Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng được biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế bào tương ứng với từng giá trị OD; xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, xác định thời gian tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn; khảo sát nhiệt độ, pH tối ưu cho sự phát triển của chủng L. plantarum NT1.5; chọn lựa nguồn cacbon, nitơ và các nguồn khoáng. Mời các bạn cùng tham khảo.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU
- Thời gian: Từ tháng 11/2013 đến tháng 5/2014
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công Nghệ Vi Sinh-Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5, được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh thuộc Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh, đã được chứng minh có khả năng giảm cholesterol và hoạt động như một probiotic hiệu quả.
Môi trường MRS (Deman, Rogosa and Sharpe)
Cồn 96 o , cồn 70 o , H2SO4, NaOH, HCl
Các loại đường: glucose, sucrose, maltose, mật rỉ đường, xylose, manitol
Cao nấm men, pepton, bột đậu nành, bột bắp, amonium sulfate ((NH4)2SO4), urê (H 2 NCONH 2 )
Các muối khoáng: NaCl, K 2 HPO 4 3H 2 O, KH 2 SO 4 , MgSO 4 7H 2 O, CaCl 2 , MnSO4.4H2O, CaCO3,
Nước cất, nước muối sinh lý 0,85 %
2.2.3 Dụng cụ Đĩa petri, ống nghiệm, erlen, becher, pipette, pipettman, đầu típ các loại, , que cấy, lam, lamer, đèn cồn, kính hiển vi, giấy đo pH
- Máy đo mật độ quang
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Từ ống giữ chủng 20% glycerol/ -20 o C, tiến hành hoạt hóa chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 trên 5mL môi trường MRS (DeMan Rogosa and Sharpe) ủ ở 37 o C / 24-48 giờ
Từ ống môi trường lỏng đã hoạt hóa 24-48 giờ chúng tôi tiến hành cấy ria trên môi trường MRSA (DeMan Rogosa and Sharpe agar), ủ ở 37 o C, 5%CO 2 , 48 giờ
Sau 48 giờ chọn những khuẩn lạc riêng lẻ, điển hình cấy trên môi trường thạch đứng MRSA giữ chủng cho các thí nghiệm tiếp theo
2.3.2 Xây dựng biểu đồ tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế bào
2.3.2.1 Định lượng tế bào bằng phương pháp đo OD
Khi một pha lỏng chứa nhiều phân tử không tan, nó sẽ tạo thành một hệ huyền phù với độ đục do các phần tử cản ánh sáng Tế bào vi sinh vật, khi có mặt trong môi trường, cũng làm cho môi trường trở nên đục hơn Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với mật độ tế bào, và trong một giới hạn nhất định, có thể xác lập mối quan hệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Do đó, độ đục có thể được sử dụng để định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp qua việc đo độ đục ở các bước sóng từ 550 – 610 nm (Trần Linh Thước và cs., 2001).
Tiến hành pha loãng huyền dịch vi khuẩn bằng môi trường MRS sao cho thu được các huyền dịch có giá trị OD610: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5
Thực hiện định lượng tế bào bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc
Các giá trị OD610 tương ứng được pha loãng và trải trên đĩa môi trường MRSA ở các nồng độ đếm được
Xây dựng đường tương quan giữa OD610 và mật độ tế bào tương ứng với các huyền phù bằng phần mềm Excel của Microsoft
2.3.2.2 Định lượng tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Phương pháp định lượng tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc được tiến hành với các bước sau: (Trần Linh Thước và cs., 2001)
Tại các nồng độ OD tến hành pha loãng bậc 10 như: 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -
Trải 0,1 mL huyền phù sau pha loãng lên đĩa môi trường MRSA, mỗi nồng độ pha loãng trải 3 đĩa
Nhận diện khuẩn lạc đặc trưng và đếm số khuẩn lạc của chủng vi khuẩn
Lactobacillus plantarum NT 1.5 cần được pha loãng để đạt được số khuẩn lạc phân bố hợp lý, tối ưu trong khoảng từ 25 đến 250 khuẩn lạc trên mỗi đĩa Để đảm bảo độ chính xác, cần đếm số khuẩn lạc trên cả ba đĩa lặp lại ở cùng một độ pha loãng.
