Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào cây hoa lily sorbone nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Mục ủớch- yờu cầu

Mục ủớch

Xác định các thông số kỹ thuật cho từng bước trong quy trình chuyển gen mục tiêu bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là rất quan trọng Điều này tạo nền tảng cho việc phát triển cây chuyển gen với các đặc tính mong muốn.

Yêu cầu

- Xỏc ủịnh ủược nồng ủộ Cefotacime chọn lọc

- Xỏc ủịnh ủược nồng ủộ PPT sử dụng ủể chọn lọc

- Xỏc ủịnh ủược phương phỏp lõy nhiễm vi khuẩn và thời gian ủồng nuôi cấy thích hợp

- đánh giá sự biểu hiện của các gen sau chuyển nạp.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu cho thấy khả năng chuyển gen vào cây hoa lily Sorbonne, một loại cây thuộc nhóm một lá mầm, bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Các thông số kỹ thuật được xác định sẽ tạo điều kiện cho việc tiếp tục chuyển các gen mong muốn khác vào cây hoa lily Sorbonne cũng như các loại cây hoa lily khác.

Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu về việc ứng dụng phương pháp mới trong việc tạo giống cây trồng chuyển gen mang đặc tính mong muốn đã được thực hiện, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống cây hoa lily tại Việt Nam.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 1 ðối tượng, vật liệu, ủịa ủiểm và thời gian nghiờn cứu

ðối tượng

Giống lily Oriental hybrid Sorbonne

Hình 3.1 Ảnh hoa lily Sorbonne

Vật liệu

- Callus, tiền chồi, ủỉnh sinh trưởng

Agrobacterium tumefaciens EHA1300 carries the pPTN289 transfer vector, which is approximately 11.7 kb in size The pPTN289 vector includes the gus intron marker gene and the bar gene, provided by the University of Nebraska, USA.

- Chủng vi khuẩn mang gen chỉ thị Gus, gen BAR (gen kháng thuốc trừ cỏ), gen cryIAc (gen kháng sâu)

- Vectơ Plasmid Green 0229 chứa gen gus do GS.TS Tacobsen, trường ủại học tổng hợp Hanove Cộng hòa liên bang ðức Chủng vi khuẩn

A.tumefaciens Vectơ Plasmid Green 0229 chứa gen gus EHA105 mang hệ thống vector kép gồm 2 plasmid:

+ Plasmid Green 0229 chứa gen gus

+ Plasmid Soup (Plasmid trợ giúp)

Vectơ được sử dụng để chuyển các gen mục tiêu, cụ thể là chủng EHA 105 mang vectơ ITB2c, chứa các gen gus, bar và cry IAc, do Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM - VKHVN cung cấp.

ðịa ủiểm, thời gian

Viện sinh học nụng nghiệp – Trường ủại học Nụng nghiệp Hà Nội b Thời gian

Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng:

Ph ươ ng pháp nuôi c ấ y vi khu ẩ n

Nguồn vi khuẩn: Vi khuẩn ủược lưu giữ trong tủ lạng -80 o C

Cao nấm men 5,0g/lít pH 7,0

Nuôi cấy ở 28 o C, 24 giờ lắc 200 vòng/phút

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: môi trường LB lỏng, nuôi 24 giờ ở 28 o C lắc 200 vòng/phút

Dịch vi khuẩn ủược lý tõm ủể lấy sinh khối tế bào vi khuẩn ở tốc ủộ

4000 vũng/phỳt trong 5 phỳt ở ủiều kiện nhiệt ủộ phũng và ủược pha trong môi trường pha loãng vi khuẩn

Hỡnh 3.2 Sơ ủồ cấu trỳc plasmid ITB2c

- Phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Cỏch 1: Mẫu cấy ủược nhỳng vào dung dịch vi khuẩn trong thời gian từ 5 phỳt sau ủú vớt ra, ủể khụ trờn giấy thấm vụ trựng

Cỏch 2: Mẫu cấy ủược cấy trờn mụi trường nhiễm sau ủú dựng Micropipet hỳt dịch vi khuẩn trờn nhỏ vào mẫu, mỗi mẫu cấy chỉ nhỏ 10àl dung dịch vi khuẩn

- Phương phỏp xỏc ủịnh kết quả

Mẫu cấy ủược rửa sạch vi khuẩn sau ủú ủược bỏ vào cỏc ống effendoff Cú mẫu ủối chứng õm

Bổ sung X-GLUC ủến khi ngập mẫu

Phủ kín bản mẫu bằng giấy nhôm Ủ qua ủờm ở nhiệt ủộ 37 0 C, ủiều kiện tối

Bổ sung dung dịch phá cấu trúc chlorophyll(cồn), lắc nhẹ, ngâm khoảng 15-60 phút ðến khi thấy mẫu có mầu trắng (hết chlorophyll)

Soi mẫu dưới kớnh ủể quan sỏt sự nhuộm mầu GUS

Nếu cú sự chuyển gen và gen ủú ủược biểu hiện thỡ tại vị trớ mà tế bào ủú ủược chuyển gen sẽ cú mầu xanh chàm ủặc trưng

Nếu khụng cú gen ủược biểu hiện thỡ mẫu cấy sẽ khụng cú mầu xanh chàm

- Chuẩn bị dung dịch X-Gluc

Pha 100mg X-Gluc trong 9,6 ml N,N-dimethyl formamide (DMF) ủể ủược dung dịch mẹ X-Gluc cú nồng ủộ 20mM (10,42mg/ml)

- Cỏch pha dung dịch ủệm 1M NaPO

4 , pH =7,0 ðể pha dung dịch Na

4 cú nồng ủộ 1M cần cõn 35,49 g pha trong nước cất sau ủú lờn thể tớch lờn 250ml ðể pha dung dịch NaH

2O cú nồng ủộ 1M cần cõn 34,50 g pha trong nước cất sau ủú lờn thể tớch lờn 250ml ðể toàn bộ 250 ml dung dịch Na

4 cú nồng ủộ 1M, chỉnh pH ủến 7,0 bằng dung dịch NaH

2O cú nồng ủộ 1M (cần khoảng 120 – 130 ml dung dịch NaH

Vi khuẩn cần được rửa bằng nước cất hoặc môi trường MS trước khi cấy Quá trình rửa mẫu nên được thực hiện 2-3 lần, với thao tác nhanh chóng trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút cho mỗi lần rửa Điều này giúp đảm bảo độ chính xác và tránh nhiễm tạp.

Cặp mồi sử dụng là 35S

Quy trình PCR bao gồm các bước sau:

Khởi đầu quá trình bằng cách ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 96°C trong 5 phút để đảm bảo sợi DNA và mồi được làm nóng DNA-Polymerase có thể được thêm vào trong giai đoạn khởi đầu hoặc ngay sau bước này.

Biến tính (Melting) 96°C trong 30 giây ðối với mỗi chu kì thì lượng thời gian này là ủủ ủể biến tớnh DNA

Gắn mồi (Annealing) 68°C trong 30 giây

Kéo dài (Elongation).72°C trong 45 giây

Cỏc bước từ 2 ủến 4 ủược lặp lại 25 lần, tuy nhiờn với mồi và polymerase tốt, 15 ủến 20 chu kỳ cú thể là ủủ

Giữ hỗn hợp ở 7°C Tại nhiệt ủộ này DNA sẽ ko bị hư hại trong vũng 1 ủờm

3.2.2 Các chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ mẫu mọc khuẩn (%) = x100%

∑ số mẫu sống sau diệt khuẩn

Tỷ lệ sống sau diệt khuẩn (%) = x 100%

∑ số mẫu sau rửa khuẩn

∑ số mẫu biểu hiện gen gus

Tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus (%) = x 100%

∑ số mẫu ủem kiểm tra

∑ số mẫu sống sau chọn lọc

Tỷ lệ mẫu sống sau CL (%) = x 100%

∑ số mẫu ủưa vào chọn lọc

∑ số mẫu TS sau chọn lọc

Tỷ lệ mẫu TS sau CL (%) = x 100%

∑ số mẫu sống sau chọn lọc Σ Chồi thu ủược

Để tính số chồi trung bình trên mỗi mẫu, ta sử dụng công thức: Số chồi trung bình/mẫu = Σ Mẫu sống sau CL / Σ chiều cao chồi khoẻ thu được sau CL Chiều cao trung bình được tính bằng cách chia tổng chiều cao chồi khoẻ (cm) cho tổng số chồi khoẻ thu được sau CL, đồng thời cũng cần tính tổng số lá trên chồi khoẻ sau CL.

Số lá TB (lá/chồi) ∑ số chồi khoẻ thu ủược sau CL

Cách bố trí thí nghiệm

Thớ nghiệm ủược bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại

3.3.22 33 TThhớớ nngghhiiệmệm 11:: ThThớớ nngghhiiệệmm vvềề xxỏỏcc ủủịịnnhh nnggưưỡỡnngg PPPPTT cchhọọnn llọọcc

Cụng thức Nồng ủộ PPT (mg/l) Ghi chỳ

1 (ðC) 0 Lượng mẫu: 200 mẫu/công thức

3.2.4 Thớ nghi ệ m 2: TThhớớ nngghhiiệmệm vvề ề xxỏỏcc ủịủịnnhh nnồnồngg ủộủộ cceeffoottaacciimmee ddiiệtệt kkhhuuẩnẩn

Cụng thức Nồng ủộ Cefotacime (mg/l) Ghi chỳ

Lượng mẫu: 200 mẫu/công thức

3.2.5 Thớ nghiệm 3: Ảnh hưởng của dạng mẫu cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Công thức Nguồn mẫu cấy Ghi chú

1 ðối chứng (không lây nhiễm với vi khuẩn) Vi khuẩn mang gen TU

Lây nhiễm:ngâm trong dịch vi khuẩn 5 phút

3 Tiền chồi Lượng mẫu: 200 mẫu/công thức

3.2.6 Thớ nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian lõy nhiễm mẫu ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Thời gian lây nhiễm Ghi chú

1 ðối chứng (không lây nhiễm với vi khuẩn) Vi khuẩn mang gen TU

2 Ngâm mẫu trong dung dịch 5 phút Mẫu: Tiền chồi

3 Ngâm mẫu trong dung dịch 10 phút Lượng mẫu: 200 mẫu/công thức

4 Ngâm mẫu trong dung dịch 15 phút Rửa khuẩn sau 3-5 ngày

5 Ngâm mẫu trong dung dịch 20 phút

3.2.7 Thớ nghiệm 5: Ảnh hưởng của phương thức lõy nhiễm cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Công thức Phương thức lây nhiễm Ghi chú

1 ðối chứng (không lây nhiễm với vi khuẩn)

Nguồn mẫu: tiền chồi ủó tiền nuụi cấy 3 ngày (CT4)

2 Cắt mẫu trong dung dịch vi khuẩn Vi khuẩn mang gen TU

3 CT2: Mẫu ủược cấy trong mụi trường ðNC sau ủú nhỏ giọt vi khuẩn

4 Cắt mẫu trờn giấy thấm sau ủú ngõm

5 phút trong dung dịch vi khuẩn Lượng mẫu: 200 mẫu/công thức

5 Căt mẫu trong môi trường ðNC sau ủú ngõm vào dịch vi khuẩn 5 phỳt

3.2.8 Thớ nghiệm 6: Ảnh hưởng của thời gian tiền nuụi cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Công thức Thời gian tiền nuôi cấy (ngày)

2 2 Vi khuẩn mang gen TU

3 3 Lượng mẫu: 200 mẫu/công thức

4 4 Lây nhiễm: ngâm trong dung dịch vi khuẩn 5 phút

3.2.9 Thớ nghiệm 7: Ảnh hưởng của thời gian ủồng nuụi cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Cụng thức Thời gian ủồng nuụi cấy (ngày) Ghi chỳ

Nguồn mẫu: tiền chồi ủó tiền nuụi cấy 3 ngày

2 1 Vi khuẩn mang gen TU

3 3 Lây nhiễm: ngâm trong dịch vi khuẩn 5 phút

4 5 Lượng mẫu: 200 mẫu/công thức

3.2.10 Thớ nghiệm 8: Ảnh hưởng của cỏc loại vộc tơ ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Công thức Vector Ghi chú

Nguồn mẫu: tiền chồi ủó tiền nuụi cấy 3 ngày

3 Vector mang gen gus và bar Lây nhiễm: ngâm trong dịch vi khuẩn 5 phút Lượng mẫu: 200 mẫu/công thức

4 Vector mang gen gus, ba vàr cry IAc

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 1 Ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT 39 2 Ảnh hưởng của khỏng sinh Cefotacime ủến tỷ lệ sống và khả năng tỏi

Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn

Để nghiên cứu ảnh hưởng của dạng mẫu cấy, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với ba dạng mẫu: callus, tiền chồi và ủỉnh sinh trưởng, cùng với mẫu đối chứng không bị nhiễm vi khuẩn Kết quả cho thấy cả ba loại mẫu đều không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn, với 100% mẫu mọc khuẩn và khuẩn lạc xuất hiện ở tất cả các công thức có nhiễm vi khuẩn Vectơ sử dụng trong thí nghiệm mang gen Bar kháng PPT, một hoạt chất chính trong thuốc trừ cỏ có nguồn gốc từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus PPT ức chế enzym tổng hợp glutamine, dẫn đến sự tích lũy ammoniac trong tế bào, làm cây nhanh chết Gen Bar kháng PPT mã hóa cho enzym Phosphinthricin acetyltransferase, giúp chuyển đổi PPT từ dạng ức chế sang dạng acetyl hóa, không còn gây độc cho cây.

Khi chuyển các mẫu sang môi trường có chứa PPT, các mô tế bào không được chuyển gen Bar sẽ bị chết, trong khi các mẫu được chuyển gen sẽ tiếp tục sống và tái sinh Kết quả theo dõi mẫu cấy trên môi trường có chứa PPT cho thấy toàn bộ mẫu ở cụng thức ủối chứng đều chết sau khi chọn lọc Trong ba dạng mẫu còn lại, tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất ở tiền chồi với 64,92%, so với callus (53,03%) và ủỉnh sinh trưởng (60,11%) Tổng số chồi khỏe thu được sau chọn lọc là 19, cao hơn nhiều so với hai dạng mẫu còn lại Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi đạt 23,27%, trong khi callus chỉ đạt 12% và ủỉnh sinh trưởng đạt 14,31% Tỷ lệ mẫu tỏi sinh sau chọn lọc cũng đạt cao nhất 46,22%, trong khi callus chỉ đạt 41% và ủỉnh sinh trưởng đạt 45%.

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens (sau 8 tuần)

Tăng trưởng chồi tái sinh

Số chồi khỏe có lá dài hơn 5mm

Công thức Biểu hiện của

Tỷ lệ sống sau lây nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc (%)

Tỷ lệ mẫu tái sinh sau chọn lọc (%)

Số chồi/ cụm chồi Tổng số chồi khỏe thu ủược

Số lá Chiều dài lá (cm) ðC (Calus) ++ 100 0 0 0 0 0 0

Tiền chồi ++ 64.92 23.27 46.22 4.6 19 1.95 9.6 ðC (ðST) ++ 100 0 0 0 0 0 0 ðST ++ 60.11 14.31 45 2.6 5 1.2 7.1

Ghi chú: Thời gian tiền nuôi cấy 3 ngày, ðST: ðỉnh sinh trưởng

Ảnh hưởng của thời gian lõy nhiễm mẫu ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Trong thí nghiệm chuyển gen bằng vi khuẩn, thời gian lây nhiễm đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến sức sống và khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào mẫu Nếu thời gian lây nhiễm ngắn, vi khuẩn không có đủ thời gian để xâm nhập vào tế bào và sẽ chết sau khi diệt khuẩn Ngược lại, nếu thời gian lây nhiễm quá dài, lượng vi khuẩn xâm nhập vào tế bào sẽ quá lớn, gây ảnh hưởng đến sức sống và khả năng tái sinh của tế bào Thí nghiệm được thực hiện với 5 cụm thức: CT1 (đối chứng không nhiễm khuẩn), CT2 (ngâm trong dịch vi khuẩn 5 phút).

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu về luận văn thạc sỹ trong lĩnh vực khoa học nông nghiệp Kết quả thí nghiệm cho thấy các mẫu CT4, CT5 được ngâm trong dịch vi khuẩn với thời gian khác nhau (CT4 trong 15 phút và CT5 trong 20 phút) đã cho những kết quả đáng chú ý, được thể hiện trong bảng 4.4.

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian lõy nhiễm mẫu ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens (sau 8 tuần)

Công thức Biểu hiện của

Số lá Chiều dài lá (cm)

Ghi chú: CT1 (ðC): Không lây nhiễm vi khuẩn

(+): Khuẩn mọc nhẹ (++): Khuẩn mọc vừa phải (+++): Khuẩn mọc rất nhiều Thời gian tiền nuôi cấy 3 ngày

Theo bảng 4.4, kết quả cho thấy ở cụng thức ủối chứng, 100% mẫu bị chết sau khi chọn lọc Trong CT2, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi cao đạt 66,72%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc là 17,84% và tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 46,22% Ở CT3, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi cao là 64,92%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc đạt 23,27% và tỷ lệ tái sinh là 28,83% CT4 có tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi cao là 60,11%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc đạt 14,31% và tỷ lệ tái sinh là 45% Trong CT5, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi cao là 53,03%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc là 12% và tỷ lệ tái sinh đạt 41,07% Về chỉ tiêu số chồi/cụm chồi, CT2 cũng vượt trội với 4,78% và số chồi khỏe thu được là 19 chồi, cho thấy CT2 là lựa chọn tốt nhất để vi khuẩn có thể xâm nhập hiệu quả vào mẫu vật.

Biểu đồ 4.3 minh họa ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm mẫu đến tỷ lệ sống sót sau lây nhiễm, tỷ lệ sống sót sau chọn lọc và tỷ lệ mẫu tỏi sinh.

Ảnh hưởng của phương thức lõy nhiễm ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Phương thức lây nhiễm của vi khuẩn ảnh hưởng lớn đến mức độ tổn thương của tế bào và khả năng xâm nhiễm Thí nghiệm với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho thấy CT3 có tỷ lệ sống cao nhất là 83.66%, vượt trội so với các phương thức khác như CT2 (72.33%), CT4 (69.12%) và CT1 (67.23%) Số chồi của CT3 cũng đạt 17.11, cao hơn so với CT1 (4.26), CT2 (4.73) và CT4 (6.13).

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của phương thức lõy nhiễm ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens (sau 8 tuần)

Số chồi/ cụm chồi (chồi) Tổng số chồi khỏe thu ủược

CT1: cắt trong dung dịch vi khuẩn CT2: Mẫu ủược cấy trong mụi trường ðNC sau ủú nhỏ giọt vi khuẩn

CT3: Ngâm 5 phút trong dung dịch vi khuẩn

CT4: Căt mẫu trong môi trường ðNC sau ủú ngõm vào dịch vi khuẩn

Ảnh hưởng của thời gian tiền nuụi cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Thời gian TNC là khoảng thời gian mà mẫu cấy được nuôi cấy trên môi trường tái sinh trước khi tiến hành lây nhiễm vi khuẩn Trong giai đoạn này, các tế bào và mô sẽ thực hiện quá trình phân chia mạnh mẽ.

A.tumefaciens cú khả năng chuyển gen tốt hơn ủối với cỏc tế bào, mụ ủang phõn chia Nhưng khoảng thời gian TNC là bao nhiờu thỡ tốt nhất ủể cho tỷ lệ chuyển gen của vi khuẩn vào mô, tế bào cao nhất Vì thế chúng tôi tiến hành nghiờn cứu thớ nghiệm này và kết quả thu ủược như sau:

Thí nghiệm nghiên cứu thời gian tiền nuôi cấy với nguồn mẫu là tiền chồi ủược tiến hành trờn 4 cụng thức: tiền nuụi cấy 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày và

Kết quả thu được sau 4 ngày thể hiện rõ qua bảng 4.5 Ở CT1, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi đạt 37,35%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc là 11,26% và tỷ lệ mẫu tái sinh là 66,67% Tại CT2, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi là 34,21%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc đạt 18,24% và tỷ lệ mẫu tái sinh là 61,56% Ở CT3, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi là 22,24%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc là 34,05% và tỷ lệ mẫu tái sinh là 60,23% Cuối cùng, ở CT4, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi là 11,95%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc đạt 38,79% và tỷ lệ mẫu tái sinh là 53,32%.

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của thời gian tiền nuụi cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens (sau 8 tuần)

Thời gian tiền nuôi cấy

Tỷ lệ sống sau lây nhiễ m (%)

Số lá Chiều dài lá

Theo bảng 4.5, CT3 cho thấy kết quả tốt nhất về số lượng chồi thu được và sinh trưởng chồi tỏi sau 3 ngày nuôi cấy, với trung bình 3,04 chồi, vượt trội hơn so với CT1 (1,88), CT2 (2,56) và CT3 (1,65).

Hỡnh 4.4 Ảnh hưởng của thời gian tiền nuụi cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Ảnh hưởng của thời gian ủồng nuụi cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Thời gian ủng nuôi cấy là giai đoạn quan trọng, ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen khi vi khuẩn mang gen kháng xâm nhập vào mẫu Trong thí nghiệm của chúng tôi, đã thực hiện trên 5 công thức khác nhau Ở công thức không nhiễm, không thấy sự biểu hiện của vi khuẩn và toàn bộ mẫu đều chết sau khi chọn lọc Trong khi đó, công thức 2 cho thấy tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của tiền chồi đạt 31,25%, tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc là 85,5% và tỷ lệ mẫu tái sinh sau chọn lọc là 10,07%.

Tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, nghiên cứu về tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc cho thấy ở CT3, tiền chồi cao ủạt đạt 100% với tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc là 64,65% và tỷ lệ tái sinh là 28,13% Ở CT4, tiền chồi cao ủạt cũng đạt 100%, nhưng tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc giảm xuống còn 48,88% và tỷ lệ tái sinh là 24,71% Tương tự, ở CT5, tiền chồi cao ủạt vẫn đạt 100%, nhưng tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc chỉ còn 34,25% và tỷ lệ tái sinh là 19,23%.

Các công thức còn lại tỷ lệ mẫu tỏi sinh sau chọn lọc từ 46,67% đến 66,67% Trong thử nghiệm CT3 (thời gian nuôi cấy 3 ngày), đạt giá trị cao nhất về chỉ tiêu tăng trưởng chồi tái sinh.

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của thời gian ủồng nuụi cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens (sau 8 tuần)

Thời gian ủồng nuôi cấy

Ảnh hưởng của những véc tơ mang gen chuyển nạp

Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các vectơ mang gen chuyển nạp được thực hiện với ba loại vectơ: vectơ mang gen gus, vectơ mang gen gus kết hợp với bar.

Vector mang gen gus có khả năng chuyển gen hiệu quả, với tỷ lệ sống sót sau lây nhiễm đạt 75.34% sau khi thực hiện quá trình chọn lọc.

Tỷ lệ sống sót sau lây nhiễm của mẫu tỏi sinh đạt 34.68, cao hơn so với các vector khác, trong khi tỷ lệ sống của vector mang gen gus, ba và cry IAc thể hiện thấp nhất với tỷ lệ 67.77.

Khi vi khuẩn mang đoạn gen có kích thước lớn, khả năng chuyển nạp gen trở nên khó khăn hơn Do đó, việc lựa chọn những gen phù hợp với các đặc tính mong muốn cần phải chú ý đến kích thước để đảm bảo khả năng chuyển gen hiệu quả của vi khuẩn.

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của cỏc vộc tơ chuyển gen nhiễm ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens (sau 8 tuần)

Tỷ lệ sống sau lây nhiễ m (%)

Số lá Chiều dài lá (cm)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 52 ðC - 100 0 0 0 0 0 0

Vector mang gen gus và bar ++ 69.23 33.02 65.33 a 9.96 b 11 2.2 2.7

Vector mang gen gus, ba vàr cry IAc ++ 63.65 27.08 61.24 b 7.04 c 9 2 2.4

Hình 4.5 Mẫu chuyển gen tái sinh chồi trên môi trường chọn lọc

Kết quả biểu hiện gen Gus:

Vector EHA 105/pITB 2C chứa gen chỉ thị Gus A, mã hóa cho enzym β-glucuronidase, enzym này có khả năng phân giải nhiều loại β-D-glucuronit Hoạt tính của gen Gus có thể được xác định trong mô thực vật biến nạp thông qua sự xuất hiện của màu xanh chàm đặc trưng, hình thành sau quá trình thủy phân chất nền không màu axit 5-bromo-4-cloro-3-indolyl β-D-glucuronic.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội tiến hành nghiên cứu để kiểm tra sự biểu hiện của gen Gus A trong các mẫu ủó lõy nhiễm Các mẫu này được xử lý bằng dung dịch X-gluc trong khoảng 15 giờ ở 37 độ C trong bóng tối Kết quả cho thấy mẫu chuyển gen sẽ có màu xanh chàm đặc trưng, trong khi mẫu đối chứng không có màu sắc.

Kết quả cho thấy các mẫu kiểm tra sau khi nhuộm dung dịch X-gluc xuất hiện màu xanh đặc trưng, khẳng định rằng vector mang gen cần chuyển nạp đã được chuyển vào thành công.

Mẫu ủối chứng khụng cho kết quả biểu hiện gen Gus Sự biểu hiện của gen Gus chỉ thấy ở những mẫu ủược lõy nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens

Mẫu chuyển Gen ðối chứng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 54 ðối chứng Mẫu chuyển Gen

Hình 4.6: Sự biểu hiện của gen Gus

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào bằng phương pháp PCR

* Kết quả PCR cho các dòng loa Sorbonne chuyển gen

Các chồi Sorbonne được nuôi trong môi trường chọn lọc PPT, sau đó được nhân nhanh và cắt lát để chiết tách DNA, tiến hành PCR Kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi cho promoter 35S để phân tích DNA từ một số chồi tỏi sinh thu được sau chọn lọc PPT, kết quả cho thấy 5/5 mẫu DNA chiết tách từ các chồi này đều cho tín hiệu khuếch đại khoảng 200bp (so với thang chuẩn M), cụ thể là các mẫu S1, S2, S3, S4, S5 Mẫu đối chứng âm (DNA chiết tách từ lỏ cây Sorbonne không chuyển gen) không ghi nhận sự khuếch đại DNA, trong khi mẫu đối chứng dương (DNA chiết tách từ chủng ) cho kết quả tích cực.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã thực hiện nghiên cứu luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, trong đó có 55 vi khuẩn cho kết quả dương tính Điều này chứng tỏ rằng phản ứng PCR không bị nhiễm bẩn và cặp mồi sử dụng là đặc hiệu cho việc kiểm tra cây chuyển gen.

Hỡnh 4.7 Kết quả ủiện di sản phẩm PCR của cỏc dũng lily Sorbonne chuyển gen

Như vậy, kết quả kiểm tra ủó chứng minh cỏc dũng lily Sorbonne S1, S2, S3, S4, S5, S6 tái sinh sau chọn lọc có mang gen chuyển

Dựa trên các kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất quy trình chuyển gen Gus, gen Bar và gen Cry vào hoa loa kèn Sorbonne bằng vi khuẩn A.tumefaciens.

Hỡnh 4.8 Sơ ủồ thể hiện quy trỡnh chuyển gen cho hoa lily

MS+30g/lsaccharose+0.7mg/lBA+0.3mg/l 2.4D, pH=5.8

Lây nhiễm với vi khuẩn Ngâm mẫu vào dd vi khuẩn 5 phút ðồng nuôi cấy 3 ngày

MS (không có NH4NO3) + 20mg/l AS + 20g/l saccharose + 10g/l glucose + 10mM/l MES + 0.25mg/l BA + 1g/l cassamino acid + 700mg/l L-asparagine monohydrate + 700mg/l L- glutamine + 7g/l agar pH = 6

Vi khuẩn được rửa bằng nước cất hoặc môi trường MS với sự bổ sung Cefotacime nồng độ 500mg/l Quá trình rửa mẫu được thực hiện 2-3 lần, sau đó rửa lại bằng nước cất hoặc môi trường MS một lần nữa.

Cấy mẫu vào môi trường diệt khuẩn

Xỏc ủịnh sự biểu hiện gen

Gus tạm thời bằng nhuộm

Cấy vào môi trường chọn lọc

MS + 60g/l saccharose + 10g/l glucose + 0.25 mg/l BA +

Xỏc ủịnh kết quả chuyển gen

Phần IV KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ

Qua những thí nghiệm nghiên cứu chúng tôi rút ra những kết luận sau:

* Hoàn toàn có thể chuyển gen vào cây hoa lily Sorbonne bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

NồNồnngg ủủộộ 55mmgg//llớớtt PPPPTT llàà nnggưưỡỡnngg cchhọọnn llọọcc cchhoo ccỏỏcc mmẫẫuu ttiiềềnn cchhồồii lliillyy

SoSorrbboonnnnee cchhuuyyểểnn ggeenn iinn vviittrroo

NồNồnngg ủủộộ 550000mmgg//llớớtt CCeeffoottaacciimmee llàà nnồồnngg ủủộộ ddiiệệtt kkhhuuẩẩnn cchhoo ccỏỏcc mmẫẫuu ttiiềềnn chchồồii lliillyy SSoorrbboonnnnee cchhuuyyểểnn ggeenn iinn vviittrroo

ThThờờii ggiiaann ttiiềềnn nnuuôôii ccấấyy mẫmẫuu pphhùù hhợợpp llàà 33 nnggààyy

PhPhưươơnngg pphhỏỏpp llõõyy nnhhiiễễmm tthhớớcchh hhợợpp llàà ccắắtt mmẫẫuu ssaauu ủủúú ttiiềềnn nnuuụụii ccấấyy 33 ngngààyy,, rrồồii llââyy nnhhiiễễmm vvớớii vvii kkhhuuẩẩnn bbằằnngg ccáácchh nnggââmm ttrroonngg ddịịcchh vvii kkhhuuẩẩnn 55 pphhúútt

Phương thức nuôi cây trồng trong giai đoạn ủ ủoạn ủồn nuôi cây phụ hợp là ủ ồn nuôi cây mẫu với khuẩn trần mùi trường ủ ồn nuôi cây trồng thời gian 33 ngày.

Tiếp tục theo dõi sự biểu hiện của gen chuyển vào bằng các kỹ thuật như Southern Blot, Western Blot và các biotest để xác định sự biểu hiện ổn định của các gen này.

Quy trình chuyển gen cho cây hoa lily Sorbonne được thực hiện thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Nghiên cứu tiếp tục nhằm chuyển các gen triển vọng khác, mang lại những đặc tính mới cho hoa loa kèn cũng nhờ vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước

Bùi Lan Anh và cộng sự đã xây dựng quy trình chuyển gen bar, một gen kháng thuốc diệt cỏ, vào cây khoai mì (Manihot esculenta Crantz) thông qua phương pháp bắn gen Nghiên cứu này được công bố trong Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 11, số 01 năm 2008.

2.Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang.- Di truyền phân tử những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng TP.HCM: Nông nghiệp, 1999

3.Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm, 2000 Giáo trình Sinh lý thực vật

4.Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2004 “Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp”

Nguyễn Thị Phương Thảo và Nguyễn Quang Thạch (1996) đã thực hiện nghiên cứu về quy trình nhân giống cây hoa lily Sorbonne thông qua các phương pháp in vitro và in vivo Bài báo cáo tốt nghiệp này cũng đề cập đến một số phương pháp bảo quản hoa cắt, nhằm nâng cao chất lượng và thời gian sử dụng của hoa.

Cao Ngọc Thúy và Hoàng Minh Tấn (1997) đã thực hiện nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sự phát triển và hiệu quả kinh tế của hoa lily Sorbonne trắng Luận án thạc sĩ này cung cấp cái nhìn sâu sắc về tác động của điều kiện nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của loại hoa này.

7.Dương ðức Tiến, Võ Văn Chi Giáo trình phân loại thực vật

8.Trương Thu Thủy và cs, 2004 “Xây dựng quy trình tái sinh cây Bông bằng cỏch tạo ủa chồi”, Tạp chớ khoa học cụng nghệ

9 Nguyễn Văn Uyển Xây dựng hệ thống tái sinh và ứng dụng trong nghiên cứu tạo cây cải ngọt chuyển gen kháng sâu Hội nghị tổng kết NCCB trong

10.Binns, A.N., Costantino, P 1998 The Agrobacterium oncogenes In: The

Rhizobiaceae (Ed Spaink, H., Kondorosi, A., Hooykaas, P.J.J ).126-129

11.Y Dessaux 1998 The Ti Plasmid of Agrobacterium tumefaciens Harbors an attM-Paralogous Gene, aiiB, Also Encoding N-Acyl Homoserine

Lactonase Activity American Society for Microbiology 546-548

12 Gamborg, O L and G C Phillips Laboratory facilities, operation, and management In Gamborg, O L and G C Phillips, editors eds Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods Springer Berlin 1995

13 Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press, Inc New York, USA 587-589

14 Birch RG 1997 Plant Transformation: Problems and strategies for practical applications Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology 48: 297-

15.Chrispeels MJ and Sadava DE 2003 Plants, Genes, and Crop Biotechnology 2 nd ed Jones and Bartlett Publishers, Massachusetts, USA

16.Cutler SJ and Cutler HG 2000 Biologically Active Natural Products: Pharmaceuticals CRC Press LLC, USA.432-434

17.Ingo Potrykus, Zeng-yu Wang Transgenic Plants of Tall Fescue (Festuca arundinacea Schreb.) Obtained by Direct Gene Transfer to

18.James F Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith and Peter Waterhouse DNA fingerprints and cryopreservation of potato cultivars for improved quality assurance Final report (Horticultural Research &

19.Gelvin, Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool American society for microbiology 2003

20 Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK 87-89

21.Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK 76- 78

22 Walker JM and Rapley R 2002 Molecular Biology and Biotechnology 4 th Edition The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK 156-158

23.Zhu 2000, A T-DNA Insertion Knockout of the Bifunctional Lysine-

Ketoglutarate Reductase/Saccharopine Dehydrogenase Gene Elevates Lysine Levels in Arabidopsis Seeds American Society of Plant Physiologists 645-

24.Ziemienowicz A; Merkle T; Schoumacher F; Hohn B; Rossi L

Import of Agrobacterium T-DNA into plant nuclei: two distinct functions of VirD2 and VirE2 proteins.The Plant cell 2001;13(2):369-83 2001 723-725

25.Ziemienowicz, 2001 Calf thymus Hsc70 and Hsc40 can substitute for DnaK and DnaJ function in protein renaturation but not in bacteriophage DNA replication Zurich Open Repository and Archive 324-326

PHỤ LỤC Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

Thành phần Nồng ủộ Nồng ủộ dung dịch mẹ

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU

BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL S?NG FILE TGLN 31/ 8/** 7:54

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BOOK1 31/ 8/** 7:54

MEANS FOR EFFECT CôNG TH?$

NHAC LAI NOS TL SONG

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BOOK1 31/ 8/** 7:54

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CôNG TH?|

NO BASED ON BASED ON % | |

OBS TOTAL SS RESID SS | |

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI5 FILE SO LIEU 31/ 8/** 8:12

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO LIEU 31/ 8/** 8:12

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO LIEU 31/ 8/** 8:12

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHU$|

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI6 FILE CHOI 31/ 8/** 8:17

VARIATE V005 SOCHOI6 CHOI6 CHOIB CHOIB

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CHOI 31/ 8/** 8:17

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CHOI 31/ 8/** 8:17

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI7 FILE CHOI 31/ 8/** 8:19

VARIATE V006 SOCHOI7 CHOI7 CHOIB CHOIB

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CHOI 31/ 8/** 8:19

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CHOI 31/ 8/** 8:19

BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLCHOI8 FILE SOLIEUB8 31/ 8/** 8:27

Tiêu đề	Nghiên Cứu Xây Dựng Quy Trình Chuyển Gen Vào Cây Hoa Lily Sorbone Bằng Vi Khuẩn Agrobacterium Tumefaciens
Tác giả	Hoàng Tùng
Người hướng dẫn	PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh
Trường học	Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội
Chuyên ngành	Trồng trọt
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2009
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	74
Dung lượng	2,07 MB