phân tử và các hoá tính)

Có thể phân loại dựa vào cấu trúc của mạch bên (nhóm R):

Nhóm axit amin kị nước (Hydrophobic) bao gồm glycin, alanin, valin, leucin và isoleucin, trong đó tất cả đều có mạch bên là ankyl, ngoại trừ glycin có mạch bên là nguyên tử hidro Mạch bên của các axit amin này không phân cực, do đó chúng có tính kị nước Các axit amin thuộc nhóm này được gọi là axit amin kị nước.

Nhóm ưa nước (Hydrophilic) bao gồm các axit amin serin và threonin, đặc trưng bởi sự hiện diện của nhóm hydroxyl ở mạch bên Các nhóm hydroxyl này mang tính phân cực và có khả năng hình thành liên kết hydro, do đó, serin và threonin được coi là những axit amin ưa nước.

Nhóm chứa lưu huỳnh bao gồm cystein và methionin Trong điều kiện thích hợp, axit amin cystein có thể liên kết với một phân tử cystein khác qua mạch bên, tạo ra cầu disunfua giữa hai nguyên tử lưu huỳnh Phân tử mới hình thành được gọi là cystin Khả năng của cystein trong việc tạo cầu disunfua có vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc của một số protein.

- Nhóm axit cacboxylic: nhóm này bao gồm các axit amino có một nhóm axit cacboxylic thứ hai nhƣ à một phần của mạch bên, gồm axit aspartic và axit glutamic

Do tính axit của nhóm axit cacboxylic, các axit amin không chỉ phân cực mà còn có khả năng trở thành điện âm Trong dung dịch, các proton axit được chuyển cho một phân tử nước, tạo ra ion carboxylat mang điện tích âm.

Nhóm amit bao gồm hai axit amin tương tự như nhóm trước, nhưng với mạch bên chứa nhóm amit -CONH2 thay vì nhóm axit cacboxylic Các amit được hình thành từ axit glutamic được gọi là glutamin, trong khi các amit từ axit aspartic được gọi là asparagin.

Nhóm amin bao gồm ba axit amin: lysin, arginin và histidin, có chứa một hoặc nhiều nhóm amin trong mạch bên Những axit amin này được coi là axit amin bazơ vì các nhóm amin có khả năng nhận proton, trở nên mang điện tích dương khi hòa tan trong dung dịch.

Nhóm thơm bao gồm ba axit amin có cấu trúc vòng thơm: phenylalanin, tyrosin và tryptophan Tyrosin có nhóm hydroxyl, khiến nó trở thành phân cực, trong khi tryptophan và phenylalanin lại không phân cực, mặc dù tryptophan chứa nitơ trong vòng của nó Sự không phân cực của tryptophan và phenylalanin được giải thích bởi kích thước lớn của các vòng kết hợp.

Nhóm imido là dạng axit amin cuối cùng, prolin, có đặc điểm độc đáo là mạch bên uốn cong để tạo thành một vòng thông qua liên kết với nhóm amin Thực tế, phân tử này được coi là một axit imido hơn là một axit amin.

 Quan điểm sinh vật học

Dựa trên sự tăng trưởng và cân bằng nitơ, các axit amin được phân loại thành hai nhóm: chất dinh dưỡng thiết yếu và không thiết yếu cho con người và động vật.

Axit amin thiết yếu (EAA) là những axit amin không thể tổng hợp bởi cơ thể và cần được cung cấp qua chế độ ăn uống Trong số 20 axit amin tiêu chuẩn, có chín axit amin thiết yếu bao gồm: valin, leucin, isoleucin, lysin, threonin, methionin, histidin, phenylalanin và tryptophan Đặc biệt, histidin là axit amin thiết yếu đối với trẻ em.

Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin

1.3.1 Các phương pháp sắc ký cổ điển

1.3.1.1 Phương pháp sắc ký bản mỏng

Phương pháp sắc ký bản mỏng được triển khai bởi Bailey, J, L rất d thực hiện

Phương pháp sắc ký bản mỏng được sử dụng để xác định axit amin, như được nghiên cứu bởi Phạm Văn Sổ và Bùi Thị Như Thuận (1978) với việc sử dụng pyriđin làm dung môi Sau khi tách các axit amin, hàm lượng của chúng được tính dựa vào chiều cao và diện tích vết mẫu so với mẫu chuẩn Mặc dù phương pháp này có khả năng tách tốt, nhưng sử dụng dung môi độc hại và độ chính xác không cao Hiện nay, với sự phát triển của các phương pháp sắc ký hiện đại, việc tách và xác định axit amin đã không còn áp dụng sắc ký lớp mỏng nữa.

1.3.1.2 Phương pháp sắc ký cột

Phương pháp sắc ký cột là một kỹ thuật sắc ký cơ bản và đơn giản, đóng vai trò nền tảng cho sự phát triển của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau này.

Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất ninhydrin đã được Moore và Stein áp dụng để xác định axit amin từ những năm 1940 Kể từ đó, nhiều tác giả đã cải tiến và ứng dụng phương pháp này trong việc xác định axit amin ở nhiều đối tượng khác nhau.

Nguyên lý cơ bản để tách axit amin là sử dụng cột trao đổi ion, sau đó phản ứng với ninhydrin để tạo phức chất màu vàng, cho phép đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 440 nm và 570 nm, với giới hạn phát hiện đạt 10 pM cho hầu hết các axit amin và 50 pM cho prolin Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã phát triển mạnh mẽ, sắc ký cột với dẫn xuất ninhydrin vẫn được áp dụng nhờ vào thiết bị giá rẻ và tiện lợi cho phân tích lượng lớn Một phương pháp khác là sử dụng o-phthalaldehyd (OPA) làm dẫn xuất, cho phép tách và xác định đồng thời các axit amin bậc 1 với giới hạn phát hiện lên tới 20 pM, tuy nhiên OPA không phản ứng với các axit amin bậc 2.

Phương pháp tách sắc ký cột cổ điển là một kỹ thuật đơn giản, phù hợp với mọi phòng thí nghiệm Tuy nhiên, do thời gian tách lâu và hiệu quả tách không cao so với các phương pháp hiện đại, nó chỉ được sử dụng cho các mẫu tách đơn giản.

1.3.1.3 Phương pháp chuẩn độ điện thế

Phương pháp này bao gồm việc xử lý mẫu để tách các axit amin khỏi nền mẫu và loại bỏ các chất gây ảnh hưởng Sau đó, các axit amin sẽ được tách biệt trên cột sắc ký với kích thước 500.

Sử dụng cột Dovvex 50W-X8 (dạng H+) với kích thước 22 mm và 30 ml, các amino acid Ser, Thr, Asp được rửa giải bằng HCl 0,8M với tốc độ dòng 0,5 m/phút Sau khi HCl 0,8M rời khỏi cột, thêm HCl 1M và điều chỉnh tốc độ dòng đến 25-30 giọt/phút để rửa giải Glu và Gly Các phần dịch rửa giải được thu vào cốc thuỷ tinh và điều chỉnh pH=7 bằng NaOH 0,1M Dung dịch HCHO 37% cũng được điều chỉnh về pH=7 với NaOH 0,1M Sau đó, mẫu thí nghiệm và dung dịch HCHO được trộn theo tỷ lệ 1:9 bằng máy khuấy trong 10 phút Cuối cùng, hỗn hợp được chuẩn độ bằng phương pháp đo điện thế với NaOH 0,1M, trong khi mẫu trắng được chuẩn độ tới pH=8,9 với hỗn hợp HCHO và HCl 1M (1:9) đã trung hòa tới pH=7.

Từ ƣợng NaOH 0,1 M tiêu tốn để chuẩn độ mẫu th và mẫu trắng t nh ra đƣợc hàm ƣợng các axit amin bằng bảng quy đổi

1.3.2 Phương pháp sắc ký khí

Sắc ký khí (Gas chromatography - GC) là một phương pháp tiên tiến được sử dụng để tách và phân tích đồng thời các thành phần trong hỗn hợp mẫu ở trạng thái khí Kỹ thuật này đã phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây, cho phép xác định và định lượng các chất hữu cơ trong các hỗn hợp mẫu phức tạp.