Tính số lượng tế bào có trong 1 mL mẫu theo công thức sau:
A: Mật độ tế bào (CFU/ mL)
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được ni: Số đĩa được đếm ở nồng độ pha loãng i
V: Số mL dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa fi: nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn đếm
2.3.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng của L plantarum NT 1.5
Sự tăng trưởng của vi sinh vật đề cập đến việc gia tăng số lượng tế bào trong quần thể vi sinh vật, trong khi tốc độ tăng trưởng biểu thị sự phát triển của chúng trong một khoảng thời gian nhất định.
Quần thể vi sinh vật có những đặc trưng tăng trưởng riêng khi nuôi cấy trong điều kiện nhất định, bắt đầu từ pha tiềm tàng (lag phase) Tiếp theo, sự tăng trưởng diễn ra với số lượng tế bào tăng lũy tiến trong pha log (log phase) Khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt và độc chất tích tụ, vi sinh vật chuyển sang pha ổn định (stationary phase) Nếu tiếp tục nuôi cấy, tế bào sẽ chết và đi vào pha suy tàn (death phase) Mỗi loại vi khuẩn có đường cong tăng trưởng riêng, do đó việc khảo sát đường cong này là cần thiết để xác định thời gian thu nhận sản phẩm thích hợp.
Điều chỉnh dịch khuẩn đã hoạt hoá đạt giá trị OD 610 tương đương 10^8 tế bào/mL Sau đó, hút 2 mL dịch khuẩn và cho vào erlen chứa 18 mL môi trường MRS Cuối cùng, nuôi dịch khuẩn ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2.
Theo dõi sự tăng trưởng của vi sinh vật được thực hiện tại các mốc thời gian 0 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ, 15 giờ, 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ, 27 giờ, 30 giờ, 33 giờ, 36 giờ, 39 giờ, 42 giờ và 48 giờ bằng cách đo OD610, nhằm xác định mật độ tế bào sau mỗi giai đoạn nuôi cấy.
Sử dụng mối tương quan giữa mật độ tế bào và OD 610 để xác định mật độ tế bào tại các giá trị OD 610 tương ứng trong từng thời điểm khảo sát.
Dựa vào những mốc thời gian và mật độ tế bào, xây dựng đường cong tăng trưởng của vi sinh vật bằng phần mềm Excel của Microsoft
2.3.4 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L plantarum NT1.5
Xác định được nhiệt độ và pH thích hợp thu được nhiều sinh khối vi khuẩn nhất
Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật phụ thuộc vào các phản ứng hóa học, trong đó nhiệt độ đóng vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng Mỗi loài vi sinh vật có một vùng sinh trưởng nhất định, giới hạn giữa nhiệt độ cực đại và cực tiểu Ngoài ra, pH, được đo bằng độ hoạt tính của ion H+, cũng tác động đến hoạt động của vi sinh vật thông qua sự tương tác với các enzyme trong tế bào Mỗi loài vi sinh vật chỉ phát triển tốt trong một khoảng pH cụ thể.
Tiến hành điều chỉnh dịch khuẩn đã hoạt hoá đạt giá trị OD tương đương 10^8 tế bào/mL Sau đó, hút 1 mL dịch khuẩn vào 9 mL môi trường MRS được điều chỉnh ở các giá trị pH lần lượt là 4, 5, 6, 7, 8 (Bevilacqua và cs., 2008).
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần
Sau thời gian nuôi cấy, dịch khuẩn được đo OD610 và dựa vào đường tương quan để xác định mật độ tế bào
Số liệu được xử lý thống kê ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 và Excel của Microsoft
Kết quả được trình bày dưới dạng: trung bình sai số chuẩn
2.3.5 Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng
Các nguồn nitơ được nghiên cứu bao gồm bột bắp, bột đậu nành, pepton, (NH4)2SO4 và urê, với nồng độ khảo sát được trình bày trong bảng 2.1 (Han và cộng sự, 2011; Altaf và cộng sự, 2006).
Bảng 2.1 Các nguồn nitơ khảo sát
Môi trường chọn lọc nguồn Nitơ tối ưu gồm có nguồn nitơ cần khảo sát, glucose
20 g/L và các thành phần còn lại của môi trường MRS như: tween 80, K2HPO4,
CH 3 CO 2 Na, MgSO 4 7H 2 O, MnSO 4 H 2 O
Các nguồn cacbon được khảo sát bao gồm sucrose, maltose, lactose, glucose, mật rỉ đường và bột bắp, với khối lượng khảo sát được trình bày trong bảng 2.2 (Altaf và cộng sự, 2006; Farooq và cộng sự, 2012; Han và cộng sự, 2011; Magdalena và cộng sự, 2010).
Bảng 2.2 Các nguồn cacbon khảo sát Thành phần Khối lượng (g/L)
Môi trường chọn lọc nguồn cacbon tối ưu bao gồm nguồn nitơ tối ưu và nguồn cacbon cần khảo sát, cùng với các thành phần khác trong môi trường MRS như tween 80 và MgSO4.
Khảo sát các nguồn khoáng: CaCl2, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, K2HPO4,
KH2PO4 với khối lượng được trình bày trong bảng 2.3.(Han và cs., 2011; Altaf và cs.,
Bảng 2.3 Các nguồn khoáng khảo sát Thành phần Khối lượng (g/L)
Môi trường chọn lọc nguồn khoáng tối ưu bao gồm nguồn nitơ tối ưu (10 g/L), nguồn cacbon tối ưu (20 g/L), và nguồn khoáng cần khảo sát
Chủng L plantarum NT 1.5 được tăng sinh trên môi trường MRS ở 37 o C, 5%
Sau 24 giờ với 5% CO2, điều chỉnh nồng độ dịch khuẩn về 10^8 tế bào/mL, sau đó bổ sung 1 mL dịch khuẩn vào 20 mL môi trường khảo, với pH và nhiệt độ được thiết lập theo kết quả ở mục 2.3.4, trong khoảng thời gian quy định ở mục 2.3.3.
Sau thời gian nuôi cấy đo mật độ tế bào L plantarum NT 1.5 bằng phương pháp đo độ đục ở bước sóng 610 nm
Các thử nghiệm đã được thực hiện lặp lại ba lần, và kết quả được phân tích bằng phương pháp ANOVA một yếu tố thông qua phần mềm Statgraphics Plus 3.0 và Excel Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình cộng ± sai số.
2.3.6 Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman
Xác định các yếu tố quan trọng ảnh hưởng chính đến quá trình lên men thu sinh khối của chủng vi khuẩn L plantarum NT 1.5
Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman
Thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman với các yếu tố gồm có: nguồn nitơ, cacbon và các nguồn khoáng đã được chọn ở mục 2.4
Mỗi yếu tố trong nghiên cứu được đánh giá ở hai mức độ: cao (+1) và thấp (-1) Thiết kế thí nghiệm được thực hiện thông qua phần mềm Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., Hoa Kỳ, nhằm ước tính các giá trị t-value, p-value và mức độ tin cậy.
Tăng sinh chủng L plantarum trên 20 mL môi trường MRS ủ ở 37 o C, 24-48 giờ
Điều chỉnh dịch khuẩn đạt giá trị OD610 có mật độ tế bào khoảng 10 8 tế bào/mL
Bổ sung 1 mL dịch khuẩn vào 20 mL môi trường khảo sát
Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ khảo sát theo mục 2.3.4., 5% CO 2 Sau thời gian nuôi cấy dịch khuẩn được đo OD 610 để xác định mật độ tế bào
Mỗi nghiệm thức của thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại
Số liệu kết quả thí nghiệm được thống kê bằng phần mềm Minitab 16.2.0
Ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh khối chủng vi khuẩn được mô tả qua phương trình hồi quy bậc nhất:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD 610
ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD 610 Để có được đường tương quan tuyến tính giữa OD610 và mật độ tế bào
Chúng tôi đã tiến hành xác định mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT 1.5 trong môi trường MRS dựa trên các giá trị đo OD610 Kết quả cho thấy mối tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD610, được trình bày rõ ràng trong bảng 3.1 và đồ thị 3.1.
Bảng 3.1: Giá trị đo OD 610 và mật độ tế bào (Log(N/mL)
Số khuẩn lạc bình quân (CFU/ mL) 7,2.10 6 1,31.10 7 1,98.10 7 2,5.10 7 3,3.10 7
Log (N/ mL) 6,857 7,117 7,297 7,398 7,519 Đồ thị 3.1 Đường tương quan tuyến tính giữa OD 610 và mật độ tế bào
Lactobacillus plantarum NT 1.5 trên môi trường MRS
Kết quả khảo sát quá trình nuôi cấy chủng L plantarum NT 1.5 trong 24 giờ cho thấy mật độ tế bào của vi khuẩn này trong huyền phù tế bào có mối tương quan tuyến tính, được mô tả bởi phương trình y = 1.603x + 6.7566 với hệ số xác định R² = 0.9617.
Giá trị OD610 log(N/mL)
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 36 giá trị OD610nm từ 0,1 – 0,5 theo phương trình y = 1,603x + 6,7566 với mức độ tin cậy 96,17%.
KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L
Dựa vào kết quả xây dựng mối tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD 610, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 Sự phát triển của chủng này được theo dõi qua các thời điểm khảo sát bằng cách đo OD 610 tại những mốc thời gian nuôi cấy, với kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và đồ thị 3.2.
Bảng 3.2 Giá trị OD 610 theo thời gian Thời gian (giờ) Giá trị OD 610 Log (N/mL)
72 1,470 ± 0,016 9,114 Đồ thị 3.2 Đường cong tăng trưởng của L plantarum NT 1.5 theo thời gian trên môi trường MRS
Dựa vào bảng kết quả giá trị OD và đồ thị đường cong tăng trưởng của L plantarum NT 1.5 trên môi trường MRS, chúng tôi nhận thấy rằng từ 0 đến 6 giờ, vi khuẩn ở pha tiềm tàng với sự tăng sinh rất ít (log từ 6,800 đến 7,349) Tuy nhiên, từ 6 đến 18 giờ, vi khuẩn tăng sinh mạnh nhất với log đạt từ 7,349 đến 10,141.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 38 đạt được sinh khối vi khuẩn tối đa trong khoảng thời gian từ 18 đến 60 giờ, với giá trị log dao động từ 10,141 đến 9,719 Sau 60 giờ, vi khuẩn bắt đầu bước vào pha suy tàn.
Từ kết quả trên chúng tôi chọn 18 giờ (log = 10,141 N/ mL) là thời gian thích hợp nhất để thu nhận sinh khối của L plantarum NT 1.5.
KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT1.5
Từ kết quả xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy và pH môi trường đến sự tăng trưởng của chủng Lactobacillus plantarum NT 1.5 Kết quả được thể hiện qua giá trị Log (N/mL) tại mỗi nhiệt độ tương ứng với pH.
Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.3 và đồ thị 3.3.
Bảng 3.3 Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) tại mỗi giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 39 Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ pH lên sự tăng trưởng của
Dựa vào bảng 3.3 và đồ thị 3.3 chúng tôi thấy rằng tại pH=4 và 40 o C
Lactobacillus plantarum NT1.5 có mức tăng trưởng thấp nhất là 7,605 ± 0,027 log ở nhiệt độ thấp và cao nhất đạt 10,011 ± 0,001 log tại 37 oC và pH 7 Do đó, chúng tôi đã chọn pH 7 và nhiệt độ 37 oC làm điều kiện nuôi cấy tối ưu cho L plantarum NT1.5 trong các thí nghiệm tiếp theo.
KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG
Dựa trên kết quả từ các thí nghiệm trước, bao gồm việc xây dựng mối tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD 610, đường cong tăng trưởng, cùng với khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của L plantarum, chúng tôi tiến hành sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng L plantarum Các nguồn dinh dưỡng được khảo sát bao gồm nguồn nitơ, nguồn cacbon và nguồn khoáng.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các nguồn nitơ: pepton, bột đậu nành, bột bắp, (NH4)2SO4, Urê với khói lượng mỗi nguồn được thể hiện trong bảng 2.1 (mục
12 pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 40 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khảo sát đến sinh trưởng của L plantarum
NT1.5được xác định thông qua giá trị Log (N/ mL) Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.4 và đồ thị 3.4
Bảng 3.4 Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát Nguồn Nitơ Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL) Bột bắp 7,193 ± 0,051 c 1,5.10 7
Trong cùng một cột, các chỉ số có cùng mẫu tự không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% theo phép thử Duncan Hình 3.4 trình bày kết quả khảo sát nguồn nitơ.
