Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong đồ án này, chúng tôi có các nhiệm vụ:
- Tuyển chọn chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cellulase cao
Nghiên cứu này tập trung vào việc lựa chọn môi trường và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase từ chủng Bacillus G4, nhằm tối ưu hóa hoạt tính enzym cellulase Việc xác định các điều kiện phù hợp sẽ giúp nâng cao hiệu suất sản xuất cellulase, đáp ứng nhu cầu trong các ứng dụng công nghiệp.
Vật liệu, phạm vi và nội dung nghiên cứu
Mối được thu thập tại Nghệ An, và các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối hiện đang được bảo quản tại phòng Thí nghiệm khoa Hóa học, trường Đại học Vinh.
Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ thực phẩm, khoa Hóa học, trường Đại học Vinh trong thời gian từ tháng 10/ 2015 đến tháng 5/2016
3.3 Nội dung nghiên cứu Đề tài đƣợc tiến hành với nội dung nhƣ sau:
- Tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp cellulase có hoạt lực cao để tiến hành những nghiên cứu tiếp theo
- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp cellulase từ chủng G 4
+ Lựa chọn môi trường thích hợp
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của pH
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cám gạo
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau
Từ các nghiên cứu rút ra các điều kiện tối ƣu nhằm ứng dụng nó trong quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase một cách có hiệu quả nhất
Đề tài này mang lại ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng cho nghiên cứu sâu hơn về enzym cellulase từ ruột mối Kết quả nghiên cứu sẽ không chỉ bổ sung cho các nghiên cứu trước đó về ruột mối mà còn tạo nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này.
Kết quả nghiên cứu cung cấp nguồn tham khảo quý giá cho các nghiên cứu về ứng dụng cụ thể của enzym cellulase từ nguồn mới, nhằm áp dụng vào sản xuất và đời sống Điều này không chỉ giúp giảm giá thành chế phẩm mà còn nâng cao hiệu quả sử dụng của enzym trong các lĩnh vực khác nhau.
TỔNG QUAN
Tổng quan về loài mối
1.1.1 Giới thiệu sơ lược về mối
Mối là côn trùng thuộc họ gián, nổi bật với tập tính xã hội cao và thường sinh sống ở vùng nhiệt đới Chúng sống theo bầy đàn, có khả năng sinh sản và phân đàn mạnh mẽ Thức ăn chính của mối chủ yếu là mùn gỗ.
Cơ thể mối được chia thành ba phần chính: đầu, ngực và bụng, với ranh giới rõ rệt giữa chúng Các phần này liên kết với nhau bằng các tấm màng đệm Cấu trúc cơ thể của mối được tạo thành từ cutin, mang lại độ rắn chắc nhưng vẫn rất mềm dẻo ở các phần giữa các đốt và các phần phụ, cho phép chúng di chuyển linh hoạt.
Phân lớp (subclass): Pterygota Phân lớp thứ (infraclass): Neoptera Liên bộ (superordo): Dictyoptera
Bộ Isoptera, hay còn gọi là mối, có hơn 2700 loài trên toàn thế giới và Việt Nam đã ghi nhận 106 loài Một số nhóm mối gây hại phổ biến ở nước ta bao gồm Coptotermes.
Odototermes, Macrotermes, Microtermes, Hypotermes, Cryptotermes
Tập đoàn mối hoạt động theo phương thức tự tổ chức và phân quyền, tận dụng trí thông minh bầy đàn để tối ưu hóa việc khai thác nguồn thức ăn và môi trường sống Một tập đoàn mối điển hình bao gồm các thành viên như mối vua, mối chúa, mối thợ, mối lính và mối cánh.
1.1.2 Đẳng cấp loại hình của mối
Mối là một loài côn trùng đa hình thái với các đẳng cấp xã hội gồm mối sinh sản (mối vua, mối chúa), mối lao động (mối lính và mối thợ) và mối non Tùy thuộc vào từng nhóm loài, sự biệt hóa trong các đẳng cấp, đặc biệt ở mối lao động, sẽ diễn ra khác nhau Trong quần thể mối Macrotermes, ngoài đẳng cấp sinh sản và mối non, mối lao động được chia thành các loại như mối thợ lớn, mối thợ nhỏ, mối lính lớn và mối lính nhỏ (Nguyễn Văn Quảng, 2003).
1.1.3 Vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối
Vi khuẩn trong ruột mối có khả năng tiêu hóa lên đến 74,99% cellulose, 65,87% hemicellulose và lignocellulose Những vi sinh vật này phối hợp để thủy phân cellulose từng mắt xích, tạo ra các cấu trúc đơn giản qua chuỗi chuyển hóa.
Vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối tiêu biểu thuộc các dòng Clostridium sp.,
Bacillus sp., Strepromyces sp., Trichonympha sp., Actinomycetables sp., Seratia sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).,
Hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa cellulose, với khoảng 200 loài vi khuẩn khác nhau được phát hiện Các nghiên cứu cho thấy trong ruột mối có sự hiện diện của các chủng Gram dương như Bacillus, Paenibacillus, Streptomyces và nhóm Actinobacteria, cùng với các chủng Gram âm thuộc chi Pseudomonas, Acinetobacter và Ochrobactrum.
Khái quát về enzym
Enzym là chất xúc tác sinh học, chủ yếu được cấu tạo từ protein, có khả năng hòa tan trong nước và dung dịch muối loãng Với phân tử lượng dao động từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, enzym không thể vượt qua màng bán thấm.
- Tất cả các yếu tố làm biến tính protein nhƣ axit đặc, muối kim loại nặng đều có thể làm biến tính enzym và mất hoạt tính xúc tác
- Enzym có nhiều tính chất ƣu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học
- Enzym có cường lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu cao, tác dụng trong điều kiện êm dịu
- Enzym là chất xúc tác có nguồn gốc từ tự nhiên, là chế phẩm đƣợc sản xuất từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm [4]
Enzym là các chất không thể tổng hợp bằng hóa học, mà được chiết xuất từ tế bào của động vật, thực vật và vi sinh vật.
Hàng năm, enzym được sử dụng trong công nghiệp chủ yếu được sản xuất từ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn, chiếm tới 88% tổng sản lượng Trong khi đó, chỉ có 8% enzym được chiết xuất từ động vật và 4% từ thực vật.
Một số mô động vật chứa nhiều enzym nhƣ: dạ dày, tụy tạng, tim, gan, lá lách
- Tụy tạng: là cơ quan chứa nhiều enzym nhất bao gồm amylase, lipase, pectinase, cholesterol esterase, nuclease, trypsin, chymotripsin, cacboxy peptidase
The stomachs of pigs, dogs, chickens, and rabbits contain a mucous membrane rich in pepsin and various other proteases Additionally, the stomachs of young ruminants, such as calves and lambs, are notable for containing rennin.
- Ruột: trong dịch chiết của dịch ruột của động vật có các enzym lactase, maltase, sacharase, phosphatase
- Gan: là cơ quan chứa nhiều enzym trong đó có một số enzym chỉ có ở gan mới có
Tuyến nước bọt không chỉ chứa các enzym tiêu hóa như amylase và maitase, mà còn có enzym tác động lên globulin α-2-kali-dinogen, giúp giải phóng kalidin Kalidin là một decapeptit có khả năng kích thích tăng tiết nước bọt.
