Luận văn thạc sĩ bước đầu nghiên cứu kỹ thuật tách nuôi cấy protoplast khoai tây diploid phục vụ chương trình tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần

ðẶT VẤN ðỀ

Khoai tây (Solanum tuberosum) thuộc họ Solanaceae là một trong những loại rau củ phổ biến nhất ở vùng khí hậu ôn đới phương Tây và có giá trị kinh tế cao Củ khoai tây giàu protein, lipid và các vitamin như Caroten, B1, B2, B3, B6 và vitamin C Bên cạnh đó, khoai tây còn cung cấp nhiều khoáng chất quan trọng như K, Ca, Mg và P.

Khoai tây hiện đang đứng thứ 5 thế giới về diện tích trồng và thứ 4 về sản lượng Tại Việt Nam, khoai tây là cây trồng quan trọng trong cơ cấu luân canh lúa xuân - lúa mùa sớm - khoai tây, đồng thời là cây trồng lý tưởng cho vụ thu hoạch ở đồng bằng Bắc Bộ.

Hầu hết các giống khoai tây ở Việt Nam hiện nay đều có năng suất thấp và chất lượng kém, chủ yếu do thoái hóa giống, với hai nguyên nhân chính là virus và sự lão hóa của giống Hiện tượng này cần được khắc phục sớm để thúc đẩy sự phát triển của ngành sản xuất khoai tây tại nước ta.

Trong sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, công nghệ tế bào trần đã mở ra hướng đi mới để khắc phục hiện tượng trên Công nghệ này được Wenzel (1979) đề xuất thông qua sơ đồ, bắt đầu bằng cách giảm bộ bội xuống một nửa (2n=2x$), sau đó chọn lọc các thể lưỡng bội mang các đặc tính mong muốn Cuối cùng, tế bào trần của hai thể lưỡng bội được chọn lọc sẽ được dung hợp để tạo ra giống khoai tây tư bội (tetraploid), tích hợp toàn bộ đặc tính mong muốn từ hai thể lưỡng bội.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 2

Sơ ủồ tạo giống khoai tõy sử dụng tổng hợp kỹ thuật:

Lai tạo, nuụi cấy hạt phấn, nhõn ủụi nhiễm sắc thể và dung hợp tế bào trần (Wenzel và cộng sự, 1979)

Các dòng tứ bội a1 *a2a3a4 a1a2 *a3a4 a1a2a3 *a4 a1a2a3a4 * khởi ủầu (4x)

Tạo dòng nhị bội nhờ kỹ thuật parthenogenetic

Tạo dũng ủơn bội bằng nuụi cấy hạt phấn - nhị bội hoỏ tạo 2x

Dũng tứ bội với ủặc tớnh a1 *a2 *a3 *a4 * ủịnh hướng ủó tổ hợp a: Bộ genom ủơn bội

Trên thế giới, có nhiều chương trình nghiên cứu thành công trong việc tạo giống mong muốn thông qua kỹ thuật dung hợp tế bào trần Tuy nhiên, tại Việt Nam, nghiên cứu về vấn đề này còn hạn chế Để phát triển giống cây trồng, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu các kỹ thuật tách và nuôi cấy protoplast của một số dòng khoai tây nhị bội (2n=2x).

“B ướ c ủầ u nghiờn c ứ u k ỹ thu ậ t tỏch, nuụi c ấ y protoplast khoai tõy diploid ph ụ c v ụ ch ươ ng trình t ạ o gi ố ng khoai tây b ằ ng dung h ợ p t ế bào tr ầ n”.

MỤC ðÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tách và nuôi cấy protoplast từ các giống khoai tây nhị bội nhằm tạo ra vật liệu cho dung hợp tế bào trần, từ đó phát triển giống khoai tây kháng bệnh virus.