Theo kết quả thí nghiệm bảng 3.4 và biểu đồ 3.4 chúng tôi nhận thấy rằng:
Các số liệu cho thấy sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05 Trong các nguồn nitơ, nitơ hữu cơ có ảnh hưởng lớn hơn đến mật độ vi khuẩn so với nitơ vô cơ Cụ thể, pepton mang lại mật độ vi khuẩn cao nhất với giá trị Log (N/mL) là 8,721 ± 0,081, trong khi bột bắp có mật độ thấp nhất với giá trị Log (N/mL) là 7,193 ± 0,081.
10 bot bap pepton bột đậu nành (NH4)2SO4 URE
0,008 Vì vậy, pepton được chọn là nguồn nitơ tốt nhất cho sản xuất sinh khối của
Dựa trên kết quả từ mục 3.4.1, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu các nguồn cacbon, bao gồm pepton, các nguồn khoáng trong môi trường MRS và các nguồn cacbon khác cần khảo sát.
Các nguồn cacbon cần khảo sát bao gồm sucrose, maltose, glucose, lactose, mật rỉ đường và bột bắp, với khối lượng mỗi nguồn được trình bày trong bảng 2.2 (mục 2.5.3.2) Ảnh hưởng của các nguồn cacbon này đến sự sinh trưởng của L.plantarum NT1.5 được xác định thông qua giá trị Log (N/mL), và kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.5 và biểu đồ 3.5.
Bảng 3.5 Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát Nguồn Cacbon Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL)
Trong cùng một cột các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 42 Đồ thị 3.5 Kết quả khảo sát nguồn Cacbon
Theo kết quả thí nghiệm bảng 3.5 và biểu đồ 3.5, chúng tôi thấy rằng:
- Giữa các số liệu có sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05 (phụ lục 2)
- Các nguồn cacbon đều ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn
L.plantarum NT1.5 Trong các nguồn cacbon thì maltose cho mật độ vi khuẩn cao nhất (Log (N/ mL) = 9,519 ± 0,000) Glucose và mật rỉ đường ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của vi khuẩn ngang nhau (với giá trị Log (N/ mL) tương ứng là 9,155 ± 0,001 và 9,252 ± 0,026) Thấp nhất là bột bắp Log (N/ mL) = 6,912 ± 0,000
Các nguồn cacbon như maltose, glucose và mật rỉ đường đều ảnh hưởng lớn đến khả năng tăng trưởng của vi khuẩn Trong khi maltose có tác động mạnh hơn, mật rỉ đường lại tiết kiệm chi phí sản xuất hơn nhiều so với maltose và glucose Do đó, mật rỉ đường được chọn là nguồn cacbon tối ưu cho sản xuất sinh khối L plantarum NT1.5.
Dựa trên kết quả từ mục 3.4.1 và 3.4.2, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tác động của các nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Các nguồn khoáng được khảo sát bao gồm CaCO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl và KH2PO4, với khối lượng cụ thể của từng nguồn được trình bày trong bảng 2.3 (mục 2.3.5.3).
0 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000 9,000 10,000 succrose maltose glucose lactose mật rỉ đường bột bắp
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 43 Ảnh hưởng của các nguồn muối khoáng khảo sát đến sự sinh trưởng của
L.plantarum NT1.5 được xác định thông qua giá trị Log (N/ mL) Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.6 và biểu đồ 3.6
Bảng 3.6 Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khoáng khảo sát Nguồn khoáng Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL)
Trong cùng một cột, các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt đáng kể ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan Kết quả khảo sát nguồn muối khoáng được thể hiện trong Đồ thị 3.6.
Theo bảng kết quả 3.5 và biểu đồ 3.5, chúng tôi nhận thấy rằng:
Giữa các số liệu có sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05
Tất cả các nguồn khoáng khảo sát đều có tác động tích cực đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Đặc biệt, ảnh hưởng của các hợp chất như CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2 và NaCl đến mật độ tế bào vi khuẩn L plantarum NT1.5 không cho thấy sự khác biệt ý nghĩa.
CaCO3 K2HPO4 MgSO4 CaCl2 NaCl KH2PO4
Log (N/mL) của các muối khoáng CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2 và NaCl lần lượt là 8,648 ± 0,279; 9,348 ± 0,269; 8,659 ± 0,420; 9,07 ± 0,037, cho thấy chúng là nguồn khoáng tốt cho sự phát triển của L plantarum NT1.5 Trong khi đó, KH2PO4 và K2HPO4 có mật độ tế bào thấp hơn với giá trị Log (N/mL) lần lượt là 7,163 ± 0,070 và 7,665 ± 0,044.
KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN
Kết quả khảo sát các nguồn dinh dưỡng cho thấy các yếu tố như pepton, mật rỉ đường, CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2 và NaCl có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của chủng L plantarum NT1.5 Để xác định các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn, chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm theo thiết kế Plackett-Burman (P-B).
Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman bao gồm 6 yếu tố và 20 thí nghiệm, được lặp lại 3 lần, sử dụng phần mềm Minitab 16.2.0 để bố trí theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm Mỗi yếu tố được khảo sát ở 2 mức độ: (-1) cho mức thấp và (+1) cho mức cao, với giá trị của các yếu tố và kết quả phân tích hồi quy được trình bày chi tiết trong bảng 3.8.
Bảng 3.7 Mức ảnh hưởng của từng yếu tố
Giá trị mức yếu tố
Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman
Theo kết quả thí nghiệm, các yếu tố pepton, mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, và MgSO4.7H2O có ảnh hưởng lớn đến khả năng tăng sinh khối của L plantarum NT 1.5 Trong đó, mật rỉ đường là yếu tố có mức ảnh hưởng cao nhất (1,1905), tiếp theo là pepton (0,9305), với p0,05) cho thấy mô hình hồi quy đang phù hợp, và vùng khảo sát vẫn còn cách xa các cực trị Vì vậy, chúng ta sẽ tiếp tục bước leo dốc để tìm kiếm vùng chứa cực trị.
KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC
Dựa trên kết quả thực nghiệm và mô hình hồi quy từ thí nghiệm khởi đầu, các yếu tố có hệ số hồi quy âm cho thấy rằng khi nồng độ của chúng tăng cao trong vùng khảo sát, sinh khối sẽ giảm Do đó, cần điều chỉnh giá trị khảo sát của các biến này trong mỗi bước leo dốc Kết quả tính toán về bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính sẽ được trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10 Bảng tính toán bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính
Chọn bước chuyển động δ B = 1và tính toán các bước chuyển động còn lại:
Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc
STT Kí hiệu Yếu tố Log
Làm tròn bước chuyển động 0,6 1 0,05 -0,003
Dựa vào giá trị Log (N/ml) trong bảng 3.11, chúng ta nhận thấy giá trị log tăng dần từ thí nghiệm 1 (Log = 7,553 ± 0,380) đến thí nghiệm 19 (Log = 11,691 ± 0,139), sau đó bắt đầu giảm ở thí nghiệm 20 (Log = 11,488 ± 0,192) Do đó, khoảng giá trị tối ưu cho các yếu tố trong thí nghiệm tiếp theo được xác định.
KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN
Kết quả từ thí nghiệm khởi đầu và thí nghiệm leo dốc cho thấy bốn yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của chủng L plantarum NT1.5 là pepton, mật rỉ đường, CaCl2 và MgSO4.7H2O Các yếu tố này sẽ được tiếp tục khảo sát để xác định giá trị tối ưu thông qua thí nghiệm Box-Behnken.
Mỗi yếu tố được khảo sát ở 3 mức độ: cao (+1), thấp (-1) và mức độ trung tâm
Ma trận thí nghiệm bao gồm 30 thí nghiệm, trong đó có 6 thí nghiệm ở tâm Mỗi thí nghiệm được thiết kế theo nguyên tắc giữ 2 yếu tố cố định tại tâm, trong khi 2 yếu tố còn lại được thay đổi đồng thời Các yếu tố giữ tại tâm sẽ được thay đổi lần lượt để tạo ra một ma trận hoàn chỉnh.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 53 trận không trùng nhau (ngoại trừ 6 thí nghiệm trung tâm) Giá trị các biến được xác định dựa trên kết quả thí nghiệm leo dốc
Giá trị các mức độ của các yếu tố và kết quả bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.12 và 3.13
Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken
Giá trị từng mức độ (g/ L)
Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken
STT Pepton Mật rỉ đường
Kết quả hồi quy phương sai cho thấy tất cả các yếu tố đều có giá trị p < 0,05 Đặc biệt, yếu tố MgSO4.7H2O có hệ số hồi quy âm, cho thấy rằng khối lượng cao của yếu tố này sẽ giảm khả năng tăng trưởng của vi khuẩn, trong khi khối lượng thấp sẽ thúc đẩy sự phát triển của chúng.
