QUAN
Đặc điểm và phân bố
Tên khoa học: Annona muricata (Soursop)
„Annona‟ xuất phát từ tên tại Haiti, anon, nghĩa là thu hoạch của năm,
„muricata‟ có nghĩa là mặt bên ngoài sần lên có những mũi nhọn
Tên thông thường: Na xiêm hay mãng cầu gai (Miền Nam), Na xiêm (Miền Bắc)
Na xiêm, loại trái cây nhiệt đới phổ biến ở Nam Mỹ và Đông Ấn, là một trong những cây đầu tiên được đưa từ Châu Mỹ về lục địa Hiện nay, na xiêm đã được trồng rộng rãi từ Đông – Nam Trung Hoa đến Úc và các vùng bình nguyên ở Đông và Tây Châu Phi.
Hình 1.1 Hình ảnh cây na xiêm (Annona muricata)
Cây na xiêm là loại cây tiểu mộc cao từ 5-8 mét, có lá màu xanh đậm, không lông và xanh quanh năm Thân cây có vỏ màu nâu với nhiều lỗ nhỏ, trong khi lá có hình dạng tái xoan, thuôn nhọn ở đầu, mọc so le.
Lá cây có mùi thơm đặc trưng với 7-9 cặp gân phụ Hoa mọc đơn lẻ ở thân hoặc nhánh già, gồm ba lá đài nhỏ màu xanh và ba cánh hoa màu xanh vàng Nhị và nhụy hoa kết hợp tạo thành khối tròn Quả na xiêm lớn, có gai mềm, thuộc loại quả mọng kép, dài từ 20-25cm, màu xanh lục hoặc vàng-xanh, chuyển sang màu vàng khi chín quá mức Quả có thể nặng đến 5kg, vỏ mỏng với những nốt phù tạo thành múi nhỏ nhọn hoặc cong, chứa nhiều hạt màu nâu sậm, dễ phân biệt nhờ gai cong mềm, còn được gọi là na gai Quả thường được thu hái khi còn xanh và ngon nhất sau 4-5 ngày, khi đó phần thịt quả màu trắng chia thành nhiều khối chứa hạt nhỏ.
Cây na xiêm ưa sống ở những vùng có độ ẩm cao và khí hậu ấm áp, chịu lạnh kém với nhiệt độ dưới 5°C có thể gây hại cho lá và nhánh nhỏ, trong khi nhiệt độ dưới 3°C có thể dẫn đến chết cây Loại cây này chủ yếu được trồng để lấy quả và phổ biến ở các tỉnh phía Nam Việt Nam.
Na xiêm cần lượng mưa khoảng 1.800 mm và có khả năng chịu hạn cũng như lạnh kém hơn so với na ta Độ pH lý tưởng cho loại cây này dao động từ 5,0 đến 6,5 Ở những vùng đất mặn hoặc nhiễm mặn với độ pH thấp và chịu ảnh hưởng của thủy triều, người trồng thường ghép na trên gốc bình bát, trong khi ở các khu vực khác, na xiêm được trồng từ hạt.
Các hợp chất acetogenin trong cây na xiêm
Các hợp chất acetogenin thiên nhiên có mạch cacbon dài từ 35-37, được hình thành từ axit béo C-32/C-34 kết hợp với một đơn vị 2-propanol Chúng có cấu trúc dạng chuỗi aliphatic dài gắn với vòng -lacton, có nối đôi ở vị trí , , cùng với nhóm metyl và đôi khi là ketolacton Ngoài ra, acetogenin còn có thể gắn một, hai hoặc ba vòng tetrahydrofuran, và trên mạch chính có các nhóm thế như hyđroxyl, acetoxyl, keton, epoxid và diol, cũng như một số hợp chất có liên kết đôi C=C.
Bảng 1.1 Một số hợp chất acetogenin trong các bộ phận của cây Na xiêm [5],[7-
TT Hợp chất TT Hợp chất
12 cis và trans – Annomuricin – D – one 54 muricatetrocin B
Hoạt tính sinh học của acetogenin
Nghiên cứu về ung thư từ chi Annona chủ yếu tập trung vào annonaceous acetogenin, một lớp chất tự nhiên mới Ba nhóm nghiên cứu độc lập đã phân lập các hợp chất acetogenin, cho thấy khả năng chống khối u và chống ung thư, đồng thời có tính chọn lọc đối với tế bào ung thư mà không gây hại cho tế bào khỏe mạnh Đến nay, đã có tám nghiên cứu lâm sàng công bố dựa trên những phát hiện này, với nhiều hợp chất acetogenin thể hiện tính gây độc chọn lọc đối với tế bào ung thư ở liều rất thấp khoảng 1/10^6 Các nghiên cứu từ năm 1998 đã chứng minh khả năng kháng ung thư, kháng bướu và kháng vi-rút mạnh mẽ của các hợp chất này Các hợp chất acetogenin từ chi Annona đã được xác nhận có đặc tính gây độc chọn lọc đối với nhiều loại tế bào khối u, bao gồm ung thư biểu mô phổi, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư tuyến tụy, ung thư đại tràng, ung thư gan và tế bào ung thư hệ bạch huyết.
Hợp chất annonaceous acetogenin cũng đƣợc tìm thấy ở các cây khác thuộc họ
Họ Na (Annonaceae) chứa nhiều hợp chất Annonaceous acetogenin đã được nghiên cứu và ghi nhận với các hoạt tính đa dạng như kháng ung bướu, kháng ký sinh trùng, diệt sâu bọ, kháng động vật nguyên sinh, ức chế cảm giác thèm ăn, diệt giun sán và kháng khuẩn.
Các nghiên cứu gần đây từ ba phòng thí nghiệm khác nhau đã chỉ ra rằng acetogenin có khả năng ức chế enzyme trong màng tế bào khối u ung thư Trường Đại học Purdue tại West Lafayette, Ấn Độ, đã tiến hành nhiều nghiên cứu về acetogenin và nhận được sự tài trợ từ Viện Ung thư Quốc gia và các Viện Y tế Quốc gia (NIH) Đến nay, trường đã sở hữu ít nhất chín bằng sáng chế quốc tế và Mỹ liên quan đến các đặc tính kháng ung bướu và côn trùng của acetogenin.