- Xỏc ủịnh ủược dung dịch enzym thớch hợp cho tỏch protoplast từ mụ lá và kỹ thuật tách protoplast từ mô lá khoai tây

- Xỏc ủịnh thời gian ủ enzym thớch hợp cho việc tỏch protoplast từ mô lá khoai tây

- Xỏc ủịnh ủược mụi trường và cỏc yếu tố vật lý thớch hợp cho nuụi cấy protoplast

- Xỏc ủịnh mụi trường tạo Microcalus

- Xỏc ủịnh cỏc thụng số tối ưu cho quy trỡnh dung hợp bằng hoỏ chất PEG (nồng ủộ PEG, thời gian xử lý PEG, phương phỏp rửa PEG

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.30

ðối tượng vật liệu, ủịa ủiểm và thời gian nghiờn cứu

- ðối tượng nghiên cứu: Giống khoai tây diploid kháng virus X, virus

Y có nguồn gốc từ ðức

- Vật liệu nghiên cứu: các dòng B208, B186, A16, A56, H1959/195 HI1929/34

- ðịa ủiểm: ðề tài ủược tiến hành tại phũng CNSH khoai tõy của Viện Sinh Học Nông Nghiệp - trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội

- Thời gian tiến hành ủề tài: Từ thỏng 5/2008 – 1/2009

Nội dung nghiên cứu

Quá trình nghiêm cứu chúng tôi tiến hành các thí nghiệm sau:

3.2.1 Nghiên c ứ u, hoàn thi ệ n quy trình tách, nuôi c ấ y và tái sinh protoplast 3.2.1.1 Thớ nghiệm: Xỏc ủịnh nồng ủộ enzym tối ưu (cellulose/macerozym) cho các dòng khoai tây nhị bội

Sử dụng dung dịch enzym của moller và cỏc dung dịch khỏc ủể xỏc ủịnh enzym thớch hợp cho dũng nhị bội

Dung dịch I: Dung dịch ezym của moller có M/C=0.2g/0.8g/100ml Dung dịch II: Nền dung dịch I nhưng có M/C=0.1/0.6/100ml

Dung dịch III: Nền dung dịch I nhưng có M/C=0.1g/0.8g/100ml

3.2.1.2 Thớ nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu quả tỏch protoplast

3.2.1.3 Thớ nghiệm 3: Ảnh hưởng của phương phỏp khủ trựng mụi trường ủến khả năng phân chia của protoplast

Tiến hành khử trùng môi trường nuôi cấy bằng các cách sau:

CT1: Khử trựng mụi trường nuụi bằng nhiệt ủộ (hấp paster): 121 0 C trong 20 phút

CT2: Khử trùng bằng màng lọc vô trùng (không hấp)

3.2.1.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau tới thời gian phân chia

Protoplast sau khi tỏch ủược nuụi trờn cỏc loại mụi trường lỏng sau: SKM, VKM, KM8P, 24a, 24b

3.2.1.5 Thí nghiệm5: Nghiên cứu ảnh hưởng các môi trường rắn tới sự hình thành microcallus

Cỏc tế bào ủó phõn chia sau 4 tuần ủược chuyển sang cỏc mụi trường tạo microcallus (OX1, OX2, OX3, OX4, OX5)

3.2.1.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chuyển sang môi trường tạo microcallus tới sự hình thành microcallus

Trong môi trường tối ưu cho sự hình thành microcallus, chúng tôi tiến hành thí nghiệm về thời gian chuyển giao Các dòng protoplast sẽ được chuyển sang môi trường tạo microcallus sau 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần phân chia.

3.2.2 B ướ c ủầ u xõy d ự ng quy trỡnh dung h ợ p protoplast b ằ ng hoỏ ch ấ t

3.2.2.1 Thớ nghiệm 1: Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng ủộ PEG khỏc nhau tới hiệu suất dung hợp

Tiến hành dung hợp bằng PEG ở cỏc nồng ủộ 22.5%, 25%, 30%, 40%

3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ PEG tới hiệu quả dung hợp

3.2.2.3 Thớ nghiệm: Nghiờn cứu ảnh hưởng của mật ủộ protoplast tới hiệu suất dung hợp bằng PEG

3.2.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp rửa PEG khỏc nhau ủến chất lượng protopast sau dung hợp

Sau khi ủ PeG ta tiến hành rửa PeG bằng cách sau:

CT1 : Lần 1 rửa bằng dung dịch rửa Ca 2 , lần 2 rửa bằng môi trường nuôi CT2 : Lần 1 rửa 2 lần bằng dung dịch rửa Ca 2 , lần 2 rửa bằng môi trường nuôi

