Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn PRRS ở việt nam và một số đặc tính bệnh biến tế bào MARC145

Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) is a significant economic threat to the pig farming industry, caused by the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (PRRSV), an enveloped RNA virus classified within the Arterivirus genus This virus primarily affects pigs in natural settings, leading to severe reproductive disorders in sows, pneumonia in weaned piglets, stunted growth, reduced productivity, and high mortality rates.

Bệnh PRRS (Hội chứng suy giảm miễn dịch ở lợn) lần đầu tiên được phát hiện ở miền Bắc nước Mỹ vào năm 1987, và ngay trong năm đó, bệnh cũng xuất hiện tại Canada Chỉ sau một thời gian ngắn, PRRS đã nhanh chóng trở thành dịch bệnh trên diện rộng Thời điểm đầu, do nguyên nhân gây bệnh chưa được xác định, hội chứng này được gọi là "Bệnh bớ hiểm ở lợn" (Mystery Swine Disease - MDS) Từ năm 1989 đến 1991, bệnh đã lây lan ra hầu hết các quốc gia ở Châu Âu.

Bệnh tai xanh ở lợn, hay còn gọi là Hội chứng hô hấp và vô sinh của lợn (SIRS), đã gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi ở nhiều quốc gia như Hà Lan, Đức, Tây Ban Nha, Đan Mạch, Pháp, và Ba Lan, làm chết hàng triệu con lợn Dịch bệnh này cũng đã lan rộng sang một số quốc gia châu Á, bao gồm Nhật Bản và Hàn Quốc Năm 1992, hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St Paul, Minnesota, nơi mà Tổ chức Thú y Thế giới đã công nhận sự nghiêm trọng của tình hình dịch bệnh Các tên gọi khác nhau như Bệnh bí hiểm ở lợn (MDS) và Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (PEARS) cũng được sử dụng để chỉ căn bệnh này.

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) là một bệnh dịch nghiêm trọng, đã gây ra cái chết cho 2.000.000 con lợn và khoảng 400.000 trường hợp sảy thai tại hơn 10 tỉnh thành ở Trung Quốc vào năm 2006 Vi rút PRRS gây sốt cao từ 40°C - 42°C, được người dân địa phương gọi là "bệnh sốt cao" Nghiên cứu cho thấy vi rút này thuộc chủng Bắc Mỹ và có tính chất tiến triển nhanh chóng, với mức độ gây bệnh tăng dần theo thời gian, trái ngược với nhiều loại vi khuẩn và vi rút khác.

Tình hình nghiên cứu trong nước

Bệnh PRRS (Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn) lần đầu tiên được phát hiện tại Việt Nam vào năm 1997 trên đàn lợn nhập khẩu từ Mỹ, với 10/51 con có huyết thanh dương tính Tuy nhiên, cho đến nay, nghiên cứu về bệnh này vẫn còn hạn chế Theo thông tin không chính thức, PRRS đã trở nên khá phổ biến ở các trại chăn nuôi lợn tại Việt Nam Bệnh được xác định lần đầu tại bộ môn Hoá sinh - Miễn dịch - Bệnh lý, Viện Thú y vào ngày 19/3/2007 thông qua phương pháp RT-PCR đặc hiệu, nhưng chỉ chính thức được Cục Thú y công bố vào tháng 4/2007 trong một hội thảo chuyên ngành.

Theo số liệu của Cục Thú Y, cuối tháng 2 năm 2007, bệnh PRRS bắt ủầu xuất hiện ở tỉnh Hải Dương sau ủú lõy lan ra cỏc tỉnh ủồng bằng Bắc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 5

Bệnh PRRS đã gây ra thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn tại Bộ, Trung Bộ và Nam Bộ Từ cuối tháng 3 năm 2010, dịch bệnh này tái bùng phát tại tỉnh Hải Dương và nhanh chóng lây lan ra các tỉnh lân cận Đến ngày 19 tháng 5 năm 2010, đã có 15 tỉnh thành trên toàn quốc công bố có dịch PRRS, và tình hình dịch bệnh vẫn chưa có dấu hiệu được cải thiện.

Nghiên cứu tại các trại lợn giống ở miền Nam cho thấy tỷ lệ lợn có cú huyết thanh dương tính với bệnh dao động từ 1,3% đến 68,29%.

Tình hình dịch bệnh PRRS tại Việt Nam theo từng năm (nguồn phòng dịch tễ Cục thú y)

Hình 01-01 Tình hình dịch bệnh PRRS từ năm 2007 - 2010

Căn bệnh

Cấu trúc Arteriviruses

Virus PRRS có ba protein cấu trúc chính: nucleocapsid protein (N, ORF 7), protein xuyên màng (M, ORF 6) và glycoprotein (E, ORF 5) Hệ gen của virus PRRS được xác lập vào năm 1993, có kích thước khoảng 15,1 đến 15,5 kb và chứa ít nhất 8 khung đọc mở (ORF) để mã hóa 20 protein đã được xác định Ngoài ra, hệ gen còn bao gồm hai vùng không dịch mã (UTR) tại vị trí 5' và 3'.

ORF 1a và 1b là hai vị trí quan trọng trong vùng 5'-UTR, chiếm khoảng 80% hệ gen ORF 1a được dịch trực tiếp, trong khi ORF 1b được dịch thông qua một khung dịch chuyển ribosomal Sự kết hợp của chuỗi protein ORF1ab lớn là quá trình thủy phân protein thành các sản phẩm liên quan đến sự sao chép virus và các thành phần bản sao.

Hình 01- 04 Mô hình cấu trúc vi rút PRRS

ORFs 2-7 là ủịnh vị ngược dũng của 39- UTR, nú mó húa một loạt cỏc protein cấu trúc thuộc vi rút có liên hệ với virion như: Protein vỏ bọc (E) và Protein nhõn capsit (N) [33] Cỏc Protein này ủều ủược dịch từ một 39 UTR ủược ủịnh vị cố ủịnh trờn cỏc bộ gen ARN thụng tin (sgmRNAs) [20]

Hình 01- 05 Cấu trúc genome của vi rút PRRS

Arteriviruses có đặc trưng là phương pháp sao chép sơ cấp, sinh sản trong bào chất quanh nhân của tế bào chủ Các virion mới được giải phóng qua quá trình exocytosis từ bề mặt tế bào Tế bào chủ của virus là đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào hoạt động trong vùng phổi của lợn Bình thường, đại thực bào có chức năng tiêu diệt vi khuẩn và virus xâm nhập, nhưng với virus PRRS, chúng có thể sống lâu trong đại thực bào, dẫn đến việc tiêu diệt và giết chết tới 40% số đại thực bào Sự giảm sút số lượng đại thực bào làm suy yếu hệ thống miễn dịch, tăng nguy cơ nhiễm các bệnh kế phát.

Các chủng vi rút và phân bố

Bệnh PRRS hiện diện trên hầu hết các châu lục, ngoại trừ Châu Úc, nơi không ghi nhận sự xuất hiện của bệnh này Có hai chủng vi rút PRRS chính: một từ Châu Âu (EU) và một từ Bắc Mỹ (NA) Đáng chú ý, chủng vi rút Châu Âu đã được phát hiện tại một số khu vực ở Bắc Mỹ Tại Châu Á, PRRS ngày càng phổ biến với sự xuất hiện của cả hai chủng vi rút Châu Âu và Bắc Mỹ, mặc dù sự phân bố của chúng theo các vùng địa lý chỉ mang tính tương đối Các vi rút PRRS phân lập ở Châu Âu có cùng loại kháng nguyên nhưng khác biệt với các chủng từ Bắc Mỹ.

Bảng 01-01 So sỏnh sự tương ủồng về kiểu gen giữa cỏc chủng vi rỳt

PRRS với chủng Bắc Mỹ (VR2332)

TT Chủng Nguồn gốc Tỷ lệ tương ủồng

Hỡnh 01-06 Sự tương ủồng giữa cỏc chủng vi rỳt PRRS

Có hai kiểu gen virus ở Bắc Mỹ, bao gồm chủng VR2332 từ Mỹ và chủng Quebec 807/94 từ Canada, cùng với kiểu gen ở Châu Âu, bao gồm chủng I10 ở Hà Lan và chủng Olot ở Tây Ban Nha Sự khác biệt giữa các chủng này phụ thuộc vào sự khác nhau trong chuỗi hợp chất hữu cơ của protein trong từng chủng virus Những biến thể này được phân bố trong khu vực hoặc từ các khu vực xa hơn.

ðường truyền lây

Vi rỳt PRRS lây truyền qua các con đường khác nhau và xâm nhập vào, sinh sản trong các tế bào thực bào Bệnh có thể ở trạng thái cận lâm sàng hoặc lâm sàng, gây ra hội chứng hô hấp hoặc rối loạn sinh sản, tùy thuộc vào tuổi của lợn mắc bệnh Vi rút tồn tại trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch, phân, nước tiểu và có thể phát tán ra môi trường Ở lợn mẹ mang trùng, vi rút có khả năng lây nhiễm cho bào thai từ giai đoạn giữa thai kỳ và cũng được bài thải qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành có thể bài thải vi rút trong vòng 14 ngày, trong khi lợn con và lợn choai có thể bài thải vi rút từ 1-2 tháng Vi rút có thể phát tán thông qua nhiều con đường khác nhau.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu về các hình thức vận chuyển lợn mang trứng, bao gồm việc di chuyển trong khoảng cách lên tới 3 km, cùng với các yếu tố như bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi và thiết bị bảo hộ lao động nhiễm trùng Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc thụ tinh nhân tạo có thể bị ảnh hưởng bởi một số loài chim hoang.

Lõy truyền qua ủường: hụ hấp, miệng, sinh dục, niờm mạc và nhiễm xạ

Sinh sản trong niờm mạc, phổi hoặc cỏc ủại thực bào

Vùng cầu nối lympho bào và nhiễm vi rút huyết (trong khoảng 12 giờ sau nhiễm)

Trong cơ thể phõn bố ủến cỏc tế bào ủơn nhõn và mụ ủại thực bào

Sức ủề khỏng

Vi rỳt PRRS có khả năng tồn tại hàng năm trong điều kiện lạnh ở -70 o C Ở nhiệt độ 4 o C, vi rỳt giảm 90% hiệu lực sau một tuần, nhưng vẫn có thể phát hiện vi rỳt sau một tháng Vi rỳt này có sức đề kháng tốt trong môi trường có pH từ 6,5-7,5 Khi xử lý bằng ether hoặc chloroform, vi rỳt sẽ bị bất hoạt Đặc biệt, vi rỳt này không lây nhiễm bệnh cho người.

Bệnh lâm sàng (Phụ thuộc vào tuổi biểu hiện)

- Lợn nỏi: Sảy thai hay chết lưu, lợn vẫn ủẻ nhưng con ủẻ ra yếu hoặc tiờu thai

- Lợn sơ sinh Khó thở, có dấu hiệu tiêu chảy

- Lợn con cai sữa, lợn choai tăng tỷ lệ chết và tổn thất ủến cực ủại

- Lợn thịt Sốt, bỏ ăn

- Lợn ủực giống sốt, tinh kộm, mất tinh

Sự phân giải hay lây nhiễm lâu dài

Thải trừ vi rút qua dịch hầu, máu, nước tiểu, phân

Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng bệnh ở gia súc rất đa dạng, phụ thuộc vào chủng virus, trạng thái miễn dịch của đàn và điều kiện chăm sóc Theo ước tính, trong ba đàn tiếp xúc với mầm bệnh, một đàn không có biểu hiện, một đàn có biểu hiện mức độ vừa và một đàn có biểu hiện bệnh nặng Nguyên nhân cho sự khác biệt này vẫn chưa được làm rõ, nhưng đàn khỏe mạnh thường có mức độ bệnh nhẹ hơn Điều này cũng có thể do virus tạo ra nhiều biến chủng với sức mạnh khác nhau Thực tế cho thấy nhiều đàn có huyết thanh dương tính nhưng không có dấu hiệu lâm sàng.

Lợn nỏi giai ủoạn cạn sữa thường biếng ăn từ 7-14 ngày, sốt cao (39-40°C), có thể sảy thai (1-6%) và gặp các triệu chứng như tai chuyển màu xanh Trong giai ủoạn ủẻ và nuụi con, lợn cũng biếng ăn, mất sữa, và gặp viêm vú, dẫn đến ủẻ sớm, thai gỗ (10-15% thai chết trong 3-4 tuần cuối), và tỷ lệ chết ở lợn con có thể lên tới 30% Rối loạn sinh sản kéo dài từ 4-8 tháng, với tỷ lệ chết ở lợn con có thể đạt 70% trong tuần thứ 3-4 PRRS ảnh hưởng nghiêm trọng đến tỷ lệ sinh, giảm 10-15%, mặc dù 90% lợn có thể trở lại bình thường.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội nghiên cứu vấn đề liên quan đến tỷ lệ con chết khi sinh ở lợn hậu bị, cho thấy hiện tượng sinh sản kém, ủẻ sớm và tỷ lệ sảy thai từ 2-3%, cũng như tình trạng bỏ ăn trong giai đoạn sinh con.

Lợn ủực giống có biểu hiện bỏ ăn, sốt, ủờ ủẫn, giảm hưng phấn, và mất tính dục, dẫn đến lượng tinh dịch ít và chất lượng tinh kém, khiến lợn con sinh ra nhỏ Trong khi đó, lợn con theo mẹ thường có thể trạng gầy yếu, dễ bị tụt ủường huyết do không bú được, mắt có màu nõu, da có vết phồng rộp, và tiêu chảy nhiều, làm giảm số lợn con sống sót và tăng nguy cơ mắc các bệnh về hô hấp, chõn choói ra và ủi run rẩy.

Lợn con cai sữa và lợn choai có thể gặp phải tình trạng chán ăn, ho nhẹ và lông xác xơ, nhưng một số trường hợp không có triệu chứng rõ rệt Khi kết hợp với các bệnh khác, có thể xuất hiện viêm phổi lan tỏa cấp tính, nhiều ổ áp-xe, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, ho nhẹ, hắt hơi, chảy nước mắt, và thở nhanh Tỷ lệ chết có thể lên tới 15%.

Bệnh tích

Bệnh tớch ủặc trưng ở phổi, bao gồm viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm, đặc trưng bởi những tổn thương chắc trên các thuỳ phổi Các thuỳ bị bệnh thường có màu xám vàng, kèm theo mủ và tổn thương chắc (nhục hóa) Trên mặt cắt ngang của thuỳ bệnh, có thể thấy sự lồi ra, khụ, và nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hoại mủ xuất hiện ở mặt dưới thuỳ trên.

Trong tổ chức phôi thai học, thường xuất hiện dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm, với phế nang chứa dịch viêm và tế bào thực bào, đôi khi hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân Một đặc trưng khác của bệnh tích là sự thâm nhiễm của tế bào phế nang loại II (Pneumocyte), dẫn đến hiện tượng phế nang nhăn lại, thường thấy có thực bào bị phân hủy trong phế nang Bệnh tích có thể bao gồm xuất huyết ở phổi, phổi bị phù thũng, lỗ chồi mạch máu, hoại tử và giãn nở, cùng với thận có nhiều điểm xuất huyết Tim có thể gặp rối loạn, gan bị hoại tử với tình trạng chảy máu trắng ngà, mạch máu não mềm và mỏng, cùng với hạch não rỉ máu và hạch bạch huyết có những ổ máu băng huyết.

Chẩn đốn

Dựa vào những triệu chứng sau [11, 55]:

Triệu chứng ủường hụ hấp: Viờm phổi ở lợn con và lợn vỗ bộo

Triệu chứng của bệnh PRRS trong giai đoạn đầu bao gồm hiện tượng sẩy thai ở giai đoạn cuối thai kỳ, thai yếu, thai chết lưu, và lợn con sinh ra yếu, có nguy cơ chết trước khi cai sữa.

Bệnh cú thể không có biểu hiện đồng nhất theo lứa tuổi, do đó trong chẩn đoán lâm sàng, cần phân biệt bệnh PRRS với các bệnh như giả dại, cúm lợn, bệnh truyền nhiễm đường hô hấp do coronavirus, viêm não, viêm cơ tim và bệnh do circovirus.

1.3.7.2 Chẩn đốn bằng phương pháp giải phẫu bệnh ðối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn chuẩn bị xuất chuồng: Khi mổ khám thấy phổi rắn, chắc và có vùng xám và hồng Trên tiêu bản vi thể cho thấy viêm phổi kẽ tăng sinh ủa ủiểm hoặc lan tràn làm vỏch phế nang dày lờn, viờm nóo giữa và giảm số lượng tế bào lympho trong các tổ chức lympho ðối với sảy thai hoặc thai chết lưu thỡ khụng cú bệnh tớch ủại thể hoặc vi thể ủặc trưng

1.3.7.3 Phương pháp huyết thanh học

Có thể phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS trong huyết thanh, dịch cơ thể hoặc từ thai chết lưu thông qua một số phương pháp huyết thanh học như: kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA), miễn dịch enzym trên thảm tế bào một lớp (IPMA) và phản ứng trung hòa vi rút (VNT) Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm riêng, trong đó phương pháp ELISA cho phép chẩn đoán một số lượng mẫu huyết thanh lớn và mang lại kết quả nhanh chóng.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu 16 chủng vi rút có nguồn gốc từ Bắc Mỹ và châu Âu Kết quả cho thấy phương pháp IFA và IPMA có khả năng phát hiện các chủng vi rút với kháng nguyên tương đồng với chủng được sử dụng trong các phản ứng nghiên cứu.

Nguyên lý của phản ứng ELISA dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, có thể quan sát được thông qua hiện tượng kết tủa hoặc ngưng kết Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sự kết hợp này không thể thấy bằng mắt thường mà cần sử dụng các chất đánh dấu như chất màu huỳnh quang, chất đồng vị phóng xạ, hoặc enzyme để phát hiện Phản ứng ELISA sử dụng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzyme để tạo ra sự kết hợp với kháng nguyên được hấp phụ trên bề mặt pha rắn Sau bước rửa, nếu có sự kết hợp giữa kháng thể và kháng nguyên, kháng thể gắn enzyme sẽ không bị rửa trôi Khi thêm cơ chất hoặc chất màu, enzyme sẽ phân giải cơ chất và tạo ra màu sắc, cho phép xác định mức độ phản ứng thông qua quang phổ kế.

Các bước của phản ứng ELISA:

Bước 1: Gắn kháng nguyên - Kháng nguyên (KN) chưa biết được pha loãng trong dung dịch coating buffer với pH = 9,6 Sau đó, kháng nguyên sẽ gắn trên bề mặt của pha rắn thông qua các liên kết hydro, liên kết ion và lực Van der Waals.

Bước 2: Rửa trôi những phần kháng nguyên không bám vào bề mặt của phase rắn

Bước 3: Ủ khỏng thể kết hợp với enzyme ủặc hiệu với khỏng nguyờn

Không thể giữ lại kháng nguyên thông qua liên kết với bề mặt pha rắn; những phần không bám chặt với kháng nguyên sẽ bị rửa trôi.

Bước 4: Enzyme sẽ tác động vào một cơ chất, giúp biến đổi cơ chất này và tạo ra tín hiệu cụ thể để xác định xem có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể hay không.

Phản ứng trung hòa vi rút (Virus neutralization test)

Nguyên lý của phản ứng miễn dịch là khi virus xâm nhập vào cơ thể, nó kích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu Sự kết hợp giữa virus và kháng thể này dẫn đến việc virus mất khả năng gây bệnh, quá trình này được gọi là phản ứng trung hòa.

Phản ứng trung hòa thường được thực hiện trên môi trường tế bào trong các đĩa nhựa 96 lỗ Huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh cần được xử lý ở nhiệt độ 56 độ C trong 30 phút để diệt bổ thể Trước khi tiến hành, cần xác định hiệu giá của virus để biết được liều gây nhiễm 50% tế bào (TCID 50) Tùy thuộc vào từng loại virus, có thể sử dụng hiệu giá pha loãng virus từ 100 TCID50 đến 200 TCID50 Kết quả phản ứng dương tính cho thấy không có sự hủy hoại của tế bào, chứng tỏ có kháng thể tương ứng với kháng nguyên (virus sử dụng) Ngược lại, phản ứng âm tính cho thấy tế bào bị hủy hoại, tức là không có kháng thể tương ứng với virus Đặc biệt, đối với virus PRRS, phản ứng trung hòa có thể kém nhạy hơn các phản ứng huyết thanh khác do kháng thể trung hòa xuất hiện chậm hơn Tuy nhiên, phản ứng trung hòa là chỉ thị tốt nhất để đánh giá tình trạng bệnh trong quá khứ vì kháng thể trung hòa có thể tồn tại ít nhất một năm.

Khi ủng hộ kết quả của một phản ứng huyết thanh, cần xem xét trạng thái miễn dịch của đàn sau khi tiêm phòng vac-xin, vì hiện tại chưa có phản ứng huyết thanh học nào phân biệt được kháng thể do lợn mắc bệnh tự nhiên hay do tiêm phòng vac-xin.

1.3.7.4 Phát hiện vi rút ðể phát hiện sự có mặt của vi rút người ta thường sử dụng các phương pháp như: Phân lập vi rút, phương pháp nhân gen (PCR), phương pháp huỳnh quang giỏn tiếp ủể phỏt hiện khỏng nguyờn, phương phỏp miễn dịch bệnh lý, phương pháp miễn dịch enzym trên thảm tế bào (IPMA) khi sử dụng khỏng thể chuẩn ủể phỏt hiện vi rỳt cú trong mẫu bệnh phẩm lợn bị bệnh PRRS [9,11,30,39,41]

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát minh bởi Kary Mullis và cộng sự vào năm 1983, đã được hoàn thiện nhờ vào việc phân lập và sản xuất thành công enzym tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus, cùng với thiết kế máy chu trình nhiệt chính xác Kỹ thuật này cho phép khuyếch đại một đoạn gene đặc hiệu, với khả năng tạo ra hàng triệu phân tử DNA từ một phân tử ban đầu chỉ sau 20-30 vòng Sản phẩm PCR có thể được quan sát trên gel sau khi điện di và nhuộm bằng Ethidium Bromide, do đó PCR được coi là một trong những phương pháp nền tảng quan trọng nhất trong công nghệ sinh học hiện đại Đối với virus PRRS, do là RNA virus, trước khi tiến hành PCR, RNA của virus cần được chuyển đổi thành cDNA nhờ enzyme sao chép ngược (Reverse Transcriptase), sau đó mới thực hiện quy trình PCR như thông thường.

Thực chất của phản ứng RT-PCR là phản ứng nhân một trình tự RNA gồm 2 giai ủoạn:

(1)Tổng hợp trỡnh tự DNA mạch kộp từ sợi RNA mạch ủơn

(2) Trỡnh tự DNA 2 sợi ủược sử dụng làm khuụn ủể thực hiện phản ứng PCR Phản ứng RT-PCR cần có sự tham gia của enzyme phiên mã ngược

(Reverse Trancriptase) ủược gọi là giai ủoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đang nghiên cứu về luận văn thạc sĩ nông nghiệp, trong đó đề cập đến quá trình ủ DNA ở nhiệt độ 50 o C - 55 o C trong 30 phút Sau khi sản phẩm DNA được tạo thành, các giai đoạn của phản ứng PCR sẽ diễn ra.

Hỡnh 01-07 Sơ ủồ nguyờn lý phản ứng RT-PCR

ðối tượng nghiên cứu

Vi rút gây bệnh rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus - PRRSV).

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu này thiết lập các điều kiện phân lập vi rút và đánh giá một số tiêu chí nhận biết trên kính hiển vi so với các phương pháp tham chiếu.

Phõn lập vi rỳt PRRS ở một số ủịa phương.

Cách tiếp cận

Để phân lập được virus PRRS, cần có mẫu bệnh phẩm hoặc huyết thanh từ lợn mắc bệnh PRRS, tế bào Marc145 và chuỗi chứng dương của virus PRRS.

Khi ủó thiết lập ủược ủiều kiện, ỏp dụng phõn lập vi rỳt từ bệnh phẩm ở một số ủịa phương.

Nguyên liệu

Bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ các ổ dịch bệnh PRRS xảy ra tại Việt Nam trong giai đoạn 2007-2010, do bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch - Bệnh lý (HSMDBL) cung cấp.

Kháng nguyên chuẩn, kháng thể chuẩn

Kháng nguyên chuẩn : Vi rút PRRS chủng Châu Âu và Bắc Mỹ do Bộ môn HSMDBL và T.S Ken Inui (chuyên gia FAO) cung cấp

Khỏng thể chuẩn: Là mẫu huyết thanh thu ủược từ lợn ủược gõy nhiễm vi rút PRRS (Do chuyên gia FAO cung cấp)

Mẫu huyết thanh âm chuẩn (Do bộ môn HSMDBL cung cấp).

Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm

Vật liệu, hóa chất, dùng trong nuôi cấy tế bào

Tế bào Marc145 có nguồn gốc từ Úc

Môi trường MEM của hãng Gibco, cat # 41500-018

Tripsin EDTA của hãng Gibco, cat # 10091-148

Huyết thanh bào thai bê của hãng Gibco, cat# 15050065

PBS (Phosphate Buffer saline), pH=7,2-7,4, cat #21600069

Vật liệu, hóa chất, dùng trong phân lập vi rút

Tế bào Marc 145 ủơn lớp: chai T75 bỏm ủỏy 100 %

Mẫu bệnh phẩm (huyết thanh, phổi, hạch amidan )

Huyết thanh bào thai bê

PBS (Phosphate Buffer saline), pH=7,2-7,4

Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng RT-PCR

TRIzol, chloroform, isopropanol, and 100% ethanol are essential components in the synthesis of cDNA and PCR processes Key ingredients include nuclease-free water, random primers, RNA, first strand buffer, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), reverse transcriptase, MgCl2, 10x PCR buffer, Taq polymerase, reverse primer R2, and forward primer F2.

Húa chất dựng trong ủiện di: Agarose, dung dịch TAE, loading dye,

Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng IPMA: ðĩa tế bào Marc 145 gây nhiễm vi rút PRRS sau 2 ngày

Mẫu huyết thanh dương chuẩn, âm chuẩn

Fixing solution: PBS, Formalin, NP40

Washing buffer: PBS, Tween 80, skim milk

Vật liệu, hóa chất dùng trong nhuộm tiêu bản

Huyết thanh bào thai bê

Trong nghiên cứu khoa học, các thiết bị và dụng cụ như máy hút chân không, máy ly tâm, tủ lạnh, buồng cấy vô trùng (safety cabinet), kính hiển vi soi ngược, cối chày sứ, thủy tinh thạch anh, pince, kộo, cốc xả tip, bình xịt cồn và màng lọc 0,45μm đóng vai trò quan trọng Những thiết bị này không chỉ hỗ trợ trong việc bảo quản mẫu mà còn giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong quá trình thí nghiệm.

Hanoi University of Agriculture offers a comprehensive range of laboratory equipment essential for agricultural research, including vontex, digital pH meters (Prescisa), magnetic stirrers, PCR machines (Thermocycler), incubators, and various Corning cell culture flasks (T25, T75, T150) The laboratory is also equipped with 96-well culture plates, centrifuge tubes (15ml, 50ml), Eppendorf tubes (1.5ml, 2.0ml), and PCR tubes (1.5ml, 0.5ml, 0.2ml) that are RNase-free Additionally, the facility provides pipettes with corresponding tips (1000µl, 200µl, 100µl, 10µl, 2µl), plastic consumables, storage baskets, gloves, masks, disinfectant alcohol, and other essential laboratory machinery.

Trong quá trình nghiên cứu và thí nghiệm, các thiết bị cần thiết bao gồm buồng cấy vô trùng (safety cabinet), cân phân tích, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm 37°C với 3% CO2, kính hiển vi soi ngược, và các loại tủ lạnh với nhiệt độ khác nhau như 4°C, -30°C, và -80°C, cùng với bình nitơ lỏng Những thiết bị này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo môi trường làm việc an toàn và hiệu quả cho các thí nghiệm sinh học.

Phương pháp nghiên cứu

Nuôi cấy tế bào Marc145

Thực hiện nuôi cấy tế bào theo hướng dẫn của nhà cung cấp (Australian Animal Health Laboratory -AAHL)

Chuẩn bị đầy đủ môi trường, chai nuôi, và dụng cụ thí nghiệm là rất quan trọng cho quá trình nuôi cấy tế bào Cần thiết lập buồng cấy và trang bị các máy móc cần thiết trong phòng thí nghiệm để đảm bảo hiệu quả trong nghiên cứu và phát triển.

Lấy tế bào từ nitơ lỏng, ngâm ống tế bào vào nước nóng 37°C hoặc giữ trong tay để tế bào tan ra Sử dụng pipet để chuyển dung dịch tế bào vào ống Corning chứa 10 ml môi trường, sau đó ly tâm 1500 vòng trong 10 phút để loại bỏ dung dịch bảo quản Đánh tan cặn tế bào trong 1-2 ml môi trường và chuyển vào chai nuôi T25, bổ sung 8 ml môi trường Nuôi tế bào trong tủ ấm 37°C với 5% CO2 và theo dõi hàng ngày bằng kính hiển vi.

Phân lập vi rút PRRS

Theo hướng dần của OIE trong chương 2.08.07 về bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trang 1117-1118, Terrestrial Manual 2008 [39]

Tế bào Marc145 nuụi cấy trong chai T75 bỏm ủỏy 100%

Hút bỏ môi trường nuôi cấy

Bước 2: Gây nhiễm vi rút

Cho 200àl huyễn dịch vi rỳt PRRS vào chai tế bào

Nuôi trong tủ ấm 37 0 C 5% CO2 theo dõi sự phát triển hàng ngày

Tựy theo ủộc lực của chủng vi rỳt gõy nhiễm mà việc thu huyễn dịch vi rỳt sẽ ủược thực hiện sau 3- 5 ngày

Thu vi rút vào ống li tâm 15

Phản ứng RT-PCR

Mồi ủặc hiệu: ðể nhõn ủoạn gen ORF5 (Glycoprotein 5)

Bảng 02-01 Trỡnh tự nucleotide của primer ủặc hiệu cho PRRS

Primer Chiều Trỡnh tự nucleotide 5’-3’ Sản phẩm khuyếch ủại

Mẫu sử dụng 150àl huyễn dịch tế bào sau khi gõy nhiễm vi rỳt PRRS

Thờm 850àl Trizol vào ống Eppendorf ủó cú 150àl mẫu cần chiết tách

Vortex ủều, ủể nhiệt ủộ phũng trong 5 phỳt

Thờm 200àl Chloroform, vortex trong 30 giõy, ủể nhiệt ủộ phũng 3 phỳt

Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4 0 C

Thu dịch nổi bên trên

Thờm 500àl Isopropanol, vortex trong 30 giõy, ủể nhiệt ủộ phũng trong 10 phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 0 C

Thu cặn, thêm 1ml Ethanol 80%

Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4 0 C

Thu cặn, spin lại, sau ủú ủể khụ

Bảng 02-02 Thành phần phản ứng sinh tổng hợp cDNA

TT Thành phần Nồng ủộ Lượng ( àààà l)

Bảng 02-03 Thành phần phản ứng PCR

TT Thành phần Nồng ủộ Lượng ( àààà l)

Bảng 02-04 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Giai ủoạn Bước Nhiệt ủộ ( o C) Thời gian (giõy) Số vũng

Cho 12 µl sản phẩm PCR vào mỗi giếng của gel agarose (2% agarose trong 1x TAE), so sánh với ADN chuẩn (10 µl 100 bp ladder) Điện di gel được thực hiện ở 100V trong 30 phút Gel được nhuộm trong Ethidium Bromide 10 phút và chụp ảnh trên hộp UV.

Phản ứng IPMA (Immuno Peroxidase Monolayer Assay)

Bước 1: Chuẩn bị tế bào Marc145 trờn ủĩa 96 giếng

Chuẩn bị huyễn dịch tế bào Marc145 trong môi trường 5% huyết thanh (mật ủộ tế bào: 5x10 4 tế bào/ml)

Chia 100 àl tế bào ủó chuẩn bị ở trờn vào mỗi giếng

Nuụi trong tủ ấm 37 0 C từ 1- 2 ngày (ủến khi tế bào mọc thành 1 lớp)

Bước 2 Gây nhiễm tế bào với vi rút PRRS

Pha loãng vi rút với liều 500TCID50/ml

Thờm 100àl huyễn dịch vi rỳt vào mỗi giếng

Nuôi trong tủ ấm 37 0 C trong 2 ngày

Bước 3 Cố ủịnh tế bào gõy nhiễm

Loại bỏ mụi trường nuụi cấy, ủập nhẹ nhàng ủĩa trờn giấy thấm

Thờm 100àl dung dịch cố ủịnh (10% Formalin và 1%NP40 trong PBS) Ủ ở nhiệt ủộ phũng 30 phỳt

Rửa ủĩa 2 lần với dung dịch 0,5% Tween 80 trong PBS

Bước 4 Kháng thể 1 (huyết thanh):

Pha loãng huyết thanh với dung dịch 0.5% Tween 80 và 3% sữa gầy trong PBS trên đĩa 96 giếng, tùy thuộc vào mục đích của phản ứng: sàng lọc pha loãng ở 1/160 và chuẩn độ huyết thanh pha 4 lần ở các nồng độ 1/40, 1/160, 1/640, 1/2560 Sau khi loại bỏ dung dịch cố định, ủi nhẹ trên giấy thấm để khô Rửa thảm tế bào 200µl/1 giếng hai lần bằng dung dịch rửa PBS 0.5% Tween Chuyển 50µl huyết thanh đã pha loãng sang đĩa tế bào tương ứng và ủ ở 37°C trong 30 phút.

Rửa ủĩa 3 lần với dung dịch rửa PBS cú chứa 0.5% tween

Bước 5 Kháng thể 2: Rabbit anti pig IgG (HRP)

Pha conjugate 1/50-1/1600 với washing buffer

Loại bỏ huyết thanh, ủập nhẹ trờn giấy thấm ðể tủ ấm 37 0 C trong 30 phút

Rửa tế bào 3 lần bằng dung dịch PBS có chứa 0.5% tween 80

Pha có chất: 14ml acetate bufer pH 5.2, 1ml AEC (3-Amino -9- Ethycarbazone), 15àl H 2 O 2 vortex ủều

Loại bỏ conjugate, ủập nhẹ trờn giấy thấm

Rửa tế bào 200àl/1giếng 3 lần bằng dung dịch PBS 0.5% tween 80 Cho 50àl dung dịch AEC/1giếng ðể tủ ấm 37 0 C trong 30 phút

Bước 7 Quan sỏt tế bào và ủọc kết quả

Mẫu dương tớnh: ủỏm tế bào co cụm và nguyờn sinh chất bắt mầu ủỏ ủậm

Mẫu âm tắnh: đám tế bào bắt ựồng ựều màu hơi hồng

Bước 8 Phụ lục chuẩn bị hóa chất

500ml fixing solution PBS 10% formalin 1% NP40

Pha dung dịch PBS 0.5% tween 80 và 3% skim milk:

Chuẩn ủộ vi rỳt PRRS

ðĩa 96 giếng tế bào bỏm ủỏy 100%

Bước 1: Pha loãng vi rút

Pha loãng vi rỳt từ nồng độ 10-1 đến 10-8 bằng cách cho 900 µl MEM 5% FBS vào 8 ống nghiệm Tiến hành cho 100 µl huyễn dịch vi rỳt vào ống thứ nhất và khuấy đều bằng vortex Sau đó, chuyển 100 µl từ ống thứ nhất sang ống thứ hai và tiếp tục thực hiện tương tự cho đến ống thứ tám, nhớ thay đổi đầu pipet khi chuyển từ nồng độ này sang nồng độ khác.

Chuyển 100àl huyễn dịch vi rỳt ủó pha loóng vào ủĩa theo sơ ủồ sau:

A ðC ðC ðC ðC ðC ðC ðC

H ðC ðC ðC ðC ðC ðC ðC

Bước 3: Nuôi trong tủ 37 0 C 3% CO 2

Theo dõi sự phát triển của tế bào trong 5 ngày ðọc kết quả sau 5 ngày

Cách đánh giá kết quả âm tính: Trong trường hợp ở giai đoạn phát triển bình thường của tế bào, không có sự xuất hiện của bệnh tích tế bào, nghĩa là chỉ có tế bào khỏe mạnh.

Dương tớnh: Nếu ở ủộ pha loóng ủú xuất hiện bệnh tớch trờn tế bào (giống như giếng ủối chứng cú gõy nhiễm vi rỳt).

Nhuộm tế bào nuôi cấy trên phiến kính mỏng

Nhõn tế bào Marc 145 trờn phiến kớnh mỏng (la- men) trong 2 ủĩa 6 giếng

Chai T75 tế bào bỏm ủỏy 100%

Cho 3ml Trypsin 1X trỏng ủều mặt tế bào ðể tế bào rong tủ ấm 37 0 C cho tế bào tách nhau hoàn toàn

Vỗ nhẹ chai ủể tế bào bong hoàn toàn

Bước 3: đánh tan tế bào

Cho 10 ml MEM 5% FBS ủỏnh tan cặn tế bào

Cho 10 ml huyễn dịch tế bào trong 30ml MEM 5% FBS

Ra ủĩa 6 giếng cú la-men trong từng giếng 3ml huyễn dịch tế bào/giếng

Bước 4 : Nuụi trong tủ ấm 37 0 C 3% CO 2 sau 2 ngày bỏm ủỏy 100% dùng nhân giống PRRS

Nhân giống vi rút PRRS

Tế bào Marc 145 nuụi cấy trong 2 ủĩa 6 giếng bỏm ủỏy 100%

Bước 1: Hút bỏ môi trường nuôi cấy

Cho 50àl huyễn dịch vi rỳt PRRS /giếng theo sơ ủồ:

Nuôi trong tủ ấm 37 0 C 3%CO2 theo dõi sự phát triển hàng ngày

Bước 4: Theo dừi sự biến ủổi của tế bào

Sử dụng dung dịch Hematoxylin và Eosin ủể nhuộm

Tế bào Marc 145 gây nhiễm vi rút PRRS sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h

Bước 1: Cố ủịnh tiờu bản

Sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h lấy la-men gõy nhiễm và la-men ủối chứng ra khỏi giếng nuôi cấy

Cố ủịnh tế bào trong Acetone trong 10 phỳt

Gắn tế bào-la-men trên lam kính bằng MoutQuick

Bảo quản trong tủ âm

Tiêu bản lấy từ tủ âm ra

Nhúng tiêu bản qua hệ thống cồn 100% (1), 100% (2), 90%, 80%, 70% Rửa tiêu bản bằng nước cất trong 10 phút

Rửa tiêu bản bằng nước cất trong 5 phút

Nhúng tiêu bản qua hệ thống cồn 70%, 80%, 90%, 100% (1), 100% (2) Chuyển nhanh tiêu bản qua Xylen

Gắn phủ lờn la-men ủó nhuộm bằng la- men khỏc ðể khô tự nhiên và soi kính.

Cỏch tớnh tớnh giỏ trị TCID 50 /ml và ủọc kết quả

Tính TCID50 theo phương pháp Read Muench [59]

Log ID50= log A + X1*logF (1) Hoặc:

Ghi chỳ: A: là liều gõy chết cận trờn 50% tớnh theo ủộ pha loóng vi rỳt

B là liều gõy chết cận dưới 50% tớnh theo ủộ pha loóng vi rỳt

F là hệ số pha loãng bậc 10

X1, X2 là khoảng cỏch cõn ủối tớnh theo:

A’ là tỷ lệ phôi chết cận trên50%

B’ là tỷ lệ phôi chết cận dưới 50%

Số liệu thu thập ủược ghi chộp theo bảng số liệu

Tính toán và phân tích kết quả dựa vào hỗ trợ của phần mềm Excel

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả nghiờn cứu ủặc tớnh nhõn lờn của vi rỳt RRRS trờn tế bào Marc 145

ðặc tính nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng Việt Nam

Bảng 03-02 cho thấy rằng ở chủng vi rút phân lập tại Việt Nam, sau 48 giờ, bệnh biến tế bào bắt đầu xuất hiện và mức độ biến đổi của tế bào tiếp tục gia tăng trong các thời điểm quan sát tiếp theo Đến 120 giờ sau khi phân lập, hiện tượng bệnh biến tế bào đạt tối đa, lúc này lượng vi rút trong huyết thanh tế bào cũng ở mức cao nhất.

Bảng 03-02 Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Việt Nam

TT Thời gian (giờ) % tế bào bỏm ủỏy % tế bào co trũn CPE

Ghi chú:Thời gian (giờ): Thời gian sau khi gây nhiễm vi rút PRRS

Kết quả theo dõi biến đổi tế bào trên kính hiển vi cho thấy, ở chủng virus Việt Nam, tế bào có biểu hiện co tròn và tụ lại thành cụm giống hình chùm nho sau 48 giờ phân lập Mặc dù các cụm tế bào ngày càng gia tăng, nhưng vẫn còn một lớp tế bào bám trên đáy ống nuôi cấy.

Hình 03-02 Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm chủng vi rút phân lập ở Việt Nam

[Ghi chú:Cột 01: Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm vi rút PRRS sau 24h,48h,

72h; Cột 02: Hình ảnh tế bào không gây nhiễm vi rút]

ðặc tính nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ.37 3.2.3 ðặc tính nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng Châu Âu

Thí nghiệm được thực hiện nhằm giúp chúng tôi nhận biết và so sánh sự biến đổi bệnh tích của tế bào sau khi bị nhiễm các chủng virus có nguồn gốc khác nhau.

Bảng 03-03 Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Bắc Mỹ

Kết quả từ bảng 03-03 cho thấy, sau khi nhiễm vi rút chủng Bắc Mỹ, bệnh biến tế bào xuất hiện chỉ sau 24 giờ Sau 48 giờ, lượng tế bào sống sót chỉ còn khoảng 10%, và đến 96 giờ, lượng tế bào sống sót gần như không còn Quá trình gây nhiễm được thể hiện rõ trong hình 03-03.

Hình 03-03 Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm chủng vi rút Bắc Mỹ

[Ghi chú:Cột 01: hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm vi rút PRRS sau 24h,48h, 72h; Cột 02: Hình ảnh tế bào không gây nhiễm vi rút]

3.2.3 ðặc tính nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng Châu Âu

Kết quả từ việc gây nhiễm chủng vi rút Châu Âu cho thấy, sau 48 giờ, khoảng 20% tế bào đã co tròn và nổi lên trong môi trường nuôi cấy Đặc biệt, sau 96 giờ, hiện tượng biến đổi tế bào xuất hiện nhiều nhất.

Bảng 03-04 Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Châu Âu

Kết quả gõy nhiễm vi rỳt chủng Chõu Âu ủược thể hiện ở hỡnh 03-04

Hình 03-04 Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm vi rút Châu Âu

Kết quả xỏc ủịnh sự cú mặt của vi rỳt PRRS bằng phương phỏp RT-PCR

Để xác định chắc chắn sự hiện diện của virus PRRS trong các mẫu gây nhiễm, chúng tôi tiến hành kiểm tra RNA của virus 3 chủng đại diện bằng phương pháp RT-PCR.

Chuẩn bị RNA bằng phương pháp Trizol

Chuẩn bị cDNA bằng phương pháp sử dụng random primer

PCR sử dụng cặp mồi (primer) F2R2 với ủộ dài là 462bp

Kết quả thực hiện PCR ủược thể hiện ở hỡnh 03-05

Hỡnh 03-05 Hỡnh ảnh ủiện di agarose gel sản phẩm PCR, nhuộm

Cột 01 trình bày thông tin về vi rút PRRS chủng Châu Âu (EU), trong khi cột 02 cung cấp thang chuẩn DNA (marker) với vạch 100bp Cột 03 đề cập đến vi rút PRRS chủng Việt Nam (VN), và cột 04 mô tả ủi chứng âm, chỉ chứa tế bào marc145 mà không có vi rút Cột 05 thể hiện ủi chứng dương, trong khi cột 06 liên quan đến vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ (NA).

EU MK VN Ctrl- Ctrl+ NA

Nhận xét từ hình ảnh chạy PCR cho thấy mẫu âm không lên vạch, trong khi mẫu dương cho vạch 462 bp Chủng virus VN (do bộ môn HSMDBL cung cấp) và hai chủng virus PRRS từ Bắc Mỹ và Châu Âu đều cho vạch đặc hiệu 462 bp khi sử dụng cặp mồi F2R2 của bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch - Bệnh lý, Viện Thú y Điều này chứng tỏ việc gây nhiễm virus PRRS trên tế bào Marc145 đã thành công.

Kết quả xỏc ủịnh sự cú mặt của vi rỳt PRRS bằng phương phỏp IPMA

Ngoài phương pháp RT-PCR, chúng tôi còn áp dụng phương pháp IPMA để xác định sự có mặt của virus dựa trên cơ sở miễn dịch học Phản ứng IPMA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm có điều kiện nuôi cấy tế bào và gây nhiễm virus.

Mẫu vi rút phân lập được chuẩn độ để xác định liều gây nhiễm 50% tế bào (TCID50) Chúng tôi sử dụng liều 500 TCID50/ml để gây nhiễm trên tế bào Marc145 (100 µl/giếng, đĩa 96 giếng) Sau 2 ngày, virus xuất hiện bệnh tích trên tế bào bị nhiễm Tiến hành cố định tế bào và thực hiện phản ứng theo trình tự các bước trong phần phương pháp Trong thí nghiệm này, chúng tôi bố trí mẫu đối chứng huyết thanh dương và mẫu đối chứng huyết thanh âm do chuyên gia FAO cung cấp Huyết thanh được pha loãng theo tỷ lệ 1/40, 1/160, 1/640, 1/1280, 1/2560, và kết quả thí nghiệm được trình bày trong hình 03-06.

Nhận xét cho thấy rằng đối chứng dương có tế bào bắt màu ủậm trong nguyên sinh chất, với lượng tế bào này giảm dần khi nồng độ huyết thanh tăng lên Phản ứng IPMA diễn ra một cách hợp cách Đối chứng âm cho thấy các tế bào bắt màu hồng đều, trong khi tế bào bắt màu ủậm không xuất hiện trong nguyên sinh chất Do đó, mẫu xét nghiệm có màu sắc tương tự đối chứng dương.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội nghiên cứu luận văn thạc sĩ về nông nghiệp, tập trung vào việc phân tích mức độ ủ bệnh của các loại virus khác nhau tùy thuộc vào từng chủng virus.

Hỡnh 03-06 Kết quả thực hiện phản ứng IPMA ủối với 3 chủng ủại diện

Cột 1 đề cập đến việc gây nhiễm vi rút chủng Việt Nam, trong khi cột 2 liên quan đến vi rút chủng Châu Âu Cột 3 trình bày thông tin về vi rút chủng Bắc Mỹ Cột 4 và cột 5 lần lượt nói về các triệu chứng âm tính và dương tính liên quan đến các chủng vi rút này.

Hình 03-06 cho thấy rằng đối với vi rút chủng Việt Nam, kết quả IPMA đạt 1/1280, tương đương với kết quả đạt được với vi rút chủng Bắc Mỹ Trong khi đó, kết quả IPMA đối với vi rút chủng Châu Âu chỉ đạt 1/640 Tuy nhiên, cả ba chủng vi rút đều cho kết quả IPMA dương tính khi sử dụng huyết thanh chuẩn, cho thấy việc gây nhiễm vi rút PRRS trên tế bào Marc145 đã thành công.

So sỏnh ủặc tớnh nhõn lờn và gõy bệnh trờn tế bào của 3 chủng vi rỳt ủại diện

Kết quả theo dừi bệnh biến tế bào sau gõy nhiễm của 3 chủng ủại diện ủược thể hiện trong bảng 03-05

Bảng 03-05 kết quả so sỏnh bệnh biến tế bào cỏc chủng ủại diện

TT Thời gian (giờ) Tỷ lệ % có CPE

Tỷ lệ % có CPE (Chủng Bắc Mỹ)

Tỷ lệ % có CPE (Chủng Việt Nam)

Các thí nghiệm cho thấy sự khác biệt trong bệnh biến tế bào giữa chủng vi rút phân lập ở Việt Nam và hai chủng vi rút tham chiếu từ Châu Âu và Bắc Mỹ Cụ thể, hai chủng tham chiếu gây ra sự phá hủy hoàn toàn tế bào, với 100% tế bào bị hủy hoại vào ngày thứ ba đối với chủng Bắc Mỹ và khoảng 90% đối với chủng Châu Âu Trong khi đó, chủng vi rút ở Việt Nam gây ra biến đổi tế bào theo kiểu các tế bào tụ lại thành chùm nho nổi cộm nhưng không bong ra khỏi đáy chai nuôi, và vẫn giữ lại lớp tế bào bám ở phía dưới.

Các chủng vi rút Bắc Mỹ và Châu Âu được phân lập từ các chủng vắc-xin, có khả năng thích ứng trên tế bào và gây bệnh với tính chất phá hủy tế bào sau 24 - 48 giờ nhiễm Trong khi đó, chủng phân lập tại Việt Nam chưa trải qua nhiều lần tiếp xúc trên tế bào, do đó, hiện tượng phá hủy chủ yếu quan sát được là sự co cụm tế bào sau 48 - 96 giờ nhiễm Tốc độ phá hủy có thể nhanh hoặc chậm và không có sự tựa vào độc lực Chủng do phòng thí nghiệm cung cấp là chủng có độc lực cao, có tác dụng phá hủy tế bào rõ rệt.

Sau 48 giờ kể từ khi gây nhiễm, có thể không thấy sự phá hủy tế bào rõ rệt trong vòng 5 ngày Do đó, việc nhận biết tình trạng này chủ yếu dựa vào dấu hiệu co cụm của các tế bào sau khi nhiễm.

Quy trỡnh phõn lập vi rỳt ở ủiều kiện Việt Nam

Bước đầu tiên trong quy trình nuôi cấy tế bào là chuẩn bị đầy đủ môi trường nuôi cấy, chai nuôi, dụng cụ thí nghiệm cần thiết, buồng cấy và các máy móc hỗ trợ trong phòng thí nghiệm.

Để thực hiện bước 2, lấy tế bào từ nitơ lỏng và nhanh chóng ngâm ống tế bào vào cốc nước nóng 37°C hoặc giữ chặt trong tay để tế bào tan ra Sau đó, sử dụng pipet để hút toàn bộ dung dịch tế bào vào ống ly tâm đã chuẩn bị sẵn với 10 ml môi trường.

Để loại bỏ dung dịch bảo quản, thực hiện quay 1500 vòng trong 10 phút Tiến hành đánh tan cặn tế bào trong 1-2 ml môi trường và chuyển vào chai nuôi T25, bổ sung thêm 8 ml môi trường Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 3% CO2 Theo dõi sự phát triển của tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi.

Nhân giống tế bào Marc145 trên chai nuôi (T25, T75, T150 )

Cho 2ml Trypsin 1X trỏng ủều mặt tế bào Hỳt bỏ 1ml Trypsin ðể tế bào trong tủ ấm 37 0 C cho tế bào tách nhau hoàn toàn

Cho 3ml MEM 5% FBS ủỏnh tan cặn tế bào Ly tõm tế bào ở 1500 vũng trong 10 phút

Loại bỏ dịch nổi và ủ bỏ cặn tế bào trong 2 ml môi trường Đếm tế bào: Hút 100 µl tế bào sang 1 ống Eppendorf 1,5 ml, thêm 100 µl dung dịch trypan blue 0,4% Trộn đều và đếm bằng buồng đếm Neubauer Sau khi đếm, chuyển vào chai theo yêu cầu.

Bước 4: Nuôi trong tủ ấm 37 0 C 3% CO 2 Theo dõi tế bào hàng ngày trên kính hiển vi

Nhõn tế bào Marc 145 trờn ủĩa 96 giếng, 6 giếng:

Cho 5ml PBS lỏng ủều mặt tế bào, hỳt bỏ PBS

Cho 3ml Trypsin 1X trỏng ủều mặt tế bào Hỳt bỏ 2ml Trypsin ðể tế bào trong tủ ấm 37 0 C cho tế bào tách nhau hoàn toàn

Để chuẩn bị mẫu tế bào, cho 10ml MEM 5% FBS vào để hòa tan cặn tế bào Đếm tế bào bằng cách trộn 100µl huyễn dịch tế bào với 100µl Trypan blue Tiến hành đếm tế bào trên buồng đếm Số tế bào được tính bằng công thức: Tổng số tế bào = 4 gúc/4*2*10^4.

Pha tế bào mật ủộ 5-8x10 4 cell/ml (5000-8000 tế bào/giếng), 10ml/ủĩa 96 giếng và 18ml/ ủĩa 6 giếng, trong mụi trường MEM 5% FBS

Bước 4: Nuụi trong tủ ấm 37 0 C 3% CO 2 sau 1 ngày bỏm ủỏy 100% gõy nhiễm vi rút

Kết quả phân lập và gây nhiễm vi rút PRRS trên tế bào phụ thuộc vào tình trạng phát triển và mật độ tế bào Để có đủ lượng tế bào Marc145 phục vụ cho nghiên cứu vi rút PRRS trong phòng thí nghiệm, cần thực hiện các thí nghiệm chuẩn hóa phương pháp nuôi cấy tế bào Các thí nghiệm chủ yếu bao gồm xác định mật độ tế bào khi nuôi cấy, thời gian nuôi cấy và tỷ lệ % CO2 để tế bào phát triển tốt nhất.

Các thí nghiệm được thiết kế với tế bào nuôi ở các mật độ khác nhau, bắt đầu từ nồng độ 10^4 tế bào/ml, sau đó tăng dần theo cơ số 2 theo thời gian Đồng thời, điều chỉnh lượng CO2 sao cho phù hợp nhất để các chai tế bào phủ đạt 100% theo dự kiến.

Sau khi tối ưu húa cỏc ủiều kiện nuụi cấy tế bào, kết quả ủược chỳng tụi tổng hợp ở bảng sau:

Bảng 03-06 Kết quả xỏc ủịnh mật ủộ và tỡnh trạng phỏt triển của tế bào Marc145

(giờ) ðiều kiện Số lượng tế bào/ml

Tình trạng tế bào phủ ủỏy (%)

Theo bảng 03-06, sau 1-2 ngày ủ tế bào ở trạng thái ủang phát triển và phủ 100%, lượng tế bào cần cấy chuyển là 5x10^5 tế bào/ml và 2x10^5 tế bào/ml, trong điều kiện 37°C và 3% CO2 Với mật độ và tình trạng phát triển của tế bào như vậy, các thí nghiệm về phân lập và gây nhiễm virus, nhân giống virus đều đạt kết quả tốt.

Sau khi thiết lập và tối ưu húa cỏc ủiều kiện, quy trỡnh phõn lập vi rút PRRS gồm những bước như sau:

Bước 1: Chuẩn bị tế bào phân lập

Ra chai tế bào ở mật ủộ: 5x10 5 tế bào /ml; 2x10 5 tế bào/ml, trong ủiều kiện 37 0 C, 3%CO2 (tùy theo thời gian cần tế bào)

Chuẩn bị bệnh bệnh phẩm 10% trong môi trường RPMI

Mẫu bệnh phẩm là phổi, hạch amidan

Cân bệnh phẩm, ghi lại khối lượng bệnh phẩm

Nghiền bệnh phẩm bằng thạch anh trong cối chày sứ ủó ủược hấp tiệt trựng

Bổ sung RPMI ủể ủược huyễn dịch 10%

Ly tõm 13000 vũng trong 10 phỳt ở 4 0 C (hoặc lọc qua filter 0,45 àm) Thu huyễn dịch phía trên vào Eppendorf, loại bỏ cặn

Một phần sử dụng ủể phõn lập cũn 1 phần dỏn nhón thụng tin bệnh phẩm Bảo quản -30 0 C

Trường hợp mẫu bệnh phẩm là mỏu thỡ phải chắt huyết thanh sau ủú gõy nhiễm như bình thường

Gây nhiễm tế bào với vi rút PRRS

Soi kớnh kiểm tra tế bào trước khi gõy nhiễm phải ủảm bảo tế bào mọc dày thành 1 lớp

Loại bỏ môi trường cũ

Thờm 200àl huyễn dịch vi rỳt vào mỗi T25

Nuôi trong tủ ấm 37 0 C, 3% CO 2 theo dõi bệnh biến tế bào hàng ngày trong 5-7 ngày

Bước 3: Quan sỏt tế bào và ủọc kết quả

Tùy thuộc vào từng chủng vi rút phân lập được, bệnh biến tế bào có thể xuất hiện theo hai cách khác nhau: (1) có nhiều ổ tế bào co cụm; hoặc (2) tế bào bị phá hủy hoàn toàn.

Mẫu âm tính: Tế bào mọc thành một lớp

Việc thu huyễn dịch vi rỳt sẽ ủược thực hiện sau 3- 5 ngày, tựy theo mức ủộ hủy hoại tế bào của chủng vi rỳt cú trong bệnh phẩm

Thu vi rút vào ống ly tâm 15

Để khẳng định sự hiện diện của vi rút PRRS trong mẫu phân lập, bước 5 là sử dụng phương pháp RT-PCR hoặc IPMA Việc kiểm tra lại sự có mặt của vi rút PRRS là cần thiết sau khi thu hoạch, và các bước thực hiện cho hai phương pháp này sẽ được trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu.

Nhận xét cho thấy hầu hết các điều kiện trong quy trình phân lập virus PRRS mà chúng tôi thiết lập đều phù hợp với hướng dẫn của OIE Tuy nhiên, có một số thay đổi cần thiết để phù hợp hơn với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam, chẳng hạn như điều chỉnh lượng CO2 từ 5% xuống 2,5-3% và loại bỏ bước ly tâm sau quá trình tripsin hóa, do lượng tripsin đã được giảm bớt sau khi lỏng mặt thảm tế bào.

Kết quả phõn lập vi rỳt PRRS ở một số ủịa phương

Định dạng
Số trang	70
Dung lượng	1,27 MB