Những tiến bộ gần đây trong nghiên cứu acetogenins Annonaceous đã chỉ ra rằng các acetogenin này có khả năng ức chế chọn lọc sự tăng trưởng của tế bào ung thư, bao gồm cả tế bào khối u do hoạt chất adriamycin Mặc dù nhiều acetogenin đã được phân lập và thử nghiệm, một số dẫn xuất với cấu trúc khác nhau cho thấy tính chọn lọc đặc biệt đối với các dòng tế bào ung thư nhất định, chẳng hạn như ung thư tuyến tiền liệt (PC-3) Hiện nay, chúng ta đã hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của acetogenin, đặc biệt là vai trò của chúng như những chất ức chế mạnh đối với enzyme NADH: ubiquinone oxidoreductase, enzyme quan trọng trong phức chất I, dẫn đến sự oxi hóa phosphoryl trong ty thể Các acetogenin này cũng phản ứng trực tiếp tại vùng có ubiquinone và ức chế quá trình oxi hóa NADH liên kết với ubiquinone, cho thấy tính đặc thù của chúng đối với màng plasma của tế bào ung thư.
Năm 1997, Đại học Purdue công bố nghiên cứu về Annonaceous acetogenin, cho thấy chúng không chỉ tiêu diệt các khối u mà còn đặc biệt hiệu quả với các tế bào kháng thuốc Các nhà nghiên cứu phát hiện acetogenins ưu tiên tiêu diệt tế bào ung thư đa kháng bằng cách ngăn chặn sự chuyển ATP, nguồn năng lượng chính của tế bào Khi năng lượng bị ức chế, tế bào ung thư không thể duy trì hoạt động và dẫn đến cái chết Trong khi đó, các tế bào bình thường chỉ cần một lượng nhỏ năng lượng để hoạt động, do đó ít bị ảnh hưởng bởi thuốc ức chế ATP Nghiên cứu đã thử nghiệm 14 loại acetogenin và phát hiện rằng 13 trong số đó có khả năng chống lại tế bào ung thư vú MDR hiệu quả hơn ba loại thuốc tiêu chuẩn như adriamycin, vincristine và vinblastine.
Vào tháng 3 năm 2002, các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã công bố một thử nghiệm trên cơ thể, nghiên cứu các loại acetogenin khác nhau trong một số loài cây Họ tiêm tế bào ung thư biểu mô phổi Lewis vào chuột, chia thành ba nhóm: một nhóm không nhận gì, một nhóm nhận thuốc hóa trị adriamycin, và nhóm còn lại nhận acetogenin từ mãng cầu xiêm, chủ yếu là annonacin.
Sau hai tuần thử nghiệm với liều lượng 10mg/kg, năm trong số sáu nhóm chuột không được điều trị vẫn sống sót, và kích thước khối u phổi được đo Nhóm chuột được điều trị bằng adriamycin cho thấy giảm 54,6% khối lượng khối u, tuy nhiên 50% trong số đó đã chết do ngộ độc Ngược lại, tất cả chuột nhận annonacin vẫn sống và khối u được ức chế khoảng 57,9%, kết quả tốt hơn một chút so với adriamycin và nhóm không điều trị Các nhà nghiên cứu kết luận rằng annonacin ít độc hại hơn trên chuột, và với khả năng kháng u và ít gây độc tế bào, annonacin có thể là một chất dẫn đường tiềm năng trong phát triển các tác nhân chống ung thư Tuy nhiên, cần lưu ý rằng annonacin chỉ ức chế sự phát triển của khối u phổi trong hai tuần mà không tiêu diệt hoặc ngăn chặn hoàn toàn sự tăng trưởng của chúng.
Nghiên cứu về ung thư đang được tiến hành trên các loại thực vật và hóa học thực vật quan trọng, với sự tham gia của nhiều công ty dược phẩm và trường đại học Họ đang nghiên cứu, thử nghiệm, và cố gắng tổng hợp các hóa chất để phát triển thuốc hóa trị liệu mới Đặc biệt, các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng chất ức chế khử hydro NADH có khả năng ngăn chặn lây nhiễm HIV Annonaceous acetogenin, một hợp chất có trong mãng cầu xiêm và các loài thuộc chi Na (Annona), đã được đưa vào chương trình sàng lọc NIH chống AIDS của Đại học Purdue, cho thấy tiềm năng nghiên cứu vẫn đang tiếp tục trong lĩnh vực này.
* Các acetogenin thuộc kiểu monotetrahydrofuran:
Trong cấu trúc của phân tử các hợp chất loại này có vòng tetrahydrofuran, hai hay nhiều nhóm – OH, có hoặc không có liên kết đôi C = C
Hợp chất (112) (0,0021%), (113) (0,0032%), (114) (0,0021%) đƣợc M.C Jaramillo và các cộng sự [12] phận lập và xác định cấu trúc vào năm 1999 từ vỏ của quả na xiêm
Hai hợp chất mono-tetrahydrofuran (115) và (116) đƣợc Geum-Soong Kim và các cộng sự [13] phân lập từ lá của cây na xiêm
OH OH threo erythro trans threo
OH OH threo trans threo
Năm 2001, Chih-Chuang Liaw và các cộng sự từ Đài Loan đã phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất (118), (120), (121) từ hạt và hợp chất (117), (119) từ lá của na xiêm, tất cả đều thuộc loại mono-tetrahydrofuran.
Fang-Rong Chang and Yang-Chang Wu (Đài Loan) [5] đã phân lập và xác định đƣợc bảy hợp chất cytotoxic monotetrahydrofuran acetogenin: muricin A-G (122-
128), các hợp chất này đƣợc phân lập từ hạt của na xiêm
Trong công trình nghiên cứu của Christophe Gleye (Pháp)và các cộng sự [7] đã phân lập đồng thời xác định cấu trúc của các hợp chất acetogenin (129), (130), (131),
(132), (133), (134) những hợp chất này thuộc loại cis-monotetrahydrofuran đƣợctrích từ rễ cây Na xiêm
* Các acetogenin thuộc kiểu non-monotetrahydrofuran:
Hợp chất (52) là một loại non-tetrahydrofuran (THF) với bốn nhóm –OH và một liên kết đôi C=C trên mạch dài aliphatic, được tách và xác định cấu trúc bởi De Yu LI và các cộng sự từ hạt quả na xiêm.
Nghiên cứu của Christophe Gleye và cộng sự đã thành công trong việc phân lập hai hợp chất acetogenin non-monotetrahydrofuran từ hạt trái na xiêm Các hợp chất này có cấu trúc chính với hai nhóm -OH liền kề và một liên kết đôi C=C.
C Gleye và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và phân lập hợp chất (138) từ rễ cây na xiêm, hợp chất này thuộc loại acetogenin điol liền kề với hai liên kết đôi C=C trên mạch chính.
Montecristin là một loại acetogenin, được xác định là sabadelin, do Christophe Gleye và các cộng sự phân lập từ dịch chiết metanol của rễ cây na xiêm Hợp chất này đặc trưng bởi sự hiện diện của vòng peroxit và một liên kết đôi trong mạch chính của cấu trúc.
PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM
Mẫu nghiên cứu
Mẫu lá na xiêm (Annona muricata L.) được thu hái tại Nghệ An vào tháng 9 năm 2013 PGS TS Trần Huy Thái, thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã xác định tên khoa học của mẫu này Mẫu vật hiện đang được lưu giữ tại Khoa Sinh - Trường Đại học Vinh.
Phân lập các hợp chất acetogenin
Để phân tích và phân tách cũng nhƣ phân lập các hợp chất, sẽ sử dụng các phương pháp sắc ký như:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC);
- Sắc ký cột thường (CC);
- Sắc ký cột nhanh (FC);
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC);
- Các phương pháp kết tinh
Quá trình phân lập các hợp chất acetogenin đƣợc tiến hành theo sơ đồ 2.1 và sơ đồ 2.2.
Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất acetogenin
Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:
- Phổ khối lƣợng (EI-MS), (ESI-MS), (HR-ESI-MS);
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR;
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR;
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC;
Cấu trúc lập thể tương của các hợp chất được xác định thông qua các phương pháp phổ NMR, bao gồm kỹ thuật NOE và NOESY, cùng với phương pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray).
Phương pháp xác định độ tinh sạch của acetogenin làm chất chuẩn
2.4.1 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất
Các hợp chất trong nghiên cứu đều có cấu trúc đã được xác định Dữ liệu chuẩn được sử dụng để nhận diện các chất, nhằm cung cấp thông tin cho việc thiết lập hồ sơ nhận dạng chuẩn Quá trình nhận diện chất dựa trên các tiêu chí cụ thể.
Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết phân đoạn cao chiết etanol lá na xiêm
Phân bố vào H2O và chiết tách lần lượt bằng hexan, cloruaform, etyl acetat; dịch chiết tương ứng được cất để thu hồi dung môi, từ đó thu được các phân đoạn AMF-1, AMF-2, AMF-3 và AMF-4.
Phân đoạn Etyl acetat (AMF-3)
Sơ đồ 2.2 Phân lập các hoạt chất từ phân đoạn etylaxetat lá na xiêm (AMF-3)
- So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện
So sánh thông tin phổ và dữ liệu hóa lý của chất với tài liệu khoa học hoặc các thông tin đã được công bố là rất quan trọng Việc tập hợp các dữ liệu chuẩn này giúp khẳng định tính chính xác của hợp chất trong nghiên cứu.
Các phương pháp xây dựng bộ dữ liệu bao gồm đo điểm chảy, đo phổ tử ngoại khả kiến trong dung môi MeOH, đo phổ hồng ngoại trong KBr, và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) cùng với hai chiều (COSY, HMBC, HSQC) Ngoài ra, việc đo phổ khối lượng (MS) cũng là một phần quan trọng trong quá trình này.
2.4.2 Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp hiệu quả để đánh giá độ tinh khiết của mẫu phân tích Độ tinh khiết cao thể hiện qua sự xuất hiện của một vết duy nhất, trong khi sự hiện diện của vết phụ cho thấy chất lượng thấp hơn Chất càng tinh khiết thì vết phụ càng ít hoặc không có.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để xác định chính xác số lượng tạp chất và ước lượng tỷ lệ tạp chất dựa trên tỷ lệ phần trăm diện tích pic.
2.4.3 Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn
2.4.3.1 Xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng
Để xây dựng chỉ tiêu chất lượng cho CCĐC, cần căn cứ vào tính chất lý - hóa của nguyên liệu và thiết lập các chuẩn cùng với các chỉ tiêu chất lượng thông thường Việc này giúp định hình các chỉ tiêu chất lượng cần thiết cho CCĐC một cách hiệu quả.
- Xây dựng phương pháp đánh giá:
CC, SiO 2 , grad n-hexan/axeton 100:0, 50:1, 25:1, 9:1, 4:1, 2:1
CC, SiO 2 , grad n-hexan/axeton 100:0, 50:1, 25:1, 9:1, 4:1, 2:1
CC, SiO 2 , grad n-hexan/etylaxetat: 6/1
▪ Tham khảo DĐVN và các dược điển quốc tế để lựa chọn phương pháp phù hợp đánh giá các CTCL
▪ Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng và xác định tạp chất
Để tìm các điều kiện sắc ký phù hợp cho các hợp chất chiết xuất từ dược liệu, cần dựa vào công thức phân tử và cấu trúc hóa học của chúng Các yếu tố quan trọng bao gồm bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử và dung môi pha mẫu.