Huyết thanh chứa nhiều enzym, với hoạt độ bình thường không cao Một số enzym trong huyết thanh được xem là chỉ thị quan trọng để theo dõi tình trạng bệnh tật.
+ Amylase tăng khi viêm tụy cấp
+ Phosphattase kiềm tăng khi bị còi xương, tắc mật
+ Transamine tăng khi viêm gan, nhồi máu cơ tim
Mọi cơ quan động vật đều chứa enzym, nhưng thường chỉ có pepsin được chiết xuất từ dạ dày lợn, renin từ dạ dày bê, và pancreatin từ tụy tạng.
Từ thực vật thƣợng đẳng có thể thu đƣợc một số enzym thủy phân:
- Papain từ nhựa đu đủ
- Bromedin từ thân, lá dứa và vỏ dứa
Papain và Bromedin có tác dụng giống nhau: làm mềm thịt, đẩy nhanh quá trình thủy phân protein và phá độ đục của protein trong sản xuất bia
- Các enzym plazim, papain, fixin thường có trong họ Ficus như sung, si và có trong cả quả lá và thân cây
- Các α, β có trong malt đại mạch và hạt thóc nảy mầm
- Urease có trong giá đậu tương lipase trong mầm hạt thầu dầu
- Polyphenoloxydase có trong lá chè, chuyển hóa hợp chất polyphenol thành kinol tương ứng có màu sắc đặc trưng của chè
- Peroxydase tác dụng với tanin tạo thành sản phẩm ngƣng tự không màu
Lá chè chứa các enzym như protease, pectinase, amylase và invertase, những enzym này đóng vai trò quan trọng trong quá trình chế biến chè Chúng giúp biến đổi các cơ chất trong lá chè, từ đó tạo ra những chất mới, góp phần nâng cao chất lượng chè về màu sắc và hương thơm.
Tuy nhiên ở thực vật người ta thu chế phẩm papain từ nhựa đu đủ và bromelin từ lá dứa và vỏ dứa
1.2.2.3 Enzym từ vi sinh vật
Enzym là nguồn tài nguyên phong phú từ nhiều loại vi sinh vật, cho phép thu được đa dạng các loại enzym khác nhau Đặc biệt, một số enzym này không thể được tổng hợp bởi cơ thể động vật và thực vật.
Hệ enzym vi sinh vật có thể được điều chỉnh thông qua việc thay đổi điều kiện nuôi cấy và sử dụng các tác nhân điều chỉnh, cho phép một loài vi sinh vật tổng hợp mạnh mẽ một hoặc nhiều loại enzym theo nhu cầu.
Vi sinh vật có khả năng sinh sản và phát triển nhanh chóng, đồng thời tổng hợp enzym với tốc độ cực kỳ lớn Điều này cho phép thu được một lượng lớn enzym trong thời gian ngắn một cách dễ dàng.
- Enzym vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh vƣợt xa enzym từ các nguồn khác.
Enzym cellulase
Enzym cellulase đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa chất hữu cơ tự nhiên, có ý nghĩa lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm và bảo vệ môi trường.
Cellulase là một hệ enzym phức tạp, đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm hòa tan Enzym này hoạt động như một enzym cảm ứng, mặc dù không phải là chất cảm ứng chặt chẽ Đồng thời, cellulase cũng bị ảnh hưởng bởi cơ chế điều khiển từ sản phẩm cuối cùng và được kiểm soát bởi cơ chế ức chế dị hóa.
Cellulase là một homopolime của β-D-glucose, với các liên kết β-D-1,4-glucan nối các góc β-D-glucose lại với nhau Hệ thống enzym thuỷ phân cellulase bao gồm ít nhất ba loại enzym: Endoglucanase (EC.3.2.1.4), Exoglucanase (EC3.2.1.91) và β-glucosidase (EC3.2.1.21) Mỗi enzym có tính đặc hiệu khác nhau và hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình phân hủy cellulose Đầu tiên, Exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-β-D-glucosid trong phân tử cellulose, sau đó Endoglucanase tiếp tục thuỷ phân cellulose thành phân tử cellobiose.
-glucosidase phân cắt Cellulobiose thành glucose
Cellulase là một loại protein được hình thành từ các đơn vị acid amin liên kết với nhau qua liên kết peptid -CO-NH- Cấu trúc không gian của cellulase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian, trong đó đuôi này có phần glycosil hoá và vùng gắn kết với cellulose Vùng gắn kết này có cấu trúc khác biệt so với liên kết thông thường -CO-NH- của protein, và sự thay đổi chiều dài của vùng glycosil hoá có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.
Trọng lượng của enzym Cellulase dao động từ 30-110 kDa (Beguin, 1990; cộng sự 1991), với cấu trúc không gian từ 280-600 amino acid, trong khi chiều dài phổ biến của Cellulase thường nằm trong khoảng 300-450 amino acid (Gillees và cộng sự 1992) Trung tâm xúc tác của enzym này có khoảng 250 amino acid.
Hệ enzym Cellulase phân giải Cellulase thành glucose bằng cách bẽ gãy các liên kết β-1,4 glucan, trong đó enzym chính tham gia vào quá trình này là Exoglucanase.
Exoglucanase là enzym có cấu trúc gồm hai vùng xúc tác và một vùng gắn cellulose với glycosin hóa cao Enzym này bao gồm hai chuỗi, chuỗi A và chuỗi B, mỗi chuỗi chứa 434 gốc, nhưng chúng có sự khác biệt để phân biệt.
Các xoắn β không song song tạo ra một bề mặt chung, hình thành một thể tích lớn được bao bọc bởi các chuỗi kỵ nước, cùng với một phần nhỏ ưa nước.
Hai bản xoắn β không song song chụm vào nhau tạo thành một kẹp β (β sandwich) Các vòng ngắn còn lại được cố định bởi các cầu disulfide, nối các sợi β với nhau và có sự hiện diện của các bon xoắn α trong cấu trúc.
Có 1 nguyên tử Ca 2+ ở cả hai chuỗi A và B của Cellulase và ở mỗi chuỗi nó kết hợp với glu 295 và glu 325, một phần tử nước được gắn vào Ca 2 +
Hình 1.3 Cấu trúc không gian ba chiều của enzym cellulase
According to the classification by the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), the cellulose hydrolysis system comprises three key enzymes: Endoglucanase (EC 3.2.1.4), Exoglucanase (EC 3.2.1.91), and β-glucosidase (EC 3.2.1.21).
Enzym này thường thuỷ phân các liên kết 1,4- -D-glucosid trong Cellulose và các β-D-glucan của ngũ cốc
Enzym này có tác dụng thuỷ phân các liên kết 1,4- β-D-glucosid trong Cellulose và Cellotetraose giải phóng Cellobiose từ dầu không khử
Enzym này thuỷ phân các gốc β-D-glucosid Một số trường hợp cũng thuỷ phân β- D-galactosidase, β-D-fucoside; β-D-Xyloside; α-L-Arabinoside
1.3.4 Đặc tính vật lý và hóa học
Quá trình thuỷ phân cellulose tự nhiên diễn ra nhờ enzym trong một phức hệ cellulase, chủ yếu bao gồm các enzym Cj, Cx và β-glucosidase.