Trong đó A, B, C, D lần lượt là các yếu tố: pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O
Giá trị Lack-of-fit với p lớn hơn mức ý nghĩa α cho thấy mô hình rất phù hợp với dữ liệu Để minh họa mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và từng cặp biến thí nghiệm, có thể sử dụng đồ thị bề mặt chỉ tiêu, như được thể hiện trong các đồ thị 3.1 và 3.2.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 55 Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 56 Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau
Kết quả giá trị tối ưu hóa của môi trường được trình bày trong bảng 3.7.3
Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố
Theo bảng 3.14 giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng lần lượt là:
Như vậy, chúng tôi xác định được môi trường tối ưu để tăng sinh khối chủng
L.plantarum NT1.5 bao gồm các thành phần và có giá trị như sau:
Nhiệt độ nuôi cấy: 37 o C, pH=7.
KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU
Sự phát triển của chủng vi khuẩn L plantarum NT1.5 trong môi trường tối ưu được theo dõi thông qua OD610 và giá trị Log (N/mL), với kết quả được thể hiện trong bảng 3.15 và đồ thị 3.16.
Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian Thời gian (giờ) Giá trị OD Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL)
48 0.912 8,219 ± 0,035 1,7.10 8 Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L plantarum NT 1.5 theo thời gian trên môi trường tối ưu
Kết quả khảo sát cho thấy chủng L plantarum NT1.5 có khả năng tăng trưởng tốt nhất trong môi trường tối ưu, đạt sinh khối cao nhất tại 33 giờ với Log = 10,007 ± 0,077 (N/mL), tương đương khoảng 1,10 x 10^10 tế bào/mL Trong khi đó, trong môi trường MRS, chủng này đạt sinh khối tối đa tại 18 giờ với nồng độ khoảng 1,3 x 10^10 tế bào/mL (log (N/mL) = 141) theo bảng 3.2, mục 3.2.
Trong môi trường tối ưu, chủng L plantarum NT1.5 đạt mật độ sinh khối cao hơn, nhưng chậm hơn 15 giờ so với môi trường MRS với mật độ tế bào tương đương Điều này cho thấy rằng các yếu tố trong thành phần môi trường tối ưu đã được xác định rõ ràng.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 59 có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tăng trưởng của chủng Lactobacillus plantarum NT 1.5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
Sau thời gian thực hiện đề tài, với những kết quả thu được chúng tôi có kết luận như sau:
Sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD 610 và mật độ tế bào trên môi trường MRS theo phương trình y = 1,603x + 6,7566 với mức độ tin cậy 96,17%
Theo đường cong tăng trưởng, thời gian thu sinh khối tối đa của L plantarum NT 1.5 trong môi trường MRS là 24 giờ pH 7 và nhiệt độ 37°C là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của L plantarum NT 1.5.
Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố như pepton, mật rỉ đường, CaCO3, MgSO4, CaCl2, và NaCl đến khả năng tăng trưởng của vi khuẩn cho thấy pepton, mật rỉ đường, MgSO4 và CaCl2 là những yếu tố chính quyết định khả năng tạo sinh khối của chủng vi khuẩn Thí nghiệm sàng lọc đã xác định rõ ràng các yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của vi khuẩn.
Xác định được khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng thí nghiệm leo dốc tìm vùng cực trị là: Pepton: 14,6 – 17 (g/ L), Mật rỉ đường: 36- 40 (g/ L), CaCl 2 : 2,3 – 2,5 (g/ L), MgSO 4 7H 2 O: 0,19 – 0, 202 (g/ L)
Xác định được giá tri tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương pháp Box-Behnken:
Xác định được thời gian tạo sinh khối nhiều nhất của chủng trên môi trường tối ưu là 33 giờ
KIẾN NGHỊ
Để tối ưu hóa môi trường lên men cho L plantarum NT 1.5 nhằm thu được sinh khối vi khuẩn tối đa và đạt hiệu quả kinh tế cao, chúng tôi đề xuất thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo.
- Khảo sát các nguồn dinh dưỡng rẻ tiền thay thế các nguồn dinh dưỡng hiện tại
- Thử nghiệm môi trường tối ưu trên quy mô lớn