▪ Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu:
- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính (Linearity and range)
- Độ đúng (Accuracy): Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn và tính thông qua tỷ lệ thu hồi:
Hàm lƣợng thực cho vào
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ
- Sự phù hợp của hệ thống sắc kí (System suitability)
2.4 3.2 Qui trình thiết lập và phân tích đánh giá chất chuẩn Đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
Nguyên liệu dùng để thiết lập chất chuẩn bao gồm các hợp chất chiết xuất từ dược liệu, với độ tinh khiết đạt trên 95,0% Việc áp dụng phương pháp phân tích đã được thẩm định là cần thiết để đánh giá xem nguyên liệu có đáp ứng yêu cầu chất lượng hay không.
- Định tính: Tiến hành phương pháp đo phổ IR, NMR hoặc phối hợp thêm phương pháp HPLC
- Xác định độ tinh khiết: Sử dụng một trong các phương pháp HPLC, đo điểm chảy hoặc phối hợp
Công thức tính hàm lƣợng tạp chất gần đúng theo tỉ lệ diện tích pic khi áp dụng phương pháp HPLC:
C tap : tỉ lệ phần trăm tạp chất trong mẫu phân tích
S pic : diện tích pic tạp chất
∑S pic : tổng diện tích pic
- Xác định hàm lượng: Sử dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định, tiến hành song song với chất chuẩn liên kết
Công thức tính hàm lƣợng hợp chất chính (theo nguyên trạng): trong đó:
C : hàm lƣợng hoạt chất tính theo phần trăm m chuan : khối lƣợng chất chuẩn liên kết m thu : khối lƣợng mẫu thử
S chuan : diện tích pic của mẫu chuẩn liên kết
S thu : diện tích pic của mẫu thử
V chuan : thể tích pha mẫu chuẩn
V thu : thể tích pha mẫu thử
Phương pháp phân tích hàm lượng acetogenin bằng phương pháp HPLC
Mẫu phải lấy đúng theo quy trình, nguyên tắc
Mẫu phải được lọc qua màng lọc 0,45àm trước khi tiến hành đo
Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vƣợt quá khả năng tách của cột, nếu không sẽ gây ra tắc nghẽn cột
2.5.1.2 Tiến hành đo sắc ký
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào nhà sản xuất và điều kiện sắc ký Nhƣng vẫn phải đảm bảo đúng các nguyên tắc:
- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột
Để thực hiện sắc ký hiệu quả, cần cài đặt đầy đủ các điều kiện như tên mẫu, tỷ lệ dung môi pha động, bước sóng và các thông số cần thiết cho quá trình chạy sắc ký.
2.5.2 Các phương pháp định lượng
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào phương trình cơ bản của phép đo
Để xác định nồng độ C x của chất cần phân tích trong mẫu đo sắc ký, trước tiên cần xây dựng một đường chuẩn bằng cách sử dụng công thức A = k.C và ít nhất 3 mẫu đầu Sau khi có đường chuẩn, giá trị A x sẽ được sử dụng để tính toán nồng độ của chất trong mẫu phân tích.
Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy mẫu đầu có nồng độ của chất X cần xác định là
Để thực hiện phân tích nồng độ, chúng ta sử dụng các mẫu C1, C2, C3, C4, C5 và các mẫu phân tích với nồng độ Cx1, Cx2 Sau khi lựa chọn các điều kiện thích hợp, tiến hành đo nồng độ của chất cần phân tích trong tất cả các mẫu đầu và mẫu phân tích, thu được các giá trị tương ứng A1, A2, A3, Ax1, Ax2 Cuối cùng, lập đồ thị chuẩn A = f(C) để thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ và giá trị đo được.
Phương pháp này rất đơn giản và dễ thực hiện, đặc biệt phù hợp cho việc phân tích hàng loạt mẫu cùng một chất Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, việc chuẩn bị một dãy mẫu đầu đáp ứng đầy đủ các điều kiện của phương pháp là khó khăn Điều này dẫn đến việc không xác định được vị trí chính xác của đường chuẩn, đặc biệt khi mẫu phân tích có thành phần phức tạp mà chúng ta chưa nắm rõ, từ đó ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả do sự can thiệp của nền và thành phần của mẫu.
Người ta thêm vào mẫu (có khối lượng cố định là E) một lượng xác định m r của chất đã đƣợc chọn làm chất nội chuẩn
Chất nội chuẩn có thể là một chất lạ hoặc một cấu tử đã có sẵn trên sắc đồ Nếu là chất lạ, thời gian lưu của nó cần gần giống với thời gian lưu của cấu tử cần phân tích định lượng Hàm lượng của cấu tử cần xác định được tính toán theo phương pháp nhất định.
Khi sắc đồ không còn chỗ để thêm chất nội chuẩn, phương pháp nội chuẩn được áp dụng bằng cách sử dụng chính cấu tử cần xác định Người ta thêm vào mẫu một lượng cấu tử i đã biết, sau đó so sánh pic của cấu tử I giữa hai sắc đồ trước và sau khi thêm chất nội chuẩn (A i1 và A i2) Đồng thời, sự thay đổi diện tích pic của cấu tử x khác cũng được so sánh (A x1 và A x2).
Hàm lƣợng phần trăm khối lƣợng của cấu tử i cần xác định sẽ là:
Trong trường hợp này, không cần sử dụng hệ số f và cũng không yêu cầu kỹ thuật bơm lặp lại như trong phương pháp ngoại chuẩn Phương pháp này được biết đến với tên gọi là phương pháp thêm.
Phương pháp xác định các chỉ tiêu chất lượng chế phẩm
2.6.1 Xác định độ ẩm của chế phẩm (TCVN 4295: 1986)
- Định nghĩa: Hàm lƣợng ẩm của bột là phầm trăm của khối lƣợng mất đi sau khi sấy ở 102 0 C cho đến khi khối lƣợng bột không thay đổi
- Nguyên tắc: Cân 2-3 gam mẫu, sấy khô mẫu cho đến khối lƣợng không đổi ở
102 0 C ± 2 o C trong khoảng 4h Tiếp tục sấy khô cho đến khi nào khối lƣợng giữa 2 lần sấy không vƣợt quá 0.5mg
+ Sấy khô đĩa và nắp đậy đĩa (không đậy nắp lên đĩa) Và làm nguội trong bình hút ẩm
+ Cân đĩa và nắp và ghi khối lƣợng là (m o ) Cân khoảng 2.5g ± 0.0005g mẫu cho vào đĩa, đậy nắp, cân lại đĩa và ghi khối lƣợng (m 1 )
Đặt đĩa và nắp vào tủ sấy mà không đậy nắp lên dĩa, sau đó sấy trong 2 giờ ở nhiệt độ 102 °C ± 2 °C Sau khi hoàn tất quá trình sấy, đậy nắp lên dĩa và chuyển chúng vào bình hút ẩm để làm nguội, rồi tiến hành cân để ghi lại khối lượng m2.
+ Tiếp tục sấy mẫu (phải mở nắp) trong 1 giờ ở 102 0 C ± 2 o C
+Thực hiện lại bước thứ 3 và cân lại khối lượng (m 2 )
+ Lặp lại bước 4 và 5 đến khi nào sự chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0.5mg thì dừng lại
Hàm lƣợng ẩm đƣợc tính nhƣ sau:
Trong đó: m 0 : khối lƣợng nắp và dĩa (g) m 1 : khối lƣợng nắp + dĩa + mẫu (g) m 2 : khối lƣợng nắp + dĩa + mẫu sau khi sấy khô (g)
2.6.2 Xác định hàm lƣợng tro toàn phần(QCVN 4-21:2011/BYT)
Tro là phần còn lại của thực phẩm sau khi đã đốt cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, chủ yếu bao gồm các loại muối khoáng có trong thực phẩm, vì vậy nó còn được gọi là tro tổng số muối khoáng Để xác định độ tro thật sự, cần loại bỏ các tạp chất như đất và cát, cũng như những chất không phải muối khoáng không cháy ở nhiệt độ quy định.
- Nguyên lý: Dùng sức nóng 550-600 0 C nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro trong thực phẩm
Cân chính xác 5g mẫu tới 0,0002g vào chén nung bằng sứ đã được nung tới khối lượng không đổi và ghi lại khối lượng Sau đó, đậy nắp chén nung và tiến hành đốt sơ bộ trên bếp điện Khi mẫu đã cháy thành than, chuyển chén nung chứa mẫu vào lò nung ở nhiệt độ 600-700°C.
Mẫu tro hóa có màu trắng xám hoặc vàng nhẹ, được lấy bằng kẹp gắp chén nung và đặt trong bình hút ẩm khoảng 40 phút Cần xác định khối lượng chén nung chứa tro của mẫu với độ chính xác lên tới 0,0002g.
- Tính kết quả: hàm lƣợng tro theo phần trăm (X 1 ) tính bằng công thức:
G: Trọng lƣợng của chén tính bằng gam
X1 G 1 : Trọng lƣợng của chén và trọng lƣợng của mẫu thử tính bằng gam
G 2 : Trọng lƣợng của chén và trọng lƣợng tro trắng sau khi đã nung và cân tới trọng lƣợng không đổi tính bằng gam
2.6.3 Xác định hàm lƣợng protein (TCVN – 1: 2009, ISO 8968-1: 2001)
Phần mẫu thử được phân hủy bằng hỗn hợp acid H2SO4 đặc và K2SO4, cùng với CuSO4.7H2O và amoniac Chất lỏng thu được sau quá trình này được chưng cất trong dung dịch acid Boric (H3BO3) dư Cuối cùng, dung dịch này sẽ được chuẩn độ bằng acid HCl.
- Dụng cụ và thiết bị: Cân phân tích độ chính xác 0.0001g, Hệ thống phá mẫu Kjeldahl, Hệ thống chƣng cất, Erlen 250ml, Burret 25ml
- Hóa chất: Acid sulfuric H2SO 4 đậm đặc (tỷ trọng 1.84), Dung dịch chất chỉ thị Metyl đỏ + Bromocresol, Acid boric H 3 BO 3 4% , Acid HCl 0.1N, K 2 SO 4 và CuSO 3.7 5H 2 O
Chuẩn bị mẫu: 0.8g và đối với mẫu trắng: 0.85g saccharose
Cân chính xác 5g xúc tác K 2 SO 4 +CuSO 3.7 5 H 2 O cho vào ống phá mẫu Cẩn thận thêm vào mỗi ống 15ml H2SO 4 đậm đặc
Bật hệ thống phá mẫu trước khi bắt đầu quá trình phá mẫu
Tổng thời gian phá mẫu khoảng 1,5 giờ
Sau khi phá mẫu, hãy để các ống mẫu nguội đến nhiệt độ phòng và thêm khoảng 40 – 50 ml nước, tránh hiện tượng kết tinh Đảm bảo hỗn hợp đạt nhiệt độ phòng trước khi tiến hành chưng cất.
Cho 50ml acid H 3 BO 3 vào bình nón 500ml (có dung dịch chất chỉ thị)
Bật hệ thống chƣng cất Đợi khoảng 5 phút cho máy khởi động Sau khi hệ thống đã chuẩn bị thì màn hình điều khiển sẽ hiện lên “Vapodest 20s Standby”
Đặt ống phá mẫu và bình nón đúng vị trí trong hệ thống chưng cất, đảm bảo ống khớp chính xác với máy Sau đó, đóng cửa an toàn lại.
Trên màn hình sẽ hiển thị và chọn chế độ chƣng cất
Ta lấy bình nón ra để chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0.1N Và đọc thể tích HCl sử dụng (V)
V : thể tích HCl tiêu tốn khi chuẩn mẫu blank (ml)
V: thể tích HCl tiêu tốn khi chuẩn mẫu (ml) N: nồng độ đương lượng HCl (N) m: khối lƣợng mẫu cân (g) k= 6.38: hệ số chuyển đổi từ tổng N sang protein thô
2.6.4 Xác định hàm lƣợng lipid(TCVN 4295: 1986)
Phương pháp dựa trên nguyên tắc chiết lipit ra khỏi mẫu bằng dung môi hữu cơ ête etylic
- Dụng cụ, thiết bị và hoá chất:
+ Cân phân tích có độ chính xác 0,0001;
Cân 2-3 g chính xác tới 0,0001g vào ống giấy lọc hình trụ bịt kín một đầu và có kích thước phù hợp với bộ Soxhlet Đầu trên ống giấy lọc chứa mẫu đặt một ít bông đã khử lipit Chiều cao của ống giấy lọc chứa mẫu phải thấp hơn ống hồi lưu ete của bộ cất Soxhlet Đặt ống giấy chứa mẫu vào phần giữa của bộ soxhlet, lắp bình cầu khô, sạch và đã được xác định khối lượng ở phía dưới, đổ dietylete ngập ống giấy chứa mẫu và cao hơn ống hồi lưu Bộ Soxhlet được lắp trên máy chưng cách thuỷ Điều chỉnh nhiệt độ máy cách thuỷ sao cho có từ 6 đến 8 lần ete luân chuyển qua mẫu trong 1 giờ
Quá trình chiết lipid hoàn tất khi giọt dietylete từ ống hồi lưu chảy xuống mà không làm loang giấy lọc sau khi ete đã bay hơi hoàn toàn Tiến hành cất thu hồi ete etylic trong bình cầu, sau đó đặt bình cầu vào tủ sấy ở nhiệt độ 100-105 °C và sấy cho đến khi khối lượng không đổi Sau 30 phút để nguội trong bình hút ẩm, cân bình cầu để xác định hàm lượng lipid có trong mẫu.
Hàm lƣợng lipit có trong mẫu tính bằng phần trăm khối lƣợng (X 9 ) theo công thức:
Trong đó m 1 : Khối lƣợng của bình cầu chứa hàm lƣợng lipit của mẫu, tính bằng g; m 0 : Khối lƣợng bình cầu tính bằng g; m: Khối lƣợng mẫu tính bằng g
Kết quả được tính bằng trung bình cộng của hai lần xác định đồng thời, với việc chú ý đến số lẻ thứ nhất Sai lệch giữa hai lần xác định không được vượt quá 0,5%.
2.6.5 Xác định hàm lƣợng hydrat carbon (H.HD.QT.162)
- Dụng cụ thiết bị và hoá chất:
+ Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g;
+ Máy hút chân không hoặc bộ hút chân không bằng vòi nước;
+ Bình định mức dung tích 200 hoặc 250 ml;
+ Bình cầu dung tích 200 hoặc 250 ml;
+ Ống sinh hàn dài 30-40 cm;
+ Natri sunfat (Na 2 SO 4 ), dung dịch bão hoà
+ Dung dịch fehling A: 40g sunfat đồng ngậm 5 phân tử nước hoà trong 1 lít nước cất (CuSO 3.7 5H 2 O);
+ Dung dịch fehling B: 200g kali natri tactrat, 15g natrihydroxyt tinh thể hoá trong 1 lít nước cất;
+ Dung dịch sắt sunfat: 50g sắt sunfat ngậm 9 phân tử nước (Fe 2 (SO 4 ).9H 2 O); + 200g axit sunfuaric đậm đặc (96-98%), tất cả hoà trong nước cất để đủ một lít dung dịch
+ Kali pemanganat (KMnO 4 ) dung dịch 0,1N
Cân chính xác 2g mẫu với độ chính xác 0,0001 g và cho vào bình cầu 250 ml Thêm 50 ml nước cất và 5 ml HCl đặc (d=1,19) vào bình, sau đó lắp ống sinh hàn thẳng đứng trên bình cầu Bình cầu được ngâm trong nước của máy cách thủy và đun sôi.
3 giờ để thuỷ phân gluxit của mẫu Để nguội và trung hoà lƣợng axit dƣ bằngdung dịch NaOH 20%
Chuyển toàn bộ lƣợng mẫu đã đƣợc thuỷ phân sang bình định mức dung tích
Để thực hiện quá trình kết tủa, thêm từ 5 đến 10 ml dung dịch Pb(CH3COO)2 10% vào bình định mức chứa 250 ml mẫu đã được thủy phân Sau đó, lắc đều và để yên cho dung dịch lắng trong hoàn toàn Tiếp theo, cho dung dịch bão hòa Na2SO4 vào bình để loại bỏ lượng Pb(CH3COO)2 dư thừa, kiểm tra bằng cách cho chảy một giọt dọc theo thành bình.
Na 2 SO 4 bão hoà mà không làm đục lớp trên của dung dịch mẫu là được) Thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều và để lắng trong Lọc dung dịch mẫu sang một bình tam giác khô sạch, đậy kín để tiến hành phân tích Dùng pipet hút 20 ml dung dịch mẫu cho vào bình tam giác khô sạch cho thêm vào bình 20ml dung dịch fehling A và 20 ml dung dịch fehling B, lắc đều và đun trên bếp điện Đun sôi dung dịch 3 phút, nếu thấy dung dịch mất mầu xanh đồng sunfat thì làm lại với lƣợng dung dịch mẫu nhỏ hơn sao cho dƣ thừa dung dịch pheling A và B để kết tủa Cu 2 O Để nghiêng bình cho kết tủa lắng hoàn toàn, gạn nhẹ nhàng lọc kết tủa qua phễu xốp số 4 sao cho kết tủa đồng I oxit lên phễu càng ít càng tốt Rửa kết tủa còn lại trong bình và trên phễu bằng nước cất đun sôi cho hết kiềm Hoà tan kết tủa trong bình và trên phễu bằng dung dịchFeSO3.7.
Chuẩn độ dung dịch bằng KMnO4 0,1 N đến khi xuất hiện mầu hồng bền trong
Hàm lƣợng gluxit tính bằng phần trăm khối lƣợng (X 10 ) theo công thức:
Trong đó: a: Số miligam đường khử tra theo bảng dựa trên số ml dung dịch kali permanganat 0,1N dùng chuẩn độ;
V 1 : Thể tích dung dịch đã thuỷ phân gluxit tính bằng ml;
V 0 : Thể tích định mức dung dịch mẫu tính theo khối lƣợng mẫu; m: Khối lƣợng mẫu tính bằng g;
0,9: Hệ số tính chuyển mono saccarit thành gluxit;
1000: Hệ số chuyển đổi đơn vị mg ra g
Kết quả thử là trung bình cộng của ba thí nghiệm lặp lại đồng thời và tính tới số lẻ thứ nhất
Sự sai khác giữa các thí nghiệm không đƣợc vƣợt quá 0,5%
2.6.6 Xác định giới hạn các kim loại nặng:
2.6.6.1 Xác định hàm lượng chì ( AOAC.999.10:2002)
Chuẩn bị dung dịch thử
Để tiến hành phân tích, cân chính xác 0,5 g chế phẩm vào cốc teflon Sau đó, thêm 5 ml acid nitric 65% và 1 ml nước oxy già 30% vào cốc Đậy kín cốc và đặt vào thiết bị vô cơ hóa mẫu bằng vi sóng Cuối cùng, vận hành thiết bị theo chương trình nhiệt độ và áp suất đã định sẵn.
Thời gian (phút) Nhiệt độ ( 0 C) Công suất (W)
1 15 Từ nhiệt độ phòng tới 120 1000
Sau khi hoàn tất quá trình vô cơ hóa, cần điều chỉnh nhiệt độ trong cốc teflon về mức nhiệt độ phòng thí nghiệm bằng cách thêm 20 ml nước Tiến hành lắc và lọc dung dịch vào bình định mức 50 ml Rửa cốc teflon bằng 20 ml nước và kết hợp dịch rửa vào bình định mức Cuối cùng, thêm nước đến vạch định mức và lắc đều để tạo thành dung dịch A.
Thử hoạt tính sinh học của các sản phẩm cao chiết chứa hoạt chất acetogenin
Các hợp chất phân lập từ lá na đƣợc thử các hoạt tính gây độc tế bào của các trên các dòng tế bào ung thư ở người gồm:
+ Dòng MCF-7 (ung thƣ vú)
+ Dòng NTUB1 (ung thƣ bàng quang )
Phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993) đang được áp dụng tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) và Trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago.
Cancer cell lines are cultivated in suitable culture media enriched with L-glutamine, sodium pyruvate, NaHCO3, and a combination of penicillin-streptomycin sulfate and fungizone (PSF) Additionally, non-essential amino acids (NAA) and 10% bovine calf serum (BCS) are included The process also utilizes trypsin-EDTA at 0.05%, dimethyl sulfoxide (DMSO), trichloroacetic acid (TCA), Tris base, phosphate-buffered saline (PBS), sulforhodamine B (SRB), and acetic acid.
Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau
Tiến hành thử độc tế bào:
- Cho 200 L dung dịch tế bào pha loãng ở nồng độ 3.10 4 tế bào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI (Dulbecco‟s Modified Eagle Medium)
1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, môi trường DMEM (Minimum Essential Medium with Eagle‟s salt) cho dòng tế bào Lu
Giếng điều khiển dương chứa 200 L dung dịch tế bào với nồng độ 3.10^4 tế bào/mL Để kiểm tra khả năng diệt tế bào, Ellipticine (Sigma), Vinblastine hoặc Taxol được pha trong DMSO và sử dụng làm chất chuẩn đối chứng âm Tất cả được ủ ở nhiệt độ 37 độ C với 5% CO2.
3 ngày, thêm 50 L MTT (1 mg/mL pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ ở 37 0 C trong 4 giờ
- Loại bỏ môi trường, thêm 100 L DMSO, lắc đều, đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515nm
Giá trị sống sót của tế bào (CS) được xác định bằng tỷ lệ phần trăm khả năng sống sót của tế bào ở một nồng độ chất thử nhất định so với mẫu đối chứng Để tính toán giá trị CS (%), chúng ta sử dụng kết quả đo OD (ngày 0) và OD của mẫu trộn với DMSO 10%.
OD (mẫu) – OD (ngày 0) CS% = x 100
Giá trị CS% được tính toán theo công thức từ OD (DMSO) vào ngày 0 và sau đó được nhập vào Excel để xác định % trung bình cùng với độ lệch tiêu chuẩn của ba phép thử lặp lại, theo công thức của Ducan Độ lệch tiêu chuẩn được ký hiệu là .
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ đƣợc chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50 được xác định bằng cách sử dụng giá trị CS của 10 nồng độ khác nhau, dựa vào chương trình Table Curve Phương pháp này dựa trên biểu đồ logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ của chất thử để tính toán giá trị IC50 chính xác.
Công thức: 1/Y = a + blnX Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%)
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được thực hiện theo phương pháp của Cristiani Bürger và cộng sự (2005), Pillaia G và cộng sự (2011), Ramaswamy S R và cộng sự (2012) Nghiên cứu này bao gồm việc theo dõi sự thay đổi của lông, khả năng thu nhận thức ăn, khả năng di chuyển so với lô đối chứng, cũng như phân tích sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm Đồng thời, nghiên cứu cũng đánh giá ảnh hưởng của thực phẩm chức năng AMF3 dưới dạng viên nang đến một số chỉ tiêu huyết học và enzym chức năng gan, thận.
Nghiên cứu sử dụng thực phẩm chức năng AMF3 dưới dạng viên nang, mỗi viên chứa các thành phần như bột đạm thủy phân (150mg), bột khoai tây (100mg), canxi stearat (150mg), axit ascorbic (10mg), đường glucose (85mg) và curcumin (5mg) Đối tượng thí nghiệm là chuột thuần chủng dòng BALB/c khỏe mạnh, không mắc bệnh, được nuôi tại khu vực nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học và được cung cấp thức ăn tiêu chuẩn cùng nước uống tự do.