CT3 : Lần 1 rửa 1 lần bằng dung dịch rửa Ca 2 , lần 2 rửa bằng môi trường nuôi

CT3 : Lần 1 rửa 2 lần bằng dung dịch rửa Ca 2 , lần 2 rửa bằng môi trường nuôi

3.2.2.5 Thớ nghiệm5: Ảnh hưuởng nồng ủộ Ca 2 + ủến sự tỏi tạo thành tế bào và sự phân chia protoplast

Chỳng tụi tiến hành bổ sung Ca(NO3)2 ở cỏc nồng ủộ: 1000mg/1, 1500mg và 2000mg/1

Phương pháp nghiên cứu

Cỏc dũng khoai tây diploid được ưa chuộng trong nuôi cấy in vitro nhằm tạo ra nguyên liệu tách tế bào trần Môi trường nuôi cấy sử dụng là môi trường MS, được bổ sung thêm chất kháng ethylen để tăng chỉ số diện tích lá, phù hợp cho quá trình tách protoplast Công thức môi trường bao gồm 25g/l đường saccharose, 6,5g/l agar, và pH được điều chỉnh ở mức 5,7.

Cõy in vitro ủược ủặt trong phũng nuụi theo chế ủộ nhiệt ủộ là 22 0 C, cường ủộ chiếu sáng là 3000-4000 lux, quang chu kỳ là 16h chiếu sáng/ngày

Cú thể minh họa quy trỡnh tỏch tế bào trần theo sơ ủồ sau

Dòng khoai tây A15 Sau 3- 4 tuần nuôi cấy in vitro

1-2g lá cắt nhỏ, ngâm trong dung dịch rửa II - 20 phút Ủ trong dung dịch enzym 12 - 16h

Dung dịch ủ lọc qua hệ thống rây lọc 2 lớp.Bổ sung 5ml dung dịch tráng

Tiến hành ly tâm ở 200-300rmp trong 15'

Protoplast nổi lên, hình thành lớp băng màu xanh ủậm

2ml dung dịch nổi + 5ml dung dịch rửa I, ly tâm ở 300-400rmp trong 5' - Protoplast lắng xuống

Hút phần lắng + 1ml môi trường

Cỏc lỏ non của khoai tây diploid in vitro 3-4 tuần tuổi được sử dụng làm nguyên liệu tách tế bào trần Quy trình tách tế bào trần được thực hiện theo phương pháp Mollers (1990) với những cải tiến và bổ sung các môi trường khác Các bước trong quy trình này bao gồm nhiều giai đoạn quan trọng để đảm bảo hiệu quả tách tế bào.

+ Cắt nhỏ 1-2g lỏ khoai tõy trong ủĩa petri vụ trựng (Φ 9cm) với 10ml dung dịch gây co nguyên sinh (dung dịch rửa II-phụ lục 2)

+ Sau khi ủ 15-20 phút trong dung dịch gây co nguyên sinh, dùng pipet hút bỏ dung dịch ra (chú ý không hút theo mẩu lá cắt)

+ Tiếp tục ủưa vào ủĩa petri dung dịch enzym (phụ lục 2) với liều lượng 15-20ml/1g lá Quá trình ủ enzym kéo dài từ 12-16h

Trước khi tách tế bào trần, ủi petri được lắc nhẹ và quá trình tách tế bào được tiến hành qua hệ thống rây lọc 2 lớp 30µm và 50µm Bổ sung 5ml dung dịch trỏng để trộn, sau đó chia toàn bộ dung dịch vào các ống ly tâm và tiến hành ly tâm ở tốc độ 200-300 vòng/phút trong 15 phút Sau khi ly tâm, các tế bào trần sẽ nổi lên, hình thành một lớp băng có màu xanh đậm trên bề mặt ống ly tâm.

+ Dùng micropipet hút nhẹ nhàng lớp tế bào trần này (2ml) cho vào ống ly tâm, bổ sung thêm 5ml dung dịch rửa I (phụ lục 2), tiếp tục ly tâm

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đang tiến hành nghiên cứu liên quan đến luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp Trong quá trình thí nghiệm, sau khi lắng đọng tế bào trần, dung dịch phía trên sẽ được hút bỏ bằng micropipet Tiếp theo, bổ sung thêm 3ml dung dịch rửa để đảm bảo chất lượng mẫu.

I (phụ lục 2) rồi tiếp tục ly tõm, lặp lại 2-3 lần Nồng ủộ tế bào trần ủược xỏc ủịnh trờn buồng ủếm dưới kinh hiển vi

Số protoplast thu ủược trờn 1ml mụi trường (X) ủược tớnh bằng cụng thức sau:

X = a x 25 x 5 x 10 4 x 1/k Trong ủú: a = là số tế bào trung bỡnh cú trong một ụ k = là ủộ pha loóng

Dung hợp protoplast được thực hiện bằng cách sử dụng ủĩa petri thủy tinh và ủĩa petri nhựa Protoplast của hai dòng khoai tây nhị bội được trộn lẫn theo tỷ lệ 1:1 và sau 15 phút, các protoplast sẽ kết lắng Tiếp theo, thêm PEG vào và ủ trong khoảng 1-10 phút Sau khi ủ, loại bỏ PEG bằng dung dịch Ca2+ và rửa lại bằng môi trường nuôi cấy Mỗi ủĩa dung hợp cần được thực hiện với 3 lần lặp lại.

3.3.4 Các ch ỉ tiêu theo dõi

- Thời gian bắt ủầu phõn chia tế bào

- Sự kết gắn tế bào sau dung hợp

- Chất lượng tế bào sau khi dung hợp

- Thời gian và khả năng tạo microcallus

- Số lượng và thời gian tạo marcocallus

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Thớ nghiệm 1: Xỏc ủịnh nồng ủộ enzym tối ưu (C/M) cho cỏc dũng khoai tây nhị bội

Mỗi giống khoai tây khác nhau có đặc điểm riêng về độ dày của thành tế bào và độ dày của mủ lỏ Chính vì vậy, mỗi giống khoai tây sẽ có một enzym phù hợp để phân hủy thành tế bào và giải phóng protoplasm mà không ảnh hưởng đến màng nguyên sinh chất tế bào.

Chúng tôi tiến hành tách protoplast theo phương pháp của Moller với một số cải tiến phù hợp cho từng giống nhị bội nghiên cứu Phương pháp sử dụng enzym để tách protoplast được áp dụng rộng rãi hơn so với phương pháp hóa chất Nghiên cứu cho thấy hàm lượng C/M có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách và chất lượng protoplast Trong thí nghiệm này, chúng tôi thay đổi tỷ lệ M/C để tìm ra tỷ lệ enzym thích hợp nhằm đạt được mật độ protoplast (P/ml) cao nhất Kết quả thu được như sau:

Bảng 1: Ảnh hưuởng của dung dịch enzym khỏc nhau ủến khả năng tỏch protoplast

P/ml số protoplast/ml dung dịch tách

Hình 1: Ảnh hưởng của dung dịch enzym khác nhau ủến hiệu quả tỏch protoplast ở dũng A16

Hỡnh 2: Ảnh hưởng của dung dịch enzym khỏc nhau ủến hiệu quả tỏch protoplast ở dòng B208

Sự thay đổi tỷ lệ M/C ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tách protoplast Ngay cả khi sử dụng cùng một loại dung dịch enzyme để tách cho từng giống khoai tây khác nhau, số lượng protoplast thu được cũng sẽ khác nhau.

Số lượng protoplast tách được dao động từ 5,83x10^5 P/ml đối với dòng B186 sử dụng dung dịch enzym II, đến 36,67x10^5 P/ml cho dòng H195 với cùng dung dịch Dung dịch enzym I cho hiệu quả tách protoplast cao nhất, với các dòng A56 đạt 30,83x10^5 P/ml, H34 là 31,26x10^5 P/ml, và B208 đạt 32,67x10^5 P/ml.

Như vậy chúng ta có thể kết luận rằng dung dịch enzym I tách phù hợp với nhiều giống nhất.

Thớ nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu suất tỏch protoplast

- Dung dịch enzym II có tỷ lệ M/C=0.1g/0.6g/100ml phù hợp tách cho dũng H195 ủạt tỷ lệ cao nhất là 36,67x10 5 P/ml

- Dung dịch enzym III có tỷ lệ M/C=0.1g/0.8g/100ml là tối ưu cho việc tách protoplast của dòng A15, với tỷ lệ 26.67x10 5 P/ml và dòng A1628.24x10 5 P/ml

4.2 Thớ nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu suất tỏch protoplast

Việc lựa chọn dung dịch enzym phù hợp cho quá trình tách protoplast của từng giống cây là rất quan trọng để đạt hiệu suất tối ưu Bên cạnh đó, xác định thời gian ủ enzym thích hợp cho từng giống cũng không kém phần quan trọng, vì thời gian ủ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách protoplast Mỗi enzym cần một khoảng thời gian ủ nhất định để phát huy hiệu quả, nếu thời gian ủ không đủ, số lượng protoplast thu được sẽ thấp, dẫn đến hiệu suất tách giảm Ngược lại, nếu thời gian ủ quá lâu, có thể gây tổn thương cho tế bào, làm tăng tỷ lệ tế bào bị vỡ và ảnh hưởng xấu đến hiệu suất tách.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ enzym đến từng giống cây trồng, nhằm cải thiện hiệu quả sử dụng macerozym trong quá trình ủ Kết quả cho thấy thời gian ủ enzym có tác động đáng kể đến sự phát triển của tế bào.

Bảng 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu quả tỏch Proptoplast dòng A15

Hỡnh 3 Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu quả tỏch protoplast

Kết quả từ Bảng 2 cho thấy thời gian ủ enzym có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả tách protoplast của dòng A15 Cụ thể, trong bốn khoảng thời gian ủ (13h, 14h, 15h, 16h), tỷ lệ protoplast dao động từ 5.83x10^5 P/ml ở thời gian ủ 16h đến 26.67x10^5 P/ml.

Khi sử dụng dung dịch enzym II và ủ trong 15 giờ, tỷ lệ protoplast thu được cao nhất là 26.67x10^5 P/ml với protoplast tròn đều và đẹp Tuy nhiên, sau 16 giờ ủ, protoplast bị vỡ nhiều Qua các thời gian ủ khác nhau, tỷ lệ protoplast cũng có sự thay đổi: sau 13 giờ đạt 10.83x10^5 P/ml, sau 14 giờ là 24.17x10^5 P/ml, sau 15 giờ đạt 26.67x10^5 P/ml, và sau 16 giờ giảm xuống còn 18.33x10^5 P/ml Do đó, dung dịch enzym III kết hợp với thời gian ủ 15 giờ được xác định là tối ưu cho việc tách protoplast.

Bảng 3: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến khả năng tỏch

Dung dịch I (P/ml) Dung dịch II

Thời gian ủ enzym có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất tách protoplast của dòng khoai tây B186 Các thí nghiệm được thực hiện với thời gian ủ lần lượt là 13h, 14h, 15h và 16h, cho thấy tỷ lệ protoplast thu được khác nhau Cụ thể, ở 13h tỷ lệ protoplast đạt 10,33x10^5, ở 14h là 17,5x10^5, ở 15h cao nhất với 26,67x10^5 và ở 16h giảm xuống còn 18,33x10^5 Đối với dung dịch enzym II và III, tỷ lệ protoplast thu được thấp hơn, dao động từ 6,67x10^5 đến 15,83x10^5 Kết quả cho thấy dòng B186 đạt hiệu suất tách protoplast cao nhất ở thời gian ủ 15h với dung dịch enzym I.

Theo số liệu, dung dịch enzym II cho thấy thời gian ủ 14 giờ mang lại hiệu suất tách protoplast cao nhất, đạt 36,67 x 10^5 p/ml Ngược lại, thời gian ủ 16 giờ dẫn đến hiệu suất tách protoplast thấp nhất, chỉ đạt 10,0 x 10^5 p/ml do thời gian ủ quá lâu gây ngộ độc và làm chết nhiều tế bào, dẫn đến mật độ protoplast thấp nhất.

Dung dịch enzym I và enzym II không phù hợp cho quá trình tách protoplast Cụ thể, mật độ protoplast trong dung dịch enzym I dao động từ 9,21x10^5 đến 18,33x10^5, trong khi đó, mật độ protoplast trong dung dịch enzym II biến động từ 8,68x10^5 đến 10,83x10^5.

Nh− vậy qua số liệu bảng 2 chúng tôi nhận xét với giống H195 ở thời gian ủ 14h với dung dịch enzym II là thích hợp nhất cho việc tách protoplast

Hình 5 ảnh hưởng của thời gian ủ enzym đến khả năng tách protoplast dòng khoai tây H 195

Dựa vào số liệu, dung dịch enzym II cho thấy thời gian ủ 14 giờ đạt hiệu suất tách protoplast cao nhất với 36,67 x 10^5 p/ml Ngược lại, thời gian ủ 16 giờ lại có hiệu suất tách protoplast thấp nhất chỉ đạt 10,0 x 10^5 p/ml, do thời gian ủ quá lâu khiến nhiều tế bào bị ngộ độc và chết, dẫn đến mật độ protoplast giảm.

Dung dịch enzym I và enzym II không phù hợp cho việc tách protoplast Trong khi đó, dung dịch enzym I cho mật độ protoplast biến động từ 10,83 x 10^5 đến 19,21 x 10^5, còn dung dịch enzym III cho mật độ protoplast biến động từ 9,17 x 10^5 đến 13,33 x 10^5.

Như vậy số lượng bảng cho ta nhận xét rằn với giống H195 ở thời gian ủ 14h và với dung dịch enzym II là thích hợp nhất cho việc tách protoplast

Dung dịch I (P/ml) Dung dịch II

Theo số liệu, dung dịch enzym I cho thấy nồng độ protoplast thu được cao nhất là 30,83x10^5 p/ml ở thời gian ủ 14h, trong khi nồng độ thấp nhất là 10,33x10^5 p/ml ở 16h Đối với dung dịch enzym II, nồng độ protoplast dao động từ 8,67x10^5 p/ml ở 16h lên 19,17x10^5 p/ml ở 14h Tương tự, dung dịch enzym III cũng cho kết quả nồng độ protoplast từ 9,17x10^5 p/ml ở 16h đến 15,38x10^5 p/ml ở 14h Do đó, thời gian ủ 14h với dung dịch enzym I là tối ưu nhất cho việc tách protoplast ở dòng A56.

Theo số liệu, giống A16 có thời gian ủ là 14 giờ, với dung dịch enzym III cho tỷ lệ protoplast thu được cao nhất là 28,24 x 10^5 Ở thời gian ủ khác, tỷ lệ protoplast thu được thấp hơn so với thời gian ủ lâu, do các tế bào có thể bị vỡ, dẫn đến protoplast không còn nguyên vẹn Đối với thời gian ủ 13 giờ, chưa đủ để phân giải các tế bào ra khỏi màng, dẫn đến tỷ lệ protoplast thấp.

Nghiên cứu này cho thấy rằng hiệu suất tách của mỗi giống không chỉ phụ thuộc vào từng enzyme mà còn bị ảnh hưởng đáng kể bởi thời gian ủ.

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của phương thức khử trùng môi trường tới khả năng phân chia của Protoplast

tới khả năng phân chia của Protoplast

Môi trường nuôi cấy protoplast khác biệt so với môi trường nuôi cấy mô thông thường, yêu cầu duy trì áp suất thẩm thấu ổn định cho protoplast cho đến khi chúng hình thành tế bào Đồng thời, cần cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dưỡng như auxin, cytokinin và các axit amin Trong môi trường này, có nhiều chất dễ bị phân hủy hoặc biến tính bởi nhiệt độ cao, đặc biệt là một số loại đường Do đó, chúng tôi tiến hành nuôi cấy protoplast trên hai loại môi trường khác nhau.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học nông nghiệp với luận văn thạc sỹ Kết quả thu được từ hai môi trường nghiên cứu: môi trường hấp vụ trụng và môi trường lọc vụ trụng cho thấy những phát hiện quan trọng.

- Trờn mụi trường lọc cỏc tế bào sau 3 ngày ủều cú hiện tượng phõn chia (100% tế bào phõn chia), quỏ trỡnh phõn chia diễn ra mạnh mẽ ủồng ủều

Trong môi trường hấp, hiện tượng phân chia tế bào chỉ bắt đầu sau 5 ngày, với quá trình này diễn ra không đều, khi chỉ có một số tế bào thực hiện phân chia trong khi các tế bào khác vẫn không hoạt động Sau 7 ngày, các xác tế bào bắt đầu xuất hiện.

Hình 6: Sự phân chia của protoplast B208 sau 3 ngày nuôi cấy

Kết luận rằng, môi trường được khử trùng bằng phương pháp lọc mang lại hiệu quả phân chia cao hơn so với môi trường khử trùng bằng phương pháp hấp.