Tác giả Y C Fiamegos và C D Staikas đã phát hiện 19 axit amin trong nước tiểu, nước hoa quả và bột mì bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp với detector khối phổ (GC/MS) và detector ion hóa ngọn lửa (GC/FID) Các axit amin tự do được chuyển đổi thành pentaflorobenzyl nhờ xúc tác tetrabutylamoni bromua, sau đó được chiết xuất bằng diclorometan và phân tích bằng GC/MS và GC/FID Đối với các axit amin liên kết với protein, chúng được phân tích sau khi thủy phân bằng NaOH 5M Phương pháp này có giới hạn phát hiện từ 0,7 - 2,3 pM với GC/MS và từ 1,7 - 6,9 pM với GC/FID.

Phương pháp sắc ký khí là một kỹ thuật tách hiện đại, được nhiều tác giả trên thế giới ứng dụng để phân tích axit amin trong các đối tượng khác nhau Tuy nhiên, việc áp dụng phân tích axit amin thường gặp khó khăn do tính chất không bay hơi và độ tan kém trong dung môi hữu cơ của chúng, dẫn đến quy trình phức tạp và tiêu tốn nhiều dung môi Hơn nữa, khí mang Heli có chi phí cao, khiến cho sắc ký khí không được sử dụng rộng rãi trong việc tách và xác định axit amin.

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao, hay còn gọi là điện di mao quản thế cao, là một kỹ thuật tiên tiến dùng để tách biệt và xác định đồng thời các thành phần trong một hỗn hợp mẫu.

Nguyên lý của sự điện di là quá trình di chuyển của các chất trong ống mao quản nhỏ chứa dung dịch đệm điện di với pH xác định, được điều khiển bởi cường độ điện trường.

Khi áp dụng nguồn điện thế cao một chiều từ 14-30 KV vào hai đầu mao quản, phương pháp này cho phép tách biệt các chất, bao gồm cả ion và các chất không ion có liên quan chặt chẽ với ion trong ống mao quản hẹp Nhờ vào sự khác biệt về điện tích và linh độ điện di của các chất, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau, dẫn đến quá trình tách rời hiệu quả.

M Umrnadi, B C Weimer đã phát triển phương pháp điện di mao quản huỳnh quang laze (CE-LIF) để phát hiện và định ƣợng 17 axit amin tại nồng độ mM, các axit amin được dẫn xuất với 3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinolin-carboxa dehyd trước khi phân tích bằng CE-LIF M i trường tách là hệ đệm chứa: borat 6,25 mM, SDS 150 mM, và THF 10 mM (pH = 9,66) tại 25°C, điện thế 24 kV Độ biến động của phương pháp trong giới hạn từ 0,3 – 0,9% trong một ngày và từ 0,7 – 1,5% giữa các ngày Các tác giả đã ứng dụng phương pháp này để theo dõi sự thay đổi nồng độ axit amin trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) đã trở thành một kỹ thuật hiện đại và phát triển mạnh mẽ từ những năm 80, 90, được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực sinh hóa, hóa học, môi trường, đặc biệt là trong phân tích vitamin và axit amin Nhiều nghiên cứu đã công bố quy trình tách và xác định axit amin, với HPLC là phương pháp phổ biến nhất Sau khi thủy phân, các axit amin sẽ được dẫn xuất để tạo ra sản phẩm phát huỳnh quang, sau đó được tách bằng hệ thống HPLC và phát hiện bằng detector huỳnh quang (RF) Nghiên cứu của tác giả L Bosch và cộng sự đã tách và định lượng 17 axit amin trong thức ăn trẻ em bằng tác nhân dẫn xuất AQC, với quy trình thủy phân trong môi trường khô và dẫn xuất trong môi trường bazơ Các dẫn xuất được tách trên cột Nova-Pak™ và phát hiện với độ nhạy cao, cho kết quả chính xác và hiệu suất thu hồi cao, với giới hạn phát hiện từ 0,016 đến 0,367 mM.

PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM