ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị
Mẫu cây Tơ xanh (Cassytha filiformis L.) được thu thập tại huyện Đức Hòa, Long An vào tháng 2-4 năm 2011 từ cây chủ Tràm gió (Melaleuca cajuputi) thuộc họ Myrtaceae Tiêu bản khô được lưu giữ tại Bộ môn Tài nguyên dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Một phần nguyên liệu tươi được sử dụng cho nghiên cứu thực vật học, trong khi phần còn lại được rửa sạch, phơi khô và bảo quản ở nhiệt độ phòng để phục vụ cho nghiên cứu hóa học.
Các dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ATCC HTB-22 được cung cấp và thực hiện thử nghiệm MTT tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Bộ môn Sinh hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM.
The HeLa cervical cancer cell line (ATCC CCL-2) and A549 lung cancer cell line (CCL-185) were provided and utilized for WST-1 and western blot experiments at the Department of Pathological Biochemistry, Toyama University, Japan.
- Vi sinh vật: E coli ATCC 25922; P aeruginosa
ATCC 27853; S aureus ATCC 29213; MRSA ATCC 43300; C albicans ATCC
10231 Ďƣợc cung cấp và thực hiện thí nghiệm tại bộ môn Vi sinh, khoa Dƣợc, Ďại học Y Dƣợc Tp.HCM
2.1.2 Hóa chất và trang thiết bị
Xilong Scientific Co Ltd (China) offers a range of solvents for extraction and standard chromatography, including toluene, diethylamine, chloroform, diethyl ether, acetone, ethanol, and methanol.
Javel, carmin 1%, lục iod 0,1%, acid acetic, amoni hydroxid, anhydric acetic, FeCl 3, HCl, H2SO4, KOH, Mg, CaSO4 khan, và NaCO3 là các hóa chất được sử dụng trong vi phẫu thực vật, theo tiêu chuẩn thí nghiệm của công ty Xilong Scientific Co Ltd (Trung Quốc).
Thuốc thử Dragendorff, Mayer, Bouchardat, Fehling và Erdman được pha chế từ các hóa chất thông dụng trong phòng thí nghiệm hóa hữu cơ tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM.
The cell culture media used in this study includes DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) and RPMI, sourced from Gibco BRL (USA) Fetal bovine serum (FBS) was obtained from INC Biomedicals, Inc (USA), while WST-1 (4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolium]-1,3-benzenedisulfonate) was purchased from Dojindo Laboratories (Japan) Antibodies for the western blot method were acquired from Cell Signaling Technology (USA), and ECL (Enhanced Chemiluminescence) Western Blotting Detection Reagent was obtained from Amersham Biosciences (UK) The Immobilon-P membrane was sourced from Millipore (USA), and the blocker BSA (Bovine Serum Albumin) was purchased from Dainippon Seiyaku (Japan).
Whole cell extraction (WCE) from Merck Millipore is prepared using a specific formulation that includes 25 mM HEPES (pH 7.7), 0.3 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 20 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM sodium orthovanadate, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM dithiothreitol, 10 mg/ml aprotinin, and 10 mg/ml leupeptin.
Môi trường nuôi cấy vi sinh TSA (Triptone casein Soy Agar), TSB (Triptone casein Soy Broth), SDA (Sabouraud Dextrose Agar) Ďƣợc cung cấp bởi hãng Merck (Đức)
Tủ sấy Memmert UN110 (Đức)
Cân phân tích Meltler Toledo AB-204 (Mỹ)
Máy cô quay BUCHI (Đức) Đèn soi UV-VIS DESAGA SARSTEDT GRUPPE (Đức)
Kính hiển vi CETI (Bỉ)
Bồn siêu âm Elma LC60H (Đức)
Bếp cách thủy Memmert (Đức)
Tủ sấy chân không VWR S/P (Đức)
Máy ảnh kĩ thuật số FinePix S20 Pro (Trung Quốc)
Máy Ďo UV: Heios Thermo Spectronic (UNICAM-UK)
Máy Ďo IR: Shimadzu FTIR-8201 PC (Nhật Bản)
Máy LC-MS: Máy sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ AGILENT 1100 LC- MSD (Mỹ)
Máy ghi phổ NMR AVANCE 500 BRUKER (Đức)
Phổ NMR Ďƣợc Ďo tại Viện hóa học – Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam.
Phương pháp nghiên cứu về thực vật học
2.2.1 Thu mẫu và xử lý mẫu
Mẫu cây Tơ xanh Ďƣợc thu hái toàn cây những cây có mang Ďầy Ďủ hoa, quả
Thu Ďược khoảng 40 kg nguyên liệu tươi, rửa sạch phơi khô còn 10 kg
Tất cả các mẫu cây dược liệu cần được rửa sạch và chọn lựa những mẫu có đầy đủ các bộ phận như hoa và quả để ép thành tiêu bản khô Sau đó, lưu trữ mẫu tại Trung tâm Sâm và Dược liệu.
2.2.2 Khảo sát đặc điểm hình thái
Tiến hành khảo sát Ďặc Ďiểm hình thái của cây Tơ xanh
2.2.3 Khảo sát đặc điểm vi học
Chọn mẫu: Chọn những mẫu tươi, không quá già hoặc non
Cắt mẫu: Cầm lƣỡi lam thật sắc Ďể cắt mẫu theo chiều ngang thân thành những lát mỏng
Nhuộm phối hợp: Dùng phương pháp nhuộm kép carmin-phèn chua và xanh methylen
- Mẫu vi phẫu sau khi cắt Ďược ngâm trong nước javel trong khoảng 15-30 phút Ďể loại các chất trong tế bào (Ďến khi lát cắt trắng)
- Rửa sạch mẫu bằng nước thường (3-4 lần)
- Ngâm mẫu vào dung dịch acid acetic Ďể loại hết nước javel còn lại và tiếp tục rửa sạch mẫu Ďến khi hết mùi acid acetic bằng nước thường
- Nhuộm mẫu trong dung dịch nhuộm kép carmin-phèn chua và xanh methylen trong khoảng 15 phút Sau Ďó rửa mẫu bằng nước cất
- Quan sát lát cắt dưới kính hiển vi quang học trong giọt glycerin 30%
- Quan sát tổng thể, mô tả chi tiết và chụp hình minh họa
Ghi nhận các Ďặc Ďiểm cảm quan của bột: Màu sắc, mùi vị
Để lên tiêu bản bột, bạn cần lấy một lượng bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm, sau đó đặt lên một phiến kính Nhỏ 1-2 giọt nước lên bột và khuấy đều để bột phân tán trên phiến kính, sử dụng góc của lá kính để khuấy Đậy lá kính bằng cách nghiêng một cạnh lên phiến kính và hạ dần đầu kia cho đến khi lá kính nằm ngang Cuối cùng, dùng ngón tay di nhẹ trên phiến kính để bột phân tán đều một lần nữa và dùng giấy thấm để loại bỏ nước và bột thừa ở mép phiến kính.
Quan sát dưới kính hiển vi quang học, mô tả Ďặc Ďiểm của bột và chụp hình minh họa.
Phương pháp nghiên cứu về hóa học
2.3.1 Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật
Qui trình phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật được xây dựng dựa trên phương pháp của Ciuley từ trường Đại học Dược khoa Rumani, đã được điều chỉnh phù hợp với khoa Dược của Đại học.
Chiết tách hỗn hợp các chất từ nguyên liệu thực vật thành ba phân đoạn dựa trên độ phân cực: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh Quá trình này được thực hiện bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt với các dung môi như ether ethylic, ethanol và nước Các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết được xác định thông qua các phản ứng đặc trưng.
Sơ đồ 2.1 Chuẩn bị các dịch chiết
Dịch chiết cồn thủy phân
HCl 10%/Cách thủy Chiết lại bằng ether
HCl 10%/Cách thủy Chiết lại bằng ether
Dịch chiết nước thủy phân
Bảng 2.1 Tóm tắt quy trình phân tích sơ bộ hóa thực vật
Chất béo Mờ giấy lọc
Tinh dầu Cắn có mùi thơm
Carotenoid Phản ứng Carr-Price
Tritepenoid tự do Phản ứng Liebermann-Burchard
Coumarin Phát huỳnh quang/ OH -
Coumarin Phát huỳnh quang/ OH -
Glycosid tim Thuốc thử Raymond-Marthoud, xanthydrol
Flavonoid γ–pyron Phản ứng cyanidin
Saponin Tính tạo bọt trong nước
Acid hữu cơ Na 2 CO 3 sủi bọt
Hợp chất khử Thuốc thử Fehling
Triterpenoid thủy phân Phản ứng Liebermann-Burchard
Coumarin Phát huỳnh quang/ OH -
Anthraquinon NaOH 10% lớp kiềm có màu hồng tới đỏ
Glycosid tim Thuốc thử Raymond-Marthoud, xanthydrol
Glycosid tim Thuốc thử Raymond-Marthoud, xanthydrol
Flavonoid γ–pyron Phản ứng cyanidin
Saponin Tính tạo bọt trong nước
Acid hữu cơ Na 2 CO 3 sủi bọt
Hợp chất khử Thuốc thử Fehling
Polyuronic Pha loãng trong cồn tủa
Triterpenoid thủy phân Phản ứng Liebermann-Burchard
Glycosid tim Thuốc thử Raymond-Marthoud, xanthydrol
Anthraquinon NaOH 10% lớp kiềm có màu hồng tới đỏ
2.3.2 Khảo sát chọn lựa phương pháp thu nhận alkaloid toàn phần [13] Áp dụng và so sánh hai cách chiết khác nhau Ďể chọn phương pháp chiết alkaloid toàn phần hiệu quả
2.3.2.1 Phương pháp chiết alkaloid dạng muối:(phương pháp Stas-Otto) [6]
Cân khoảng 10 g bột dược liệu và thấm ẩm bằng dung dịch acid hydrochloric 2% Chiết bột dược liệu với acid hydrochloric 2% nhiều lần (50x40x40 ml), mỗi lần 30 phút bằng cách đun cách thủy cho đến khi không còn alkaloid trong dịch chiết acid, có thể định tính alkaloid bằng các phản ứng hóa học Gộp chung các dịch chiết acid và rửa bằng ether; trong môi trường acid, ether chỉ hòa tan một số tạp chất mà không hòa tan alkaloid.
Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dịch acid đến khoảng pH 10 bằng NH4OH 10%, lắc với cloroform trong bình lắng để chiết alkaloid Base cho đến khi dịch chiết không còn phản ứng với thuốc thử alkaloid Gộp chung dịch cloroform và rửa bằng nước cất vài lần, sau đó tách lấy lớp cloroform và làm khan bằng Na2SO4 khan trong một bercher khô Gạn dịch chiết đã làm khan vào một bercher khô 100 ml đã cân bì, rửa lớp Na2SO4 khan bằng 5 ml cloroform hai lần và gộp chung vào bercher Bốc hơi dung môi trên bếp cách thủy cho đến cặn và sấy cặn ở 110 oC cho đến khi khối lượng không đổi, sau đó cân cặn với khối lượng là P (g) Thực hiện quy trình này ba lần trên ba mẫu.
2.3.2.2 Phương pháp chiết alkaloid dạng base [13]
Cân chính xác 10 g dược liệu và làm ẩm bằng dung dịch NH4OH 10% Tiến hành chiết hồi lưu trong 30 phút với 50x40x40 ml cloroform cho đến khi dịch chiết không còn phản ứng với thuốc thử alkaloid Lọc và gộp chung dịch chiết vào bình lắng gạn Tiếp theo, chiết alkaloid bằng dung dịch acid hydrochloric 2% (20x10x10 ml) cho đến khi dịch chiết acid không còn phản ứng với thuốc thử alkaloid Cuối cùng, gộp chung dịch chiết acid vào bình lắng gạn và kiềm hóa bằng NH4OH 10% cho đến khi đạt được pH mong muốn.
Chiết xuất alkaloid bằng cloroform được thực hiện với tỉ lệ 20x10x10 ml cho đến khi dịch chiết không còn phản ứng với thuốc thử alkaloid Sau đó, gộp chung dịch chiết cloroform vào bình lắng gạn và rửa bằng nước cất Lớp cloroform được gạn vào một bercher khô và làm khan bằng Na2SO4 khan Tiếp theo, dịch chiết đã làm khan được chuyển vào bercher khô 100 ml đã cân bì trước đó Rửa lớp Na2SO4 bằng 5 ml cloroform hai lần và gộp chung vào dịch chiết cloroform Cuối cùng, bốc hơi dịch cloroform trên bếp cách thủy cho tới cắn và sấy cắn ở 110°C cho tới khi khối lượng không đổi, sau đó cân cắn với khối lượng là P (g) và thực hiện quy trình này ba lần trên ba mẫu.
Bột Tơ xanh Ďƣợc kiềm hóa bằng dung dịch NH3 10% Ďến pH 10
Thêm DCM Ďến khi ngập bề mặt bột Tơ xanh
Ngâm trong khoảng 5 ngày, thu dịch chiết
Kiểm tra sự hiện diện của alkaloid trong dịch chiết được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Sau đó, tiến hành cô quay giảm áp để thu cao chiết, sử dụng dung môi DCM để chiết tiếp bã dược liệu Quy trình này lặp lại cho đến khi dịch chiết không còn alkaloid.
Sơ đồ 2.2 Chiết xuất alkaloid
Kiềm hóa bằng NH 3 Làm ẩm và chiết bằng DCM
Dung môi Cao DCM thu hồi
2.3.4 Tinh chế và phân lập alkaloid [6, 11]
Cao alkaloid sau khi chiết xuất Ďƣợc Ďƣa qua sắc kí cột Ďể tách alkaloid
Sắc ký cột trao Ďổi diaion HP-20
Hạt diaion sau khi được hoạt hóa sẽ được nạp vào cột và rửa bằng nước cất Tiếp theo, mẫu cao alkaloid tổng (300 g) sẽ được nạp vào cột Hệ dung môi sẽ có độ phân cực giảm dần từ H2O, H2O-MeOH đến MeOH 100% Cuối cùng, thu phân đoạn MeOH và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng.
Sơ đồ 2.3 Tách chiết alkaloid
MeOH : H 2 O (100 : 0) Thu phân Ďoạn MeOH
Giải ly Nạp dung môi Hoạt hóa diaion
Sắc k cột silica gel pha thuận
Sau khi kiểm tra các phân Ďoạn MeOH 40%, MeOH 60%, MeOH 100% Đề tài chọn phân Ďoạn MeOH khả thi (phân Ďoạn MeOH 60% và phân Ďoạn MeOH 100%)
Phân đoạn MeOH 60% được thực hiện bằng phương pháp sắc ký cột silicagel pha thuận và sắc ký lớp mỏng chế hóa Để đánh giá sự hiện diện cũng như hiệu quả phân lập alkaloid, phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để kiểm tra kết quả của sắc ký cột.
Phân đoạn MeOH 100% được thực hiện bằng sắc ký cột nhanh với hệ dung môi DCM:MeOH để thu các phân đoạn và lựa chọn phân đoạn tối ưu Sau đó, tiến hành sắc ký cột pha thuận nhiều lần với các phân đoạn đã chọn bằng hệ dung môi tương tự Cuối cùng, kiểm tra sự hiện diện và hiệu quả phân lập alkaloid thông qua phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Sắc k lớp mỏng điều chế
Chọn các phân Ďoạn còn 2-3 cấu tử, tiến hành sắc ký lớp mỏng Ďiều chế Ďể tinh sạch hơn alkaloid
2.3.5 Xác định các đặc tính lý hóa của alkaloid tách được
Các chất thu Ďƣợc qua sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng chế hóa Ďƣợc Ďem xác Ďịnh các chỉ tiêu:
● Điểm chảy: Đƣợc Ďo trên máy Stuart SMP3 tại phòng máy Trung tâm Sâm và Dƣợc liệu Tp HCM
● Phổ hồng ngoại: Đƣợc Ďo trên máy BRUKER-IFS48*CARLO-GC6130 tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm
Đo phổ tử ngoại UV-vis được thực hiện trên máy đo quang UV-vis Heiosy, sử dụng cuvette thạch anh 1cm tại phòng máy Trung tâm Sâm và Dược liệu TP HCM.
Xác định cấu trúc hợp chất alkaloid
Tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các chất đã tinh sạch được xác định cấu trúc thông qua phân tích dữ liệu phổ NMR một chiều và hai chiều.
2.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học
Chuẩn bị các mẫu thử:
Cao MeOH toàn phần (mẫu MeOH) được chiết xuất bằng cách ngâm 100 g nguyên liệu trong 100 ml MeOH, thực hiện 6 lần (tỷ lệ 1:6; KL:TT) Sau đó, các dịch lọc được lọc gộp và cô giảm áp để thu được cao MeOH làm mẫu thử.
- Alkaloid tổng (mẫu Atp): Mẫu Ďƣợc chiết theo mục (2.3.2.2 Chiết xuất akaloid toàn phần)
Mẫu thử được pha chế trong dung môi DMSO cho các thử nghiệm độc tế bào và western blot, hoặc MeOH cho các thử nghiệm khác, sau đó được pha loãng bằng môi trường đến nồng độ phù hợp Mẫu chứng âm có cùng nồng độ dung môi với mẫu thử, và nồng độ dung môi cuối cùng trong môi trường không vượt quá 0,1%.
2.4.1 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu thực vật học
3.1.1 Khảo sát về đặc điểm sinh thái Ở khu vực phía Nam, qua khảo sát sơ bộ nhận thấy Tơ xanh (Cassytha filiformis L.) thường gặp ở các vùng ngập nước, các tỉnh, thành ở Ďồng bằng, ven biển có nhiều sông rạch nhƣ huyện Mộc Hóa (Long An), Bình Chánh (khu công nghiệp Lê Minh Xuân, Vĩnh Lộc) và Cần Giờ (thành phố Hồ Chí Minh)
Tơ xanh là một loại cây bán ký sinh, có khả năng phát triển trên nhiều cây chủ thuộc các họ thực vật khác nhau, bao gồm Tràm gió (Melaleuca leucadendra), Lức (Pluchea indica), Táo (Ziziphus jujuba), và Phi lao (Casuarina equisetifolia).
3.1.2 Khảo sát về đặc điểm hình thái
Hình dạng của cây dây leo này dài từ 1,5 đến 2 mét hoặc hơn, với thân có rãnh dọc và phủ lông nâu mịn, ít khi nhẵn Màu sắc của nó biến đổi từ vàng lục đến xanh lục, có tiết diện tròn với đường kính trung bình từ 1,5 đến 2 mm Khoảng cách giữa các lóng là 7-9 cm, trong khi các nhánh bên thường mọc thẳng góc với trục chính và không có nhánh cấp 2.
Hình 3.1 Cây Tơ xanh kí sinh trên cây tràm gió
Tiêu giảm thành vảy, vảy hình tam giác dài khoảng 1-1,5 mm
Nơi thân tiếp xúc với các bộ phận cây chủ hay với chính thân của nó có các giác mút hình bầu dục kích thước 1-1,5 mm
Cụm hoa mọc trên nhánh bên, với trục mang hoa dài từ 1,5-5 cm, màu xanh và có lông mịn cùng các nốt bì khổng, chứa khoảng 8 hoa không cuống Hoa lưỡng tính, có màu trắng và khi chưa nở có hình trứng kích thước 1,5-2 mm Đài hoa gồm 3 đài phụ và 3 lá đài màu xanh với ít lông nâu, dính ở đáy và cùng tồn tại với vành hoa cho đến khi quả chín.
Vành: Có 3 vành hoa màu trắng Đài và vành dính ở Ďáy
Nhụy Ďực được chia thành 4 luân sinh, mỗi luân sinh bao gồm 3 tiểu nhụy, trong đó luân sinh ngoài cùng gắn liền với cánh hoa, còn luân sinh trong cùng lại lép Tiểu nhụy mở ra bằng 2 nắp Nhụy cái có cấu trúc gồm bầu noãn thượng, một bầu nhụy và một vòi, nằm ở chính giữa hoa.
Hình 3.2 Hoa đồ và hoa Tơ xanh
Giả quả hình cầu, có kích thước từ 5-8 mm, trơn nhẵn và bao bọc bên ngoài là lớp bao dày, mọng, màu xanh, chứa chất nhầy Bên trong, quả bế có hình trứng nhọn một đầu, khi chín có màu nâu đen, vỏ sù sì và kích thước khoảng 3-4 mm.
Hình 3.3 Dạng hoa, quả, hạt của cây Tơ xanh
- Hạt: Trong hạt có 2 lá mầm to, màu xanh lục nhạt, có 2 lớp vỏ, bao ngoài là lớp vỏ quả cứng và Ďen nâu
Hạt Tơ xanh có đặc điểm cấu tạo chung nhưng có thể thay đổi tùy thuộc vào cây chủ mà nó ký sinh Khi ký sinh trên cây táo ta (Ziziphus mauritiana) hoặc cây họ hòa bản (Poaceae), Tơ xanh thường có màu vàng và thân to hơn, cho thấy sự biến đổi về kích thước và màu sắc.
Dựa trên các đặc điểm thực vật học đã phân tích và tài liệu của Phạm Hoàng Hộ, cùng với xác nhận từ Dược sĩ Phan Văn Đệ, luận án xác định mẫu cây có tên khoa học là Cassytha filiformis L và tên Việt là
Nam là Tơ xanh, thuộc họ Lauraceae, bộ Laurales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta
3.1.3 Khảo sát đặc điểm vi học
Tiết diện tròn, phần vỏ bằng 1/3 trụ trung tâm Trên bề mặt thân có rất nhiều dãy khớ khẩu song song nhau, xếp theo chiềo dọc, kớch thước 38-45 àm
Chi tiết từ ngoài vào trong:
- Ngoài cùng là lông che chở Ďơn bào
- Tế bào biểu bỡ hỡnh chữ nhật, kớch thước khoảng 15 x 20 àm cú cutin dày khoảng 1/3 kích thước tế bào biểu bì
- Ngay dưới biểu bì là lớp giao mô phiến nằm rải rác không liên tục khoảng 2-3 hàng tế bào
- Nhu mụ vỏ gồm 5-7 hàng tế bào, hỡnh cầu, kớch thước khoảng Ф% àm phần ngoài (2-3 lớp) nhu mô vỏ, trong tế bào có chứa nhiều lục lạp
Sợi cương mô tạo thành các hình cung xếp chồng lên nhau, tạo thành vòng không liên tục trên bề mặt libe và trong phần nhu mô vỏ, với bề ngang khoảng 10 mm và bao gồm từ 2 đến 4 hàng tế bào.
- Các bó libe nằm trên một vòng không liên tục, khoảng 13-18 bó
- Tầng phát sinh libe-mộc không liên tục
- Các bó mộc với mạch mộc to và nhu mô gỗ xếp thành vòng liên tục, khoảng 8-12 bó
- Nhu mụ tủy, cỏc tế bào lớn, hỡnh cầu kớch thước khoảng 45-55 àm Đụi khi tủy rỗng
Vi phẫu trục phát hoa
Trục phát hoa có cấu tạo tương tự như thân cây, nhưng tỷ lệ giữa vỏ và trụ trung tâm là 2/1 Số lượng bó libe và mộc giảm đi, trong khi bó libe chứa các ống tiết có chức năng chứa chất nhầy.
Chi tiết từ ngoài vào trong:
- Các tế bào biểu bì có cutin mỏng
- Nhu mô vỏ chứa nhiều chất dự trữ
- Sợi cương mô tập hợp thành vòng cung bao lấy bó libe, xếp thành vòng không liên tục
- Bó libe khoảng 8-10 bó, xếp thành vòng không liên tục, bên trong mỗi bó có mang ống tiết
- Các bó mộc khoảng 6-8 bó liền thành vòng liên tục
- Cảm quan: Bột màu nâu, không mùi, vị hơi chát
- Quan sát dưới kính hiển vi có:
Nhiều lụng che chở Ďơn bào, kớch thước dài khoảng 70-90 àm Mảnh biểu bỡ mang nhiều khí khẩu dạng song bào xếp thành dãy song song kích thước khoảng 38-
Mảnh mụ mộc có kích thước khoảng 45 àm và mang mạch Ďồng tiền, với đường kính mỗi mảnh Ďồng tiền dao động từ 6-8 àm Mảnh sợi mạch xoắn có bề ngang khoảng 10-12 àm, trong khi bú sợi cương mụ có bề ngang từ 10-14 àm.
Hình 3.5 Vi phẫu thân Tơ xanh (X10)
1: Lông che chở 5: Sợi cương mô 2: Biểu bì có cutin 6:Bó libe
3: Giao mô phiến 7: Nhu mô tủy 4: Nhu mô vỏ 8: Bó mộc
Hình 3.6 Chi tiết các mô ở vi phẫu thân Tơ xanh
1: Biểu bì có cutin 5: Tiền mộc 2: Nhu mô vỏ 6: Mạch hậu mộc 3: Sợi cương mô 7: Hạt lục lạp trong nhu mô vỏ
4: Bó libe 8: Nhu mô tủy
Hình 3.7 Soi bột dƣợc liệu Tơ xanh (X40)
Chú thích: 1: Lông che chở; 2: Mảnh mạch Ďồng tiền; 3: Mảnh biểu bì mang khí khẩu xếp thành dãy; 4: Mảnh sợi cương mô; 5: Mảnh sợi mạch xoắn
Hình 3.8 Vi phẫu trục phát hoa Tơ xanh
2 Nhu mô vỏ 6 Bó mộc
3 Sợi cương mô 7 Nhu mô tủy
4 Ống tiết Qua khảo sát về Ďặc Ďiểm sinh học và vi học, nhận thấy các Ďặc Ďiểm trên phù hợp với Ďặc Ďiểm chung của chi Cassytha Kết quả này có thể gợi ý một số Ďặc Ďiểm Ďể phân biệt loài Tơ xanh với các loài khác của cùng một chi Cassytha về sinh học:
Cây có thân màu vàng và lá xanh lục, thuộc nhóm thực vật đa dạng với hoa nhỏ màu trắng Về mặt vi học, vỏ cây chứa nhiều lục lạp, biểu bì có khí khẩu xếp thành dãy, cùng với mạch xoắn và mạch đồng tiền.
Phương pháp nghiên cứu về hóa học
3.2.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
3.2.1.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Kết quả Ďƣợc trình bày ở bảng 3.1
Kết quả sơ bộ phân tích thành phần hóa học của cây Tơ xanh cho thấy sự có mặt của nhiều hợp chất quan trọng, bao gồm Triterpenoid, alkaloid, proanthocyanidin, polyphenol, acid hữu cơ, hợp chất khử và polyuronid.
3.2.1.2 Định tính xác định các hợp chất
Kết quả Ďƣợc trình bày ở bảng 3.2
Kết luận: Xác Ďịnh lại các hợp chất thấy có sự hiện diện của alkaloid, flavonoid- proanthocyanidin, không thấy có tannin, saponin
Bảng 3.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Nhóm hợp chất Thuốc thử
Cách thực hiện Phản ứng dương tính
Kết quả Ďịnh tính trên các dịch chiết
Dịch chiết cồn Dịch chiết nước Không thủy phân
Thủy phân Không thủy phân
Chất béo Nhỏ dd lên giấy Vết trong mờ - -
Carotenoid Carr-price Xanh chuyển sang Ďỏ - -
H 2 SO 4 Xanh lục ngả xanh dương - -
Tinh dầu Bốc hơi Ďến cắn Có mùi thơm - -
Triterpenoid tụ do Liebermann-Burchard Đỏ nâu-tím,lớp trên xanh +- + +- +
Alkaloid Thuốc thử Alkaloid Kết tủa + - ++ ++
Coumarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn - - - -
Antraglycosid KOH 10% Dd kiềm có màu hồng-Ďỏ - - - -
Flavonoid Mg/HCl ĎĎ Dd có màu hồng Ďến Ďỏ +- - - -
Glycosid tim Thuốc thử vòng lacton Tím - - - - -
Tannin Dd FeCl 3 Xanh rêu(polyphenol) ++ ++ +
Dd gelatin-muối Tủa bông trắng(tannin) - - -
Triterphenoid tp Liebermann-Burchard Đỏ nâu-tím,lớp trên xanh + + +
Saponin TT liebermann Có vòng tím nâu - - -
Acid hữu cơ Na 2 CO 3 Sủi bọt + + +
Chất khử TT Fehling Tủa Ďỏ gạch + + +
Bảng 3.2 Kết quả xác định từng hợp chất
Hợp chất Phản ứng Phản ứng dương tính Kết quả Nhận xét
Với NaOH Có màu vàng-cam -
Mg/HCl ĎĎ Có màu hông-Ďỏ -
Tannin Gelatin-muối Tủa bông trắng - Không có tannin
Tạo bọt Có cột bọt bền -
Fontan-Keudal 2 ống có bọt -
Liebermann Vòng ngăn cách Ďỏ tím -
Kahlenberg Huỳnh quang vàng, xanh -
3.2.1.3 Xác định hợp chất alkaloid
- Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng
Thuốc thử Nhận xét kết quả Kết luận
Dragendorff Có tủa Ďỏ cam
Bouchardat Có tủa nâu Ďen
Mayer Có tủa trắng Ďục
Hình 3.9 Kết quả định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học
Chú thích: (các ống nghiệm từ trái sang phải)
+ Ống 1: Ống chứa thuốc thử + Ống 2: Ống chứng
+ Ống 3: Ống chứa mẫu thử Thuốc thử Mayer Thuốc thử Dragendorff Thuốc thử Bouchardat
Hình 3.10 SKLM định tính alkaloid Phát hiện: Hơ trên hơi iod
Trên hệ thăm dò (Hệ 1): Khi phát hiện bằng hơi iod, xuất hiện các vết màu xám, tuy nhiên, trị số R f còn thấp, cần Ďiều chỉnh lại hệ (1:3:1) (Hệ 2a)
Trên hệ 2a (hệ Điều chỉnh), các vết chất tách ra tốt hơn với trị số Rf cao hơn Sắc ký Đồ cho thấy có khoảng 10 vết chất, trong đó 4 vết Ďậm nhất (vết 1-4) hiển thị màu xám khi phản ứng với Iod, có khả năng là alkaloid.
Hình 3.11 SKLM định tính alkaloid
Phun Dragendorff (trái) và soi UV 254nm (phải)
Các vết chất dự đoán là alkaloid khi hơ iod và phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff, cho thấy các vết cam sáng, vàng, nâu đậm Kết quả này khẳng định sự hiện diện của alkaloid Thêm vào đó, các vết này cũng tắt quang khi soi dưới ánh sáng UV 254 nm.
Phát hiện: Phun thuốc thử Dragendorff (trái)
Soi dưới UV 254nm (phải)
3.2.2.1 Khảo sát và chọn lựa phương pháp chiết alkaloid
Chiết xuất alkaloid bằng dung dịch acid loãng trong nước (chiết alkaloid dạng muối)
Chiết 10 g dƣợc liệu thu Ďƣợc 0,004 g alkaloid thô Hiệu suất 0,04%
Chiết xuất alkaloid dạng base
Chiết 10 g dƣợc liệu thu Ďƣợc 0,9 g alkaloid thô Hiệu suất 9%
Kiềm hóa bằng NH 3 Làm ẩm, chiết bằng DCM
Sơ đồ 3.2 Qui trình chiết alkaloid dạng base
Lọc, ly tâm bỏ tủa
Kiềm hóa, lắc với dung môi hữu cơ, cô Ďến cắn
Qui trình chiết alkaloid bằng acid loãng trong nước là phương pháp hiệu quả, cho thời gian chiết nhanh khoảng 24 giờ, thích hợp cho chiết xuất với lượng lớn Phương pháp này được sử dụng để phân lập, xác định cấu trúc và chuẩn bị mẫu cho thử nghiệm hoạt tính sinh học Định tính alkaloid toàn phần có thể được thực hiện thông qua hai phương pháp chiết bằng kĩ thuật SKLM.
Kết quả định tính các alkaloid bằng SKLM cho thấy thành phần alkaloid trong hai phương pháp chiết tương đối giống nhau Tuy nhiên, phương pháp chiết alkaloid dạng base mang lại hiệu suất thu nhận alkaloid toàn phần cao hơn Do đó, việc áp dụng phương pháp chiết alkaloid dạng base là lựa chọn tối ưu để thu nhận các alkaloid tinh sạch.
Bột Tơ xanh khô thu được có trọng lượng 4,2 kg, được chia thành ba phần Quá trình kiềm hóa được thực hiện bằng dung dịch NH3 10% và chiết ngâm, thỉnh thoảng có khuấy trộn bằng dung môi DCM.
Hình 3.12 SKLM so sánh định tính alkaloid trong dịch chiết của 2 cách chiết
Hệ aceton:ethanol (5:5) được sử dụng để cắn alkaloid trong định lượng Phương pháp chiết bằng dung dịch acid loãng trong nước cũng cho phép cắn alkaloid hiệu quả Ngoài ra, phương pháp chiết alkaloid dạng base cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Lần Khối lƣợng mẫu (kg)
Thể tích DCM sử dụng (lít)
Thể tích dịch chiết DCM thu Ďƣợc (lít)
Kết quả: Chiết 4,2 kg dƣợc liệu thu Ďƣợc 380 g cao alkaloid toàn phần, hiệu suất 9,04 %
3.2.3 Tinh chế và phân lập alkaloid
● Sắc kí cột: Thể tích diaion: 4 l Khối lƣợng mẫu: 100 g (cao alkaloid tổng)
Bảng 3.4 Chiết xuất phân đoạn MeOH
Phân Ďoạn Thể tích dịch rửa
Hình 3.13 Kiểm tra các phân đoạn MeOH bằng thuốc thử Dragendorff
MeOH 40% là 3,563 g, khối lƣợng phân Ďoạn MeOH 60% là 12,007 g và khối lƣợng phân Ďoạn MeOH 100% là 67,716 g
Phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy rằng phân đoạn MeOH 100% chứa nhiều vết alkaloid hơn so với phân đoạn MeOH 40% và 60% Với khối lượng cao và thành phần chính là alkaloid, hai phân đoạn MeOH 100% và MeOH 60% được chọn cho bước tinh sạch tiếp theo.
3.2.3.1 Tinh chế, phân lập alkaloid ở phân đoạn MeOH 60%
Bảng 3.5 Kết quả kiểm tra các phân đoạn của cột
Thông số cột sắc ký
Hệ dung môi Aceton:ethanol
Phân Ďoạn tập hợp Phân Ďoạn hứng Thành phần tách Silica gel pha thuận: 600 g
● Các phân Ďoạn tập hợp 1, 2, 3 Ďƣợc kiểm tra lại bằng SKLM, phát hiện bằng TT Dragendorff Thể hiện qua Sắc kí Ďồ:
Hình 3.14 SKLM kiểm tra các phân đoạn
Qua sắc kí cột, các chất V0 và V1 được thu nhận, tuy nhiên V0 vẫn còn lẫn tạp chất ở phần đuôi Do đó, phân đoạn 2 chứa V0 cần được xử lý tiếp bằng sắc kí lớp mỏng để thu được V0 tinh khiết hơn.
Bảng 3.6 Kết quả các chất thu đƣợc qua sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng chế hóa
Chất Khối lƣợng(g) Mô tả
3.2.3.2 Tinh chế, phân lập alkaloid ở phân đoạn MeOH 100%
Sơ đồ các cột sắc k đã thực hiện:
Bảng 3.7 Thông số các cột sắc k
Cột sắc ký Khối lƣợng mẫu (g)
Dung môi giải ly (DCM:MeOH)
Mẫu cao được chiết xuất từ phân đoạn MeOH 100% với khối lượng 67,7165 g Sau khi sử dụng mẫu khô để nạp cột, quá trình giải ly đã thu được các phân đoạn như bảng dưới đây.
(DCM:MeOH) Phân Ďoạn KLPĐ (g)
PĐ1 (1-10) PĐ2 (11-30) PĐ3 (31-35) PĐ4 (36-80) m PĐ1 = 7,815 m PĐ2 = 1,118 m PĐ3 = 1,520 m PĐ4 = 3,724 95:5
PĐ5 (81-85) PĐ6 (86-90) PĐ7 (91-98, 100-120) PĐ8 (99) m PĐ5 = 2,240 m PĐ6 = 3,740 m PĐ7 = 7,828 m PĐ8 = 0,486
Hình 3.15 Kiểm tra phân đoạn cột C (1-8) bằng thuốc thử Dragendorff
Hình 3.16 cho thấy sắc ký kiểm tra phân đoạn 3 cột C bằng phương pháp UV 254 (A) Kết quả tra bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy có sự kết tủa ở phân đoạn 3, được xác nhận là một vết rõ ràng.
PĐ 1 chứa vệt sắc ký gọn, màu xanh Ďậm nên Ďƣợc chọn Ďể tiếp tục tinh sạch Ngoài ra xuất hiện một vệt màu cam có lẫn nhiều tạp
PĐ 2, 3, 4 chứa 2 vết alkaloid giống nhau về vị trí và màu sắc nên gộp 3 phân Ďoạn Ďể tăng hàm lƣợng, tiếp tục tinh sạch
PĐ 5, 6, 7, 8 Ďều chứa alkaloid nhưng lẫn nhiều tạp, tiến hành lưu trữ b) Cột C1
Mẫu cao được thu từ các phân đoạn 2, 3, 4 của cột C với khối lượng 6,3631 g Sử dụng mẫu khô nạp cột, tiến hành giải ly để thu được các phân đoạn như bảng dưới đây.
(DCM:MeOH) Phân Ďoạn KLPĐ (g)
PĐ1 (1-10) PĐ2 (11-15) PĐ3 (16-19) PĐ4 (20-30) m PĐ1 = 0,344 m PĐ2 = 0,212 m PĐ3 = 4,079 m PĐ4 = 0,178
Hình 3.17 Sắc k đồ kiểm tra phân đoạn cột C1 (1-4) bằng thuốc thử
Phân đoạn 3 vẫn chứa 2 vết sắc ký mặc dù đã loại bớt tạp chất, nhưng chưa được tách hoàn toàn Do đó, cần tiếp tục phân tách và tinh sạch phân đoạn này.
Phân Ďoạn 1, 2, 4 chứa 1 vết sắc ký giống nhau và lẫn nhiều tạp, tiến hành lưu trữ c) Cột C1.1
Mẫu cao sử dụng Ďƣợc thu từ phân Ďoạn 3 của cột C1, có khối lƣợng 4,0790 g
Sử dụng mẫu khô nạp cột, tiến hành giải ly thu Ďược các phân Ďoạn như bảng dưới
Bảng 3.10 Kết quả sắc k cột C1.1
Hệ dung môi (DCM:MeOH) Phân Ďoạn KLPĐ (g)
PĐ1 (1-3) PĐ2 (4-8) PĐ3 (9-10) PĐ4 (11-20) PĐ5 (21-30) PĐ6 (31-35) PĐ7 (36-50) PĐ8 (51-55) PĐ9 (56-60) m PĐ1 = 0,154 m PĐ2 = 0,309 m PĐ3 = 0,189 m PĐ4 = 0,471 m PĐ5 = 0,618 m PĐ6 = 0,337 m PĐ7 = 0,463 m PĐ8 = 0,217 m PĐ9 = 0,122
Hình 3.18 Kiểm tra phân đoạn cột C1.1 (1-9) bằng thuốc thử Dragendorff
Tất cả các phân Ďoạn từ 1 Ďến 9 Ďều chứa alkaloid bắt màu cam rõ
Sắc ký Đồ cho thấy các vết alkaloid không tách biệt rõ ràng Tuy nhiên, trong phân Đoạn 7, có hai vết alkaloid tách nhau rõ hơn so với các phân Đoạn khác Để thu được alkaloid từ phân Đoạn 7, phương pháp sắc ký lớp mỏng được áp dụng Cột C2 cũng được sử dụng trong quá trình này.
Mẫu cao được sử dụng là phân đoạn 1 của cột C, có khối lượng 7,8152 g Sau khi sử dụng mẫu khô nạp cột, quá trình giải ly đã thu được các phân đoạn như bảng dưới đây.
Hệ dung môi (DCM:MeOH) Phân Ďoạn KLPĐ (g)
PĐ1 (1-2) PĐ2 (3-8) PĐ3 (9) PĐ4 (10-25) PĐ5 (26-49) m PĐ1 = 0,081 m PĐ2 = 0,701 m PĐ3 = 0,389 m PĐ4 = 1,266 m PĐ5 = 0,825
PĐ6 (50-55) PĐ7 (56-60) PĐ8 (61) PĐ9 (62-70) m PĐ6 = 0,527 mPĐ7= 0,275 m PĐ8 = 0,782 m PĐ9 = 0,836 chứa vết alkaloid
Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học
Các nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng aporphin alkaloid chiết xuất từ nhiều nguồn thực vật khác nhau có nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm tác động lên hệ thần kinh giao cảm adrenergic, dopaminergic, chống kết tập tiểu cầu, kháng virus và nhiều hoạt tính khác Đặc biệt, nhóm aporphin alkaloid được nghiên cứu nhiều về hoạt tính gây độc tế bào, kháng ký sinh trùng và chống oxy hóa, với các cơ chế tác động liên quan đến cấu trúc – hoạt tính được chứng minh qua nhiều thử nghiệm Cấu trúc vòng methylen dioxyd, isoquinolin và biphenyl trên khung aporphin có liên quan đến các hoạt tính này Luận án này đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và chống oxy hóa in vitro của aporphin alkaloid chiết tách từ Tơ xanh, một loài có hàm lượng aporphin alkaloid cao nhưng nghiên cứu còn hạn chế Ngoài ra, luận án cũng khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của Tơ xanh để định hướng cho các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính này, mặc dù cơ chế kháng vi sinh vật vẫn chưa được làm rõ.
Các mẫu aporphin được phân lập từ Tơ xanh đã được thử nghiệm với ba hoạt tính khác nhau Do lượng alkaloid tinh khiết thu nhận được khác nhau (từ vài chục đến vài trăm mg), luận án không thể thực hiện thử nghiệm tất cả các mẫu trên tất cả các hoạt tính in vitro Vì vậy, chỉ lựa chọn các cấu trúc phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.
3.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa
3.3.1.1 Quét gốc hydroxyl tự do
Hình 3.30 Biểu đồ so sánh % hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu thử Chú thích: (Atp): Alkaloid toàn phần, (V0-V5): Các chất alkaloid tách Ďƣợc
Kết quả quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu thử cho thấy các mẫu alkaloid tổng và alkaloid tinh sạch có nồng độ hoạt tính từ 25 đến 200 µg/ml, với giá trị IC50 trong khoảng 60 đến 100 µg/ml, so với chứng vitamin.
C là 200 – 1000 àg/ml, với IC 50 đạt 605,24 àg/ml Các cấu trúc aporphin cho thấy hoạt tính mạnh mẽ hơn vitamin C trong việc tác động lên gốc OH tự do trong mô hình thử nghiệm in vitro Mặc dù vitamin C có khả năng chống oxy hóa cao, nhưng hoạt tính oxy hóa của nó chủ yếu thể hiện qua khả năng bắt giữ gốc superoxyd, dẫn đến sự chuyển đổi thành acid dehydroascorbic.
Kết quả so sánh % hoạt tính cho thấy Atp có độ dốc cao hơn các mẫu khác, với Atp và V5 có hoạt tính cao nhất, giá trị IC 50 lần lượt là 60,58 và 60,26 µg/ml Hoạt tính đạt trên 90% tại nồng độ 100 µg/ml trở lên Trong khi đó, V4 có hoạt tính thấp nhất trong các mẫu nghiên cứu Hầu hết các mẫu đều có % hoạt tính cao nhất khoảng 90% tại nồng độ 200 µg/ml Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa của từng alkaloid đơn chất thấp hơn so với hỗn hợp các alkaloid phân lập từ Tơ xanh.
3.3.1.2 Hoạt tính quét gốc tự do DPPH
Hình 3.32 Biểu đồ so sánh % hoạt tính quét gốc DPPH của các mẫu thử Chú thích: (Atp): Alkaloid toàn phần, (V0-V5): Các chất alkaloid tách Ďƣợc, (VitC:
Hình 3.33 Kết quả quét gốc tự do DPPH của các mẫu thử
Chú thích: (Atp): Alkaloid toàn phần, (V0-V5): Các chất alkaloid tách Ďƣợc, (Vit
Cỏc mẫu thử cú IC 50 trong khoảng 5-20 àg/ml so với vitamin C là 5,73 àg/ml
Trong nhóm alkaloid aporphin, hoạt tính cao nhất thuộc về V3 và ATP, trong khi V0 và V4 có hoạt tính thấp nhất Các alkaloid aporphin như isoboldin, bulbocapnin, apomorphin, glaucin, magnoflorin và anonain đã được công nhận bởi các tác giả trên thế giới vì khả năng chống oxy hóa của chúng Chúng có thể loại bỏ gốc tự do và ức chế hệ thống enzym oxidase hypoxanthin-xanthin Khả năng chống oxy hóa của các aporphin liên quan mật thiết đến cấu trúc hóa học của chúng.
Reticulin là một tiền chất quan trọng trong quá trình tổng hợp aporphin alkaloid ở thực vật Mặc dù hoạt tính chống peroxid hóa lipid của reticulin có IC 50 > 100 µM, nhưng sự đóng vòng tại hai gốc phenolic trên nhân benzyltetrahydroisoquinolin của nó tạo ra các aporphin alkaloid có hoạt tính mạnh hơn đáng kể, như apomorphin với IC 50 3,3 µM, boldin IC 50 20,1 µM, và isoboldin IC 50 11,0 µM Điều này cho thấy rằng gốc phenolic đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa của nhiều hợp chất tự nhiên, nhưng cấu trúc aporphin cùng với sự hiện diện của các nhóm chức cũng ảnh hưởng đến hoạt tính này.
OH phenol không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính chống oxy hóa của aporphin, điển hình như glaucin, một aporphin được methyl hóa ở các vị trí gắn nhóm thế Mặc dù không có –OH phenol, glaucin vẫn thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh với IC 50 30,3 µM Qua thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa lipid trên não chuột cô lập, Cassels (1995) kết luận rằng khả năng chống oxy hóa của các benzylisoquinolin alkaloid không phụ thuộc vào nhóm phenolic, mà dựa vào điện tử liên hợp và các hydro linh động trong nhân aporphin Các nguyên tử hydro linh động này có thể thuộc về OH-phenol hoặc từ nhân benzylisoquinolin cạnh nguyên tử nitơ trong khung aporphin.
Trong luận án này, hai phương pháp phổ biến được áp dụng theo thống kê của Md Nur Alam và cộng sự (2013) là quét gốc tự do DPPH và quét gốc hydroxyl tự do Kết quả cho thấy aporphin alkaloid của Tơ xanh có tác dụng chống oxy hóa rõ rệt, phù hợp với nhận định của nhiều tác giả khác về hoạt tính chống oxy hóa của nhóm alkaloid này.
Trong nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các alkaloid tách từ Tơ xanh, kết quả cho thấy Atp có hoạt tính cao nhất trong thử nghiệm quét gốc hydroxyl tự do, trong khi V0, V1 và V4 có hoạt tính thấp nhất Đối với thử nghiệm DPPH, V3 (IC 50 4,98 µg/ml) và Atp (6,18 µg/ml) thể hiện hoạt tính cao nhất, còn V0 (19,66 µg/ml) và V4 (19,08 µg/ml) có hoạt tính thấp nhất Cấu trúc khung oxoaporphin của V3 chứa các điện tử liên hợp mạnh nhất, khác với V2 và V5, vốn có cấu trúc tương tự với các nhóm thế methoxy tại vị trí C9, C10 và C11 Sự khác biệt trong nhóm thế này có thể làm tăng khả năng chống oxy hóa của V3 Các aporphin còn lại chỉ có các điện tử liên hợp của nhân benzylic, dẫn đến hoạt tính thấp hơn Atp, là hỗn hợp của các alkaloid, thể hiện hoạt tính cao, có thể do sự tương tác hỗ trợ giữa các thành phần trong hỗn hợp này.
Hình 3.34 Kết quả sàng lọc MTT của các mẫu thử
Chú thích: (MeOH): mẫu cao tổng MeOH, (Atp): Alkaloid toàn phần, (V0-V5): Các chất alkaloid tách Ďƣợc
Trong thí nghiệm, Doxorubicin (Dox) ở nồng độ 100 µg/ml cho thấy tỷ lệ gây độc tế bào trên 90%, do đó không trình bày kết quả trong hình Các mẫu thử nghiệm từ 20 – 100 µg/ml đều ức chế sự tăng sinh của tế bào MCF-7, với sự ức chế mạnh hơn khi nồng độ tăng Tuy nhiên, độ dốc của các đường biểu diễn thấp cho thấy sự ức chế không rõ rệt, trừ mẫu V0 và V5 IC50 của V0 được tính là 30,00 µg/ml và V5 là 39,61 µg/ml, tương ứng với các phương trình hồi quy có R² lần lượt là 0,985 và 0,996 So với nghiên cứu của Caroline Stévigny (2004), IC50 của aporphin alkaloid từ cây Tơ xanh nằm trong khoảng 20-40 µg/ml Các mẫu còn lại được chia thành hai nhóm: nhóm Atp, V3 và V4 có hoạt tính ức chế cao nhất với chỉ 10-20% tế bào sống và IC50 > 80 µg/ml; trong khi mẫu V1 có IC50 cao hơn 60 µg/ml, và tất cả các mẫu thử đều có giá trị ức chế tăng sinh nhỏ hơn 80%.
Trong thí nghiệm, Doxorubicin (Dox) được sử dụng với nồng độ 100 µg/ml, cho thấy tỷ lệ gây độc tế bào vượt quá 90% Do đó, các kết quả của Doxorubicin không được trình bày trong bảng.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả Ďƣợc trình bày trong bảng 3.21
Bảng 3.21 Tỉ lệ phần trăm gây độc tế bào của Atp, cao tổng MeOH, V0 và V1
Tỉ lệ gây Ďộc tế bào (%) Lần thử nghiệm Mẫu MeOH Mẫu Atp Mẫu V0 Mẫu V1
Kết quả sàng lọc sơ bộ trên hai dòng tế bào A549 và HeLa cho thấy các mẫu có hoạt tính ức chế mạnh, gần như đạt 100% ở nồng độ 100 μg/ml Tuy nhiên, mẫu chiết toàn phần cao tổng MeOH có hoạt tính yếu hơn, đặc biệt trên dòng tế bào ung thư phổi A549 Các alkaloid V0, V1 và alkaloid tổng cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư in vitro tại nồng độ 100 μg/ml, trong khi mẫu cao tổng MeOH không thể hiện rõ hoạt tính, có thể do chứa nhiều thành phần khác ngoài các alkaloid có hoạt tính.
Từ kết quả Ďánh giá sơ bộ, khảo sát IC 50 của các mẫu trên 2 dòng A549 và HeLa bằng phương pháp WST-1
Hình 3.35 Kết quả WST-1 của các mẫu thử
Chú thích: (MeOH): mẫu cao tổng MeOH, (Atp): Alkaloid toàn phần, (V0):
Kết quả xác định IC50 của Cassythidin trên dòng tế bào HeLa và A549 bằng phương pháp WST-1 cho thấy các mẫu có hoạt tính gây độc với giá trị IC50 trong khoảng 10 – 50 μg/ml, trong đó mẫu V0 có giá trị cao nhất là 17,87 μg/ml Mẫu MeOH có hoạt tính yếu hơn với IC50 là 221,16 μg/ml trên dòng HeLa và trên 250 μg/ml đối với dòng A549 Những kết quả này củng cố nhận định rằng các mẫu khảo sát, với thành phần hoạt chất chính là alkaloid, có hoạt tính gây độc trên tế bào ung thư HeLa và A549.
Hoạt tính gây độc tế bào của các aporphin alkaloid liên quan đến nhóm chức methylen dioxid O-CH2-O trên khung aporphin Nghiên cứu của Sara Hoet và các cộng sự (2004) cho thấy rằng nhóm các alkaloid không có nhóm thế O-CH2-O, như isocorydin, boldin và glaucin, có hoạt tính thấp với giá trị IC50.