Nghiên cứu cho thấy hầu hết các loại cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần amino acid tương đồng, tuy nhiên độ bền nhiệt và tính đặc hiệu của chúng có thể khác nhau Ngoài hoạt tính cellulase, các chế phẩm cellulase thường chứa các hoạt động enzym khác, ảnh hưởng đến đặc tính của sản phẩm.
- pH tối ưu: Thường ở giữa 5-7
1.3.5 Cơ chế tác dụng của enzym cellulase
1.3.5.1 Cơ chế 1,4- -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)
Enzym này còn có tên gọi khác nhƣ: exoglucanase, exo- -1,4-glucanase, cellobiohydrolase, exo - cellobiohydrolase, exo- -1,4-glucan cellobiohydrolase,
1,4- -D-glucan cellobiosidase, cellobiosidase, CBH 1, C1 cellulase, avicelase Enzym này thủy phân liên kết 1,4- -D-glucoside từ đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành celllobiose
1.3.5.2 Cơ chế 1,4- -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)
Enzym này còn có tên gọi khác nhƣ: Endoglucanase, Endo-1,4- -D- glucanase, Endo-1,4 glucanase, -1,4-endoglucan hydrolase, Carboxymethyl cellulase, Celludextrinase, Cellulase A, Cellulosin AP, Alkali Cellulase, Avicelase, Pancellase SS
Enzym này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4- -D-glucoside giữa mạch của chuỗi cellulose, lichenin và các -D-glucan của ngũ cốc
1.3.5.3 Cơ chế -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)
Enzym này có tên gọi khác nhƣ là: - glucosidase, - D glucosidase, - 1,6 glucosidase, - glucoside glucohydrolase, -nitrophenyl glucosidase, aryl - - glucosidase, gentiobiase, cellobiase, emulsin, elaterase, arbutinase, amygdalinase, primeverosidase, amygdalase, limarase, salicilinase
Enzym này thủy phân gốc -D-glucoside không khử ở đầu tận cùng để phóng thích ra -D-glucose.
Cellulose
Khoảng một nửa hợp chất cacbon trong sinh khối trên mặt đất là cellulose, chiếm tới 30 - 50 % khối lượng sinh khối thực vật (Võ Văn Phước Quệ và cộng sự,
Cellulose, được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.10^9 tấn/năm, là một thành phần quan trọng trong cấu trúc thực vật Hằng năm, thực vật tổng hợp khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ thông qua quá trình quang hợp Hàm lượng cellulose không đồng đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật, với lượng cellulose thấp nhất ở lá và cao nhất ở thân cây Đặc biệt, trong sợi bông, cellulose chiếm từ 80-95% tổng trọng lượng (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2010).
Cellulose là polysaccharid chính trong màng tế bào thực vật, được cấu tạo từ các phân tử β-D-glucose liên kết với nhau qua liên kết β (1,4) glycosid Chất này không hòa tan trong nước, và khi thủy phân bằng axit mạnh, sản phẩm cuối cùng sẽ là glucose Nếu quá trình thủy phân diễn ra trong điều kiện nhẹ nhàng, sản phẩm thu được sẽ là disaccharid cellobiose.
Phân tử celulose có dạng hình sợi, liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và tạo thành từng nhóm gọi là mixel
Các dẫn xuất từ celulose đƣợc dùng trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ:
- Nitrocelulose: dùng làm chất nổ, sợi nhân tạo
- Axetylcelulose: dùng làm sợi nhân tạo
- Carboxymetyl celulose, dietyllaminoetyl- celulose: Dùng trao sắc khí, trao đổi ion
Một số dẫn xuất tan trong nước của cellulose như Natri carboxylmetyl cellulose (NaCMC), hydroxyetyl cellulose (HEC) và Metylcelulose (MC) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp NaCMC, một keo ưa nước, được sử dụng như chất ổn định trong tẩy rửa tổng hợp và nhũ tương HEC được dùng làm chất làm đặc trong sơn latex và để ngăn chặn sự mất nước trong xi măng pooclant MC, với vai trò tạo độ kết dính trong sản xuất gốm, còn được sử dụng như keo bảo vệ và chất ổn định trong sơn lót Ngoài ra, MC không độc hại cũng được áp dụng nhiều trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm.
Cellulose không cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể con người, nhưng lại đóng vai trò quan trọng trong tiêu hóa Dịch tiêu hóa của con người có enzym để cắt các liên kết β (1,4) glucosit, tuy nhiên, cellulose vẫn luôn có mặt trong khẩu phần ăn hàng ngày từ rau và trái cây Cellulose giúp cải thiện khả năng tiêu hóa bằng cách tăng cường lưu động ruột, đồng thời hỗ trợ ruột già trong việc đào thải chất thải và ngăn ngừa táo bón.
Hàng năm, quá trình quang hợp ở thực vật tổng hợp khoảng 230 tỷ tấn chất hữu cơ, trong đó có tối đa 70 tỷ tấn (30%) là xenluloza Xenluloza là một polyme tự nhiên được cấu tạo từ β-D-glucoza liên kết với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan Mức độ polyme hóa của xenluloza dao động từ 200 đến 15.000, với trọng lượng phân tử trung bình khoảng 3.000, nằm trong khoảng từ 5.000 đến 2.500.000.
Xenlluloza là một hợp chất tự nhiên bền vững, không tan trong nước và chỉ có thể trương phồng khi hấp thụ nước Hợp chất này sẽ bị phân hủy khi được đun nóng với kiềm hoặc axit, cũng như dưới tác động của các enzym thuộc nhóm xenlluloza.
Quá trình thủy phân xenluloza diễn ra nhờ hệ enzym, bao gồm các enzym C1, Cx và β-glucosidoza Enzym C1 có tính chất không đặc hiệu, giúp hấp thụ nước và làm trương lên xenluloza, chuẩn bị cho sự tác động của các enzym khác Tuy nhiên, khi tách riêng C1 để hoạt động độc lập, tác dụng này không được thể hiện rõ ràng.
Người ta cho rằng enzym β-1,4-glucanaza không phải là yếu tố chính của điểm Cx, mà có vai trò trong việc thủy phân các xenluloza ngậm nước (polyanhydroglucoza hydrat hóa) thành xenluloza Enzym này bao gồm nhiều thành phần khác nhau, thường được chia thành hai loại chính.
Exo-β-1,4-glucanaza và endo-β-1,4-glucanaza là hai loại enzyme quan trọng trong quá trình phân hủy xenluloza Exo-β-1,4-glucanaza xúc tác việc tách các đơn vị glucoza từ đầu không khử của chuỗi xenluloza, trong khi endo-β-1,4-glucanaza có khả năng cắt liên kết β-1,4-glucosid ở bất kỳ vị trí nào trong chuỗi xenluloza.