Dụng cụ thí nghiệm : kim cong đầu tù dùng để cho uống hoạt chất và các thiết bị phụ trợ khác
Thiết bị : Cân phân tích, một số thiết bị khác
60 chuột BALB/c khoẻ mạnh, nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học, đƣợc chia làm 6 lô (10 chuột/lô)
Lô 1: uống nước cất (dung dịch hòa mẫu) 0,3ml/con/ngày
Lô 2: uống thực phẩm chức năng AMF3 ở nồng độ 1000mg/kgP/ngày, với thể tích 0,3ml/con/ngày
Lô 3: cho uống thực phẩm chức năng AMF3 ở nồng độ 1500mg/kgP/ngày, với thể tích 0,3ml/con/ngày
Lô 4: cho uống thực phẩm chức năng AMF3 ở nồng độ 2000 mg/kgP/ngày, với thể tích 0,3 ml/con/ngày
Lô 5: cho uống thực phẩm chức năng AMF3 ở nồng độ 2500 mg/kgP/ngày, với thể tích 0,3 ml/con/ngày
Lô 6: cho uống thực phẩm chức năng AMF3 ở nồng độ 3000 mg/kgP/ngày, với thể tích 0,3 ml/con/ngày
Thời gian cho uống là41ngày
2.8.3 Theo dõi dõi biểu hiện bên ngoài của động vật thí nghiệm
Trong quá trình thí nghiệm, chuột được theo dõi các biểu hiện bên ngoài như trạng thái lông, khả năng di chuyển, khả năng thu nhận thức ăn, hiện tượng đi ỉa, và phản xạ với ánh sáng, âm thanh Ngoài ra, khối lượng chuột thí nghiệm được kiểm tra 1 tuần/lần, bắt đầu từ thời điểm cho uống thực phẩm chức năng AMF3 (ngày 0), nhằm theo dõi sự tăng trưởng khối lượng và đánh giá tính độc hại (nếu có) trong suốt quá trình cho uống bán trường diễn.
Hình 2.1 Ảnh chuột thí nghiệm
2.8.4 Theo dõi sự thay đổi khối lƣợng của động vật thí nghiệm
Trong quá trình thí nghiệm, chuột được theo dõi khối lượng cơ thể 1 tuần/lần, bắt đầu từ thời điểm cho uống thực phẩm chức năng AMF3 (ngày 0), nhằm đánh giá tính độc hại (nếu có) khi sử dụng liên tục trong thời gian dài.
2.8.5.Nghiên cứu ảnh hưởng của AMF3 đến một số chỉ tiêu huyết học, sinh hoá máu
Sau khi thực hiện thí nghiệm, máu của toàn bộ động vật được lấy để tiến hành xét nghiệm các chỉ tiêu huyết học như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và hemoglobin Đồng thời, các chỉ tiêu hóa sinh như enzyme creatine phosphokinase (CPK), serum glutamic oxaloacetic transaminase (SGOT) và serum glutamic purivic transaminase (SGPT) cũng được kiểm tra để đánh giá chức năng gan và thận, theo phương pháp của Pillaia G (2011).
2.8.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của TPCN AMF3 đến các cơ quan nội tạng
Sau khi hoàn thành thí nghiệm, động vật được tiến hành mổ giải phẫu để kiểm tra trực quan các nội tạng và thực hiện so sánh với nhóm đối chứng không sử dụng thực phẩm chức năng AMF3.
Phương pháp thử độc tính cấp tính của thực phẩm chức năng AMF3
Phương pháp thử độc tính cấp dựa trên việc sử dụng các mức liều khác nhau của chất thử nghiệm trong các nhóm động vật khác nhau Mỗi nhóm sẽ nhận một mức liều cụ thể, bắt đầu từ nhóm 1 với liều thấp nhất và tăng dần ở các nhóm tiếp theo Việc ghi nhận số lượng động vật tử vong trong mỗi nhóm, cùng với sự khác biệt giữa các liều và số lượng tử vong, là các thông số quan trọng trong phương pháp thử độc cấp (Dodehe Yeo và cộng sự, 2012).
Trong nghiên cứu của chúng tôi, độc tính cấp được thực hiện theo phương pháp của Dodehe Yeo và cộng sự (2012), N’dia Kouadio Frédéri và cộng sự (2013), cùng với Aristide Traore và cộng sự (2014).
Bảy mươi chuột nhắt trắng dòng BALB/c, mỗi con nặng khoảng 22-24 gram, được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn tại Viện Công nghệ sinh học Chúng được chia thành 7 lô, mỗi lô gồm 10 chuột, và bị bỏ đói hoàn toàn trong 16 giờ trước khi được cho uống thực phẩm chức năng AMF3 với các nồng độ khác nhau từ 0.0 g/kgP (đối chứng sinh lý) đến 20 g/kgP Liều tối đa cho chuột là 20 g/kgP, tương ứng với thể tích dạ dày của chúng Sau khi uống, chuột được nuôi dưỡng bình thường và theo dõi trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô và tính giá trị LD50.
Công thức tính giá trị LD 50
Xác định LD 50 được tiến hành theo phương pháp của Karber (trích theo Dodehe Yeo và cộng sự, 2012 và trích theo Shetty Akhila J và cộng sự, 2007) nhƣ sau:
Liều chết 50% động vật thí nghiệm Liều gây chết 100% động vật thí nghiệm
Số động vật trong một nhóm
Sự khác biệt về liều giữa hai liều liên tiếp
Tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp
2.10 Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu được phân tích bằng Excel, sử dụng các thuật toán thống kê như Student's t-test, F-test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) để kiểm tra sự khác biệt có ý nghĩa so với nhóm đối chứng âm Kết quả với p