Xenlluloza là một polysacharit phức tạp và bền vững trong tự nhiên, nhưng nó cũng bị ảnh hưởng bởi enzym cellulase Enzym này thực hiện quá trình thủy phân liên kết 1,4 β-glucosit trong cellulose, tạo ra glucose, một nguyên liệu quan trọng cho ngành công nghiệp lên men.
Thu nhận cellulase từ vi sinh vật
1.5.1 Các nguồn thu nhận enzym
Nguồn thu nhận enzym celulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật trong đó nấm
Trichoderma là nguồn thu nhận của enzym cellulase quan trọng vì enzym có hoạt tính khá cao trong thời gian nuôi cấy
Quá trình phân giải cellulase bởi vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên Vi sinh vật, bao gồm nấm mốc, vi khuẩn và một số loại nấm men, là nguồn enzym phong phú nhất, cho thấy tiềm năng lớn trong việc sản xuất enzym quy mô lớn phục vụ cho công nghiệp và đời sống.
Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính sau:
+ Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật
+ Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn; từ 16-100h nên có thể thu hoạch nhiều lần quanh năm
+ Có thể điểu khiển sinh tổng hợp enzym dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)
Giá thành sản xuất chế phẩm enzym tương đối thấp nhờ vào môi trường sản xuất đơn giản và dễ tổ chức Quy trình này bao gồm việc phân lập các giống vi sinh vật tự nhiên hoặc các giống đột biến được chọn lọc để tối ưu hóa sản xuất một loại enzym cụ thể cần thiết.
Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose, nhưng chỉ một số ít có thể phân hủy hiệu quả cellulose tinh thể Các sinh vật phân hủy cellulose hiếu khí như vi khuẩn và nấm sản xuất một lượng lớn cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cấy, mặc dù cũng có sự hiện diện trên bề mặt tế bào Hầu hết các loài nấm có thể sử dụng cellulose làm nguồn dinh dưỡng cho sự phát triển Nhiều loài nấm nguyên thủy, như lớp nấm Chytridomycete kị khí, có khả năng thủy giải cellulose trong ruột động vật nhai lại, và khả năng này cũng xuất hiện ở nhiều loài nấm kị khí khác.
Trong số khoảng 700 loài nấm Zygomycete, chỉ một vài loài thuộc giống Mucor có khả năng thủy giải cellulose Ngược lại, các ngành nấm Ascomycete, Basidiomycete và Deuteromycete, mỗi ngành có hơn 15.000 loài, đều có khả năng thủy giải cellulose mạnh mẽ Nhiều giống nấm được nghiên cứu nhiều vì hoạt tính thủy giải cellulose và gỗ, bao gồm Chaetomium và Helotium (Ascomycete), Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllum và Serpula (Basidiomycete); cùng với Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium và Trichoderma (Deuteromycete).
Nhiều loại nấm sợi như Alternaria, Trichoderma, Aspergillus và Penicillium có khả năng sản xuất cellulase với số lượng lớn Cellulase là một loại enzym đa cấu trúc, bao gồm exoglucanase (C1), endoglucanase (Cx) và β-glucosidase, hoạt động cùng nhau để thủy phân cellulose thành glucose.
Phức hợp cellulase từ Trichoderma reesei có khả năng chuyển đổi hoàn toàn cellulose tự nhiên và các dẫn xuất của cellulose thành glucose Sự phát triển của nấm và sản xuất enzym cellulase chịu ảnh hưởng lớn từ các yếu tố môi trường như độ ẩm, pH, nhiệt độ, ánh sáng và không khí xung quanh.
Chủng Aspergillus fumigatus có khả năng sử dụng cellulose tinh thể như nguồn carbon duy nhất, đồng thời sản xuất nhiều loại cellulase ngoại bào Qua điện di trên gel polyacrylamide, đã xác định được 6 vạch có hoạt tính endoglucanase Hoạt tính CMCase đạt tối ưu ở 65°C và pH 2, cho thấy loài vi sinh vật này là một sản phẩm endoglucanase ưa nhiệt và acid.
Vi khuẩn và xạ khuẩn
Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose được phát hiện ở hai bộ chính: Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí Dựa vào các đặc điểm sinh lý, vi khuẩn thủy giải cellulose được phân loại thành những nhóm sinh lý đặc trưng.
Các loại vi sinh vật phân giải Cellulase là:
- Vi sinh vật háo khí:
+ Niêm vi khuẩn: Cytophaga, Sporocytophaga, cellulomonas
+ Vi khuẩn: Các giống bacillus, giống Clostridium
+ Nấm mốc: Aspergillus, Penicilium, Fusarium
- Vi sinh vật yếm khí:
+ Vi khuẩn dạ cỏ: Giống ruminococcus
+ Vi sinh vật yếm khí sống tự do: Bacillus cellulosae hidrognicus, bacillus cellulosae methanicus
- Vi khuẩn ƣa nóng: Bacillus Cellulase thermophicus
Chỉ một số loài trong các giống vi khuẩn có khả năng thủy giải cellulose, và chúng khác nhau về khả năng sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên Việc phân loại các vi khuẩn kị khí sử dụng cellulose rất phức tạp, do gần đây đã phát hiện nhiều chủng vi khuẩn không có khả năng thủy giải cellulose nhưng lại sở hữu hệ thống gen cellulosome không được biểu hiện, như trường hợp của loài Clostridium acetobutylicum.
Gần đây, chủng Bacillus subtilis DR được phân lập từ suối nước nóng đã sản xuất ra loại endocellulase CelDR bền nhiệt, với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C và vẫn duy trì 70% hoạt tính tại 75°C sau 30 phút ủ Chủng vi khuẩn này cho thấy tiềm năng lớn trong ngành công nghiệp lọc dầu nhờ khả năng chịu nhiệt độ cao.
Chủng vi khuẩn ƣa nhiệt Brevibacillus sp JXL có khả năng phân giải nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose, glucose và xylose Enzym của chủng này có độ bền nhiệt cao, duy trì được 50% hoạt tính sau khi xử lý ở nhiệt độ 100°C trong một giờ.
1.5.2 Nuôi cấy bằng phương pháp lên men bề mặt
Theo phương pháp nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí, sau khi gieo cấy, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn hoặc xốp và dần lan xuống các khe hở giữa các thành phần Chúng sử dụng oxy từ không khí để hô hấp, làm tác nhân oxy hóa trong các quá trình biến đổi hóa sinh, đồng thời thải CO2 ra môi trường và tỏa nhiệt Môi trường dinh dưỡng, sau khi được thanh trùng, được trải lên các khay sạch với độ dày từ 3-5cm và được nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong buồng nuôi cấy có độ ẩm không khí đạt 90%.
Phương pháp bề mặt là lựa chọn lý tưởng cho quá trình nuôi cấy nấm mốc và một số loại xạ khuẩn, cũng như các nhóm vi sinh vật trưởng thành hệ sợi Ngoài ra, phương pháp này cũng được áp dụng trong một số trường hợp nuôi cấy vi khuẩn.
Nuôi vi sinh vật trên bề mặt môi trường rắn hoặc bán rắn, sử dụng cám trộn với các loại bột ngũ cốc, đậu tương và thành phần dinh dưỡng khác, là phương pháp truyền thống để thu các chế phẩm enzym, như trong sản xuất nước chấm (xì dầu) và tương Ngoài ra, môi trường lỏng như dịch rỉ đường cũng được áp dụng trong sản xuất axit xitric nhờ vào tính đơn giản và yêu cầu thiết bị thấp Hiện nay, phương pháp nuôi vi sinh vật trên bề mặt vẫn được sử dụng, nhưng với công nghệ hiện đại hơn và thiết bị đo lường tiên tiến, giúp kiểm soát quá trình và nâng cao hiệu suất lên men.
Song phương pháp nuôi cấy bề mặt vẫn có nhiều nhược điểm:
- Tốn nhiều diện tích mặt bằng
- Khó cơ khí hóa và đặc biệt là rất khó tự động hóa đƣợc toàn bộ quá trình
- Chi phí nhân công, điện nước… cho một đơn vị sản phẩm cao
Nguồn carbon cho môi trường dinh dưỡng bao gồm các loại hạt như ngô, gạo, mì, bobo, đại mạch và đậu tương, được nghiền thành mảnh có kích thước 1-3mm Ngoài ra, cám gạo và cám mì cũng đóng vai trò quan trọng như nguồn carbon và chất sinh trưởng, cùng với trấu giúp tăng độ xốp và hiếu khí cho vi sinh vật Để chuẩn bị môi trường, cần trộn đều các thành phần với nước cho đến khi đạt độ ẩm khoảng 55-60% và sau đó hấp thanh trùng.
Ứng dụng của enzym cellulase
Enzym cellulase hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp và y học Các enzym này đã có mặt trên thị trường trong vài thập kỷ qua và chủ yếu được sản xuất từ các loài vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm lớn.
1.6.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm
Cellulase là thành phần chính của tế bào thực vật, có mặt trong mọi loại rau quả và nguyên liệu từ ngành trồng trọt, lâm nghiệp Tuy nhiên, con người và động vật không thể phân giải cellulase Mặc dù nó có thể cải thiện quá trình tiêu hóa, nhưng khi có mặt với lượng lớn, cellulase lại trở nên vô ích hoặc thậm chí cản trở tiêu hóa.
Chế phẩm cellulase thường dùng để:
+ Tăng chất lƣợng thực phẩm và thức ăn gia súc
Sử dụng cellulase trong chế biến thực phẩm giúp tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật, cải thiện độ hấp thu và nâng cao chất lượng vị giác Ứng dụng này đặc biệt quan trọng trong sản xuất thức ăn cho trẻ em, góp phần nâng cao chất lượng thực phẩm nói chung.
Nhiều quốc gia đã áp dụng cellulase để xử lý các loại rau củ như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo, cũng như các loại lương thực như gạo Ngoài ra, cellulase còn được sử dụng trong việc xử lý chè và các loại tảo biển.
Trong quy trình sản xuất bia, cellulase hoặc phức hệ citase chứa cellulase đóng vai trò quan trọng trong việc phá hủy thành tế bào của hạt đại mạch Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của protease và quá trình đường hóa diễn ra hiệu quả hơn.
Trong sản xuất agar-agar, việc sử dụng chế phẩm cellulase giúp nâng cao chất lượng sản phẩm so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào Cellulase không chỉ hỗ trợ trong việc tận thu các chế phẩm thực vật để thủy phân, mà còn được ứng dụng trong thức ăn gia súc và công nghệ lên men, mang lại kết quả tích cực trong công nghệ thực phẩm Tuy nhiên, một trong những thách thức lớn nhất là việc khó khăn trong việc thu được chế phẩm cellulase với hoạt độ cao.
1.6.2 Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy 1
Trong sản xuất bột giấy và giấy, việc bổ sung enzym trong các giai đoạn nghiền, tẩy trắng và xeo giấy rất quan trọng Nguyên liệu ban đầu thường chứa nhiều lignin và hemicellulose khó tan, gây khó khăn trong việc nghiền tách sợi gỗ thành bột mịn Việc sử dụng endoglucanase trong quá trình nghiền giúp thay đổi cấu hình sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng Trước khi tiến hành nghiền hóa học, gỗ được xử lý bằng endoglucanase cùng với hỗn hợp enzym hemicellulase và pectinase, từ đó cải thiện khả năng khuếch tán hóa chất vào gỗ và nâng cao hiệu quả khử lignin.
Trong quy trình tái chế giấy, việc tẩy mực từ các loại giấy thải là cần thiết trước khi sản xuất giấy in và giấy viết Để thực hiện điều này, các enzyme như endoglucanase và hemicellulase đã được sử dụng để loại bỏ mực in trên giấy.
1.6.3 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Trong quá trình sản xuất nước quả và nước uống không cồn, dịch quả được trích li từ thịt quả nghiền sau khi tách vỏ và bỏ hạt Thịt quả nghiền tạo thành dịch nhuyễn, từ đó ép bã để thu được dịch quả Dịch này chứa các thành phần tế bào và polysaccharide, dẫn đến độ nhớt cao Để tăng hiệu suất trích li, giảm độ nhớt và cải thiện cảm quan, việc bổ sung endoglucanase là rất quan trọng Enzyme này cùng với hỗn hợp cellulase và hemicellulase giúp nâng cao hiệu quả chế phẩm, cải thiện độ đồng thể của nước quả có thịt.
Trong quy trình sản xuất bia, việc sử dụng các enzym amylase, protease và glucanase giúp ngăn ngừa sự hình thành diacetyl, từ đó giảm thiểu lượng diacetyl sản sinh và rút ngắn thời gian ủ bia.
Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia [6]
Trong sản xuất cà phê ở Việt Nam, phương pháp khô thường dẫn đến chất lượng cà phê không cao Để cải thiện điều này, phương pháp lên men đã được áp dụng, sử dụng enzym cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và tăng khả năng trích ly dịch quả Việc bóc vỏ bằng cellulose có thể gây thẫm màu và giảm chất lượng sau khi sấy Sử dụng chế phẩm A niger Biovina-09 với hoạt tính pectinase và cellulase giúp tăng số lượng cà phê bóc vỏ, đồng thời hạt cà phê không còn nhớt và đạt hiệu suất bóc vỏ cao Trong quá trình trích ly dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát chất hòa tan, nhưng với chế phẩm Biovina-09, hiệu suất trích ly cao hơn 46% so với mẫu không sử dụng.
1.6.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Trong chăn nuôi động vật ăn cỏ, việc bổ sung cellulase vào thức ăn giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu, đặc biệt là ở động vật non, từ đó giảm chi phí thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng nhanh hơn Ứng dụng cellulase trong phân giải nguồn thức ăn giàu cellulose như rơm, rạ, bã mía, bã khoai, và bã sắn đang được triển khai rộng rãi, đặc biệt trong sản xuất protein đơn bào cho gia súc Nấm sợi được sử dụng để lên men các nguồn phế thải giàu cellulose, tạo ra sinh khối protein với hàm lượng amino acid cân đối, vitamin và hương thơm, giúp cải thiện tiêu hóa cho vật nuôi.
1.6.5 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong quá trình sản xuất ethanol, amylase đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đường hóa bằng cách thủy phân tinh bột Bên cạnh đó, việc bổ sung các enzym như cellulase và hemicellulase giúp phá hủy thành tế bào, từ đó tăng lượng đường tạo ra và cải thiện tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn đến việc nâng cao hiệu suất thu hồi rượu lên tới 1,5%.
1.6.6 Trong công nghệ xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Rác thải là nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường, dẫn đến mất cân bằng sinh thái và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Thành phần hữu cơ chủ yếu trong rác thải là cellulose, vì vậy việc áp dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải mang lại hiệu quả cao Enzym cellulase có khả năng thủy phân cellulose và chuyển hóa lignocellulose trong rác thải, tạo ra nguồn năng lượng từ các sản phẩm như đường, ethanol và khí sinh học Ngoài việc bổ sung vi sinh vật trực tiếp vào bể ủ, việc phát triển chế phẩm vi sinh chứa cellulase cũng đã được nghiên cứu và sản xuất.
Phức hệ cellulase được ứng dụng hiệu quả trong việc xử lý nước thải từ các nhà máy giấy, nơi mà nguyên liệu chính là gỗ, chứa nhiều polysaccharide, đặc biệt là cellulose, quyết định chất lượng và số lượng giấy Việc bổ sung chế phẩm chứa phức hệ cellulase vào nước thải từ các cơ sở chế biến gỗ và xưởng mộc mang lại hiệu quả cao trong quá trình xử lý.
Tình hình nghiên cứu thu nhận cellulase từ ruột mối trên thế giới và ở Việt
1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Gần đây, nghiên cứu về hệ sinh vật cộng sinh trong ruột mối đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học Hệ sinh vật này có khả năng sản sinh enzym cellulase, mở ra cơ hội ứng dụng trong các ngành công nghiệp chuyển hóa sinh khối.
Theo nghiên cứu của Subodh và cộng sự (2012) các vi sinh vật cộng sinh gồm có Cellulomanas, Enterobacter và Citrobacter Cũng theo nghiên cứu của
Ramin và cộng sự (2009), các vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối Coptotermes curvignathus gồm có Chryseobacterium kwangyangense, Acinetobacter, Bacillus cereus
Nghiên cứu của Nyi Mekar Saptarini và Wiwiek Indriyati (2014) tập trung vào việc phân lập vi khuẩn cellulolytic từ mối, sử dụng cellulose của bắp ngô làm nguồn carbon Mục tiêu chính là cô lập các vi khuẩn này, sản xuất cellulase thô và xác định hoạt độ cellulolytic của chúng.
Các bước nghiên cứu này bao gồm phân lập cellulose, phân lập vi khuẩn cellulolytic, sản xuất cellulase thô, và xác định hoạt độ cellulolytic
Hàm lượng Cellulose của bắp ngô dao động từ 23,13% đến 27,90% Vi khuẩn phân lập được đã được làm sạch từ môi trường sàng lọc cố định Sau khi ủ trong môi trường nước, các mẫu vi khuẩn chuyển thành dung dịch màu vàng rõ ràng Hoạt độ Endoglucase và tổng số cellulase của vi khuẩn phân lập lần lượt là 0,021 U và 0,022 U.
Một nhóm nhà khoa học đã nghiên cứu hệ tiêu hóa và vi sinh vật trong ruột Mối, phát hiện ra các gen liên quan đến sự phân hủy lignin Lignin là thành phần chính trong cấu trúc tế bào thực vật, khó phân hủy và ức chế quá trình lên men chuyển tinh bột thành đường, ảnh hưởng đến sản xuất nhiên liệu sinh học.
Trường Đại học Purdue đã tiến hành nghiên cứu về vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột mối và ảnh hưởng của chúng đến quá trình tiêu hóa Mặc dù ban đầu tập trung vào các nhóm vi khuẩn cộng sinh, nhưng nghiên cứu gần đây cho thấy các nhóm sinh vật khác cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải gỗ Thí nghiệm cho thấy cấu trúc quần thể vi khuẩn trong ruột mối không thay đổi khi cho chúng ăn gỗ hoặc giấy, cho thấy vi khuẩn cộng sinh có thể không liên quan đến khả năng phân giải gỗ Hơn nữa, sự thay đổi thức ăn đã dẫn đến sự thay đổi đáng kể trong biểu hiện gen của vật chủ và các nhóm cộng sinh khác, đặc biệt là nhóm sinh vật nguyên sinh.
Trong các nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn, Bacillus nổi bật với khả năng sản xuất 10 cellulase ngoại bào với số lượng lớn Đặc biệt, B.subtilis là chủng vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực này (Park và cộng sự).
1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumilus (Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) và KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989)
1.7.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Hiện nay, nhiều nghiên cứu tại Việt Nam đã chỉ ra rằng vi sinh vật có khả năng sinh enzym cellulase từ nhiều nguồn khác nhau, đặc biệt là nấm sợi, như báo cáo của Khưu Phương Yến Anh (2007), Hoàng Quốc Khánh và cộng sự (2003), Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (2005) Ngoài ra, một số nghiên cứu về vi khuẩn cũng đã được thực hiện bởi Võ Văn Phước Quệ (2011) và Trần Non Nước (2012) Tuy nhiên, vẫn chưa có báo cáo nào về nghiên cứu các vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
- Các chủng mối được thu thập tại Nghệ An, lưu giữ tại phòng thí nghiệm khoa Hóa học Trường Đại Học Vinh
Hình 2.1: Chủng G 4 cấy chuyền và làm sạch trong môi trường D 5
Hóa chất và thiết bị
Hóa chất sử dụng trong môi trường nuôi cấy bao gồm cám gạo, bột đậu nành, chiết nấm men, tryptone, casein, NaCl, CMC và một số hóa chất khác Tất cả các hóa chất này đều ở dạng tinh khiết, phục vụ cho mục đích phân tích và nghiên cứu, được sản xuất tại Đức và Trung Quốc.
- Cân 210g acid xitric monohidrat (C 6 H 8 O 7 ) hòa tan trong nước cất và định mức đến 1 lít
Lấy 1 ml đệm 1M dùng NaOH để điều chỉnh về pH = 4.5 Sau đó pha loãng với nước cất để đạt 0.05M, lúc này dung dịch đệm đạt pH = 4.8 (1ml đệm citrat 1M +19 ml nước cất)
Kiểm tra lại và có thể điều chỉnh để đạt pH cần thiết
Thuốc thử DNS (Dinitro salicylic)
Sử dụng nước cất làm dung môi, định mức cho đến 1lit
Hòa tan 300 ml nước cất ở nhiệt độ 50C với DNS, sau đó thêm hai chất khác để đạt tổng thể tích 500 ml Kiểm tra thuốc thử DNS bằng cách sử dụng HCl 0.1N: lấy 3 ml DNS, thêm 2-3 giọt chỉ thị phenolphtalein, và tiến hành chuẩn độ bằng HCl 0.1N cho đến khi đạt màu tương ứng với DNS Dừng lại khi lượng HCl sử dụng khoảng 5-6 ml.
Cơ chất CMC 1% (cacboxymethyl cellulase):
Cân 1 gam CMC hòa tan trong 20ml đệm citrat 0.05M và định mức tới 100ml
Cân 1 g congo red hòa tan trong 20 ml nước cất và định mức tới 100 ml NaCl 1M
Cân 58,5 g NaCl định mức tới 1 lít
- Cân phân tích điện tử
- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác như: Bình tam giác, pipet, ống đong, phễu, bình định mức…
- Các dụng cụ thông thường dùng trong nghiên cứu vi sinh
Các môi trường nuôi cấy
Thành phần: CMC 5g, NaNO 3 2g, K 2 HPO 4 1g, MgSO 4 2g, Peptone 2g, KCl 1g, agar 18g nước cho đủ 1 lít Phối vào các ống nghiệm và đưa đi hấp vô trùng ở
121 0 C, 1at trong vòng 15 phút Sau đó đặt nằm nghiêng Khi môi trường đã đông hoàn toàn thì cất vào tủ lạnh để sử dụng
2.3.2 Môi trường nhân giống (LB lỏng không có CMC)
Môi trường sử dụng cho nhân giống có thành phần (g/l): Tryptone 10g, yeas extract 5g, NaCl 5g định mức bằng nước cất cho đến 1 lit
2.3.3 Môi trường nuôi cấy: gồm các môi trường
Môi trường nuôi cấy LB
Môi trường bao gồm: Tryptone 10g, yeas extract 5g, NaCl 5g, 10g CMC định mức bằng nước cất cho đến 1 lit
Môi trường cơ chất và khoáng bao gồm: Cám gạo 2%, bột đậu nành 1%, casein 1%, NaCl 0.1%
Môi trường bao gồm: Pepton 2g; CMC 10g; K 2 HPO 4 4g, MgSO 4 0.06g; (NH 4 ) 2 SO 4 0.5g; Gelatin 0.4g Định mức bằng nước cất đêna 1 lít
Môi trường bao gồm: CMC 10g; NaCl 6g; (NH 4 ) 2 SO 4 1g; KH 2 PO 4 0.5g;
K 2 HPO 4 0.5 g; MgSO 4 0.1g; yeast extrac 1g Định mức bằng nước cất đến 1 lít
Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn các chủng có hoạt tính
Trong môi trường thạch chứa CMC, vi khuẩn sinh enzym cellulase sẽ thủy phân cơ chất Khi nhỏ dung dịch Congo red lên đĩa môi trường, các khu vực cơ chất bị thủy phân sẽ trở nên trong suốt, trong khi những vùng còn lại sẽ giữ màu đỏ do thuốc nhuộm Congo red.
Các chủng vi sinh vật đã phân lập được chấm điểm lên môi trường tương ứng có bổ sung 1% CMC (mỗi đĩa môi trường cấy 2 đến 3 điểm) Ủ 37C trong 48 -
72 giờ Sau đó, nhỏ dung dịch Congo red 0,1% trong 15 phút và rửa lại bằng NaCl 1M Xác định đường kính vòng không màu xung quanh khuẩn lạc
Sau khi lựa chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym cellulase, cần thực hiện quy trình làm sạch để đảm bảo khuẩn lạc đồng đều về hình dạng và màu sắc, từ đó ngăn chặn sự nhiễm bẩn từ các chủng khác trong quá trình nghiên cứu.
- Hút 0.9 ml nước cất vô trùng cho vào ống eppen đót
- Dùng que cấy lấy một ít sinh khối (ở mẫu) cho vào ống eppen đót rồi vortex
- Hút 0.1 ml trong ống đã vortex cho vào ống eppen đót khác + 0.9 ml nước cất vô trùng (pha loãng 10 -2 ) rồi vortex
- Hút 0.1 ml trong ống đã vortex cho vào ống eppen đót khác + 0.9 ml nước cất vô trùng (pha loãng 10 -3 ) rồi vortex
- Hút 0.1 ml trong ống đã vortex cho vào ống eppen đót khác + 0.9 ml nước cất vô trùng (pha loãng 10 -4 ) rồi vortex
- Hút 0.1 ml trong ống đã vortex cho vào đĩa peptri chưa môi trường D 5 Dùng que chang, chang đều mẫu trong đĩa thấy khô khô đĩa là đƣợc Ủ 37C trong
2.4.3 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống
Để duy trì hoạt tính của giống sản xuất, việc bảo quản là rất quan trọng Do đó, cấy giống trên môi trường thạch nghiêng trước khi tiến hành nhân giống là một bước cần thiết.
Chủng nấm được lấy từ nơi giữ giống cần cấy chuyền trên môi trường D5, giữ ở nhiệt độ 37°C trong 2 đến 3 ngày để nấm phát triển Sau đó, cần bảo quản trong tủ lạnh ở 10°C Sau 7 đến 10 ngày, cần thực hiện cấy chuyền để tránh tình trạng già hóa giống và mất hoạt tính của chủng.
Sự khác biệt giữa vách tế bào Gram dương và Gram âm ảnh hưởng đến khả năng bắt màu của màng tế bào khi sử dụng thuốc nhuộm, dẫn đến việc phân loại vi khuẩn thành hai nhóm (MacFaddin, 2000)
Sử dụng que cấy để lấy một lượng vi sinh vật từ ống nghiệm hoặc đĩa, sau đó cho chúng lên lam kính Tiếp theo, dùng que cấy lấy một ít nước muối sinh lý và dàn đều vi sinh vật trên lam kính Cuối cùng, để làm khô, tiến hành nhuộm Gram cho mẫu.
- Cho gelatin vào mẫu 0.5 - 1 phút, rửa bằng nước cất
- Cho lugol vào mẫu 0.5 -1 phút, rửa bằng nước cất
- Cho cồn vào khoảng 30 giây đến khi mất màu, rửa nước cất
- Cho Fucsin vào 1 phút, rửa nước cất, để khô nhỏ dầu rồi soi dưới kính hiển vi
Vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng, trong khi vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu tím Những vi khuẩn đã hình thành bào tử sẽ có bào tử trong suốt không bắt màu nằm bên trong tế bào dinh dưỡng bắt màu Gram (+) Ngoài ra, nếu bào tử đã phóng thích ra ngoài, nó sẽ tạo ra một ria màu hồng xung quanh khối trong suốt.
Phương pháp xác định hoạt độ enzym theo phương pháp Miller
Hoạt tính của enzym cellulase được xác định thông qua việc định lượng glucose giải phóng trong quá trình thủy phân cơ chất, cụ thể là CMC, một dẫn xuất của cellulose.
Chủng vi khuẩn sẽ được nuôi cấy trong môi trường M3 bằng máy lắc ở tốc độ 150 vòng/phút và nhiệt độ 37°C trong 3 ngày Sau đó, enzym sẽ được thu nhận qua quá trình ly tâm để xác định hoạt độ của nó.
Chuẩn bị mẫu thí nghiệm
- Lấy 0.5 ml dịch enzym cho vào ống nghiệm + 1ml cơ chất CMC 1%
- Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50 o C trong 30 phút
- Làm nguội + 1,5 ml DNS, đun sôi 5 phút, làm nguội
- Xác định lượng đường khử có trong mẫu
Chuẩn bị mẫu kiểm chứng
- Lấy 0.5 ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm,
- Đem đun sôi 15 phút để diệt enzym,
- Để nguội + 1.5 ml DNS, đun sôi 5 phút, xác định lượng đường khử có trong mẫu thí nghiệm
Một đơn vị hoạt tính (đvht) của enzym cellulase được xác định là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 µmol glucose trong 1 ml dung dịch trong vòng 1 phút.
Hoạt tính cellulase ( mol/ml/phút) 5 0 30 180
Ta có: Cứ 1ml enzym pha loãng lên 15 ml bằng nước cất
Hoạt tính cellulase ( mol/g/phút) 5 0 30 180
D: Hàm lượng đường khử dựa vào giá trị OD của đường chuẩn
10 3 : Hệ số chuyển đổi 180: Phân tử lƣợng Glucose 30: Thời gian phản ứng 15: Hệ số pha loãng 0.5: số ml enzym tham gia phản ứng
Phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp định lượng DNS
Phương pháp xác định đường khử dựa trên phản ứng tạo màu với thuốc thử axit dinitro salycylic (DNS) cho phép đo cường độ màu của hỗn hợp, tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong mẫu Bằng cách sử dụng đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết kết hợp với thuốc thử DNS, hàm lượng đường khử trong mẫu nghiên cứu có thể được tính toán chính xác.
Để chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn nồng độ 10 mg/ml, cân 1 gram glucose và hòa tan trong nước cất để đạt đủ 100ml Từ dung dịch này, ta có thể pha loãng để tạo ra các nồng độ glucose khác nhau, dao động từ 0.2 đến 1.0 mg/ml.
Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ glucose và giá trị
Cho 0.5 ml dung dịch glucose đã pha loãng với nồng độ khác nhau vào 6 ống nghiệm, sau đó thêm 1 ml đệm citrat 0.05M pH = 4.8 Cuối cùng, bổ sung 1.5 ml thuốc thử DNS vào mỗi ống nghiệm.
- Lắc đều, đun sôi trong 5 phút
- Làm nguội và thêm 10 ml nước cất rồi được tiến hành đo bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540nm
- Nồng độ glucose thủy phân xác định dựa vào đường chuẩn glucose
- Chuẩn bị mẫu đối chứng bằng cách thay 0.5 ml glucose bằng 0.5 ml nước cất
+ Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm
- Pha loãng enzym Lấy 1ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm + 14ml nước cất
- Lấy 0.5 ml dịch enzym đã pha loãng ở trên cho vào ống nghiệm + 1ml cơ chất CMC 1%
- Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50 o C trong 30 phút
- Sau khi ủ cho thêm 1.5ml DNS Tiếp tục đun sôi trong 5 phút
- Làm lạnh ở nhiệt độ phòng và đem đo ở bước sóng 540nm
Lượng đường khử tạo thành sau phản ứng thủy phân bởi enzym cellulase được xác định theo phương pháp định lượng dường khử bằng Axit Dinitro Salycylic (DNS)
Phương pháp lựa chọn môi trường và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp cellulase
2.7.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy
- Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy LB; CMC - Broth; M 3 ; D 6
- Phân bố môi trường vào các bình tam giác 125 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trường Hấp khử trùng ở 121 o C, áp suất 1atm trong 20 phút
Cấy chủng G 4 trong các môi trường: LB; CMC - Broth; M 3 ; D 6 Nuôi trên máy lắc ở 37C, với tốc độ 150 vòng/phút Sau 2 ngày đo hoạt tính enzym
2.7.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nhân giống
+ Chuẩn bị môi trường nhân giống
+ Phân bố môi trường vào các ống nghiệm, theo các tỉ lệ 2.5% (1.25 ml); 5% (2,5 ml); 10% (5 ml): 15% (10 ml) Hấp khử trùng ở 121 o C, áp suất 1atm trong 20 phút
Cấy chủng vào ống nghiệm chứa môi trường nhân giống trong tủ cấy vô trùng và nuôi lắc ở nhiệt độ 37C với tốc độ 150 vòng/phút Sau 18 - 24 giờ, tiếp tục đưa giống vào môi trường lên men để phát triển.
Sau 2 ngày nuôi lắc trong máy lắc ổn nhiệt ở 37C với tốc độ 150 vòng/phút, hoạt tính enzym cellulase được đo để xác định tỷ lệ tối ưu Tỷ lệ có hoạt tính cao nhất sẽ được chọn để nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase.
2.7.3 Ảnh hưởng của thời gian thu nhận
Chuẩn bị môi trường sinh tổng hợp là bước quan trọng Sau 18-24 giờ nuôi lắc trong môi trường nhân giống, chủng sẽ được chuyển vào môi trường nuôi cấy lỏng M3 Quy trình này cần được thực hiện trong tủ cấy vô trùng để đảm bảo sự an toàn và hiệu quả.
Thu dịch chiết enzym tại các thời điểm nuôi cấy sau 1, 2, 3 và 4 ngày nuôi trên tủ lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 37C, tốc độ lắc 150 vòng/phút
Xác định hoạt độ cellulase theo thời gian nuôi cấy là cần thiết để tìm ra thời gian tối ưu cho hoạt tính enzym cellulase cao nhất, từ đó phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.7.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Nuôi chủng G 4 trong môi trường M 3 ở các nhiệt độ 30, 37 và 40 độ C nhằm xác định thời gian nuôi cấy tối ưu Sau đó, tiến hành thu canh trường và xác định hoạt độ enzym bằng phương pháp định lượng đường khử thông qua DNS.
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy với các pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8, sau đó tiến hành nuôi cấy trên máy lắc ở nhiệt độ 37°C với tốc độ 150 vòng/phút Thực hiện đến thời gian nuôi cấy tối ưu, thu dịch chiết enzym và xác định hoạt độ enzym bằng phương pháp định lượng đường khử qua DNS.
2.7.6 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có cơ chất cám gạo ở các nồng độ: 1g/l; 2.5g/l; 5g/l; 10g/l; 15g/l và 20 g/l
Tiến hành nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau trong tủ lắc ở nhiệt độ 37C và tốc độ lắc 150 vòng/phút Thời gian nuôi cấy tối ưu được xác định là 3 ngày, sau đó thu dịch và xác định hoạt độ enzym để tìm ra nồng độ tối ưu cho hoạt tính enzym cellulase cao nhất.
2.7.7 Ảnh hưởng nguồn cơ chất khác nhau
Chuẩn bị môi trường nhân giống và cấy chủng G4 trong 18-24 giờ, sau đó chuyển vào môi trường nuôi cấy chứa các nguồn cơ chất như lá ngô, lá sắn, CMC và giấy lọc Tiến hành nuôi trong tủ lắc ở 37°C trong 3 ngày với tốc độ quay 150 vòng/phút để xác định nguồn cơ chất tối ưu có hoạt tính cellulase cao nhất, sử dụng phương pháp định lượng đường khử bằng DNS để đo hoạt độ enzym.