Từ ủú chỳng tụi sử dụng cỏc mụi trường lọc vụ trựng ủể nuụi cấy protoplast cho các thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghiệm4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và các dòng khác nhau với thời gian phân chia của protolast

cấy và các dòng khác nhau tới thời gian phân chia của protoplast

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng quyết định sự thành công trong quá trình nuôi cấy tái sinh protoplast Trong môi trường này, protoplast sẽ tái sinh thành tế bào, phân chia và tạo ra microcallus Theo quan niệm sinh học hiện đại, mỗi tế bào riêng lẻ đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của cơ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào có khả năng phát triển thành một cây hoàn chỉnh.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã thực hiện nghiên cứu về ảnh hưởng của các môi trường khác nhau đến khả năng chia và tái sinh của tế bào trong luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong khả năng này tùy thuộc vào từng loại môi trường.

Protoplast của các giống khoai tây khác nhau có sức sống và khả năng phân chia khác nhau, ngay cả khi được nuôi trong cùng một môi trường.

Bảng 7: Thời gian protoplast phân chia của các dòng trên các môi trường khác nhau ðơn vị: Ngày Môi trường

Hình 7: Protoplast của dòng B186 phân chia sau 7 ngày nuôi cấy trên các môi trường SKM, KM8P, 24a, 24b

Bảng số liệu trong bảng 5 cùng với các hình ảnh thu được cho thấy rõ rệt ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến sự phân chia của protoplast.

Trên môi trường SKM và KM8P, protoplast thường mất từ 4 đến 7 ngày để xuất hiện hiện tượng phân chia, với tốc độ phân chia thấp và không đồng đều Trong hai loại môi trường này, dòng B186 và B208 là những dòng protoplast phân chia sớm nhất, cũng mất 4 ngày để bắt đầu phân chia Tuy nhiên, sau 2 tuần nuôi cấy, các protoplast này đã hình thành các sắc tế bào ở dưới đáy ống nuôi cấy.

Môi trường 24a và 24b cho thấy hiệu quả nuôi cấy vượt trội, với hầu hết các dòng tế bào đều có hiện tượng phân chia sau 2 ngày Các protoplast trong môi trường này phân chia đồng đều hơn và tiếp tục quá trình phân chia sau 2 tuần nuôi cấy.

Kết quả cho thấy các protoplast từ các dòng khác nhau có khả năng cảm ứng phân chia không đồng đều Đặc biệt, protoplast của hai dòng B186 và B208 phản ứng nhanh chóng và hiệu quả nhất, với hiện tượng phân chia sớm và mạnh mẽ.

Sau 7 ngày nuôi cấy protoplast của dòng B208, kết quả cho thấy trên môi trường 24a và 24b, tế bào phân chia mạnh mẽ và hình thành các cụm tế bào Trong khi đó, trên môi trường SKM và KM8P, các tế bào mới chỉ bắt đầu cảm ứng phân chia mà chưa hình thành cụm tế bào, với sự phân chia diễn ra không đồng đều và tế bào có hiện tượng thâm đen.

Môi trường 24a và 24b là những môi trường lý tưởng cho việc nuôi cấy protoplast tỏi, và chúng đã được chứng minh là phù hợp cho các thí nghiệm tiếp theo.

Trong quá trình nuôi cấy, để đảm bảo áp suất thẩm thấu và duy trì tốc độ phân chia tế bào, sau một tuần, cần bổ sung 1-3 giọt dung dịch môi trường mới.

Thí nghiệm 5: Kết quả môi trường thích hợp cho tạo microcallus

Khi tế bào phân chia thành các cụm tế bào có kích thước nhất định, chúng sẽ hình thành các sợi liên bào khi chuyển sang môi trường tạo microcallus (môi trường rắn) Quá trình này sẽ kích thích và phát triển thành khối microcallus.

Sau 3-4 tuần nuôi cấy, các cụm Protoplast sẽ được chuyển sang các môi trường cứng khác nhau, và sau 4 tuần, Microcallus sẽ hình thành Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm trên nhiều loại môi trường tạo microcallus khác nhau (OX1, OX2, OX3, OX4, OX5), và kết quả cho thấy rằng mỗi môi trường mang lại chất lượng và số lượng Microcallus khác nhau.

Dòng B186 sau 4 tuần phân chia trong môi trường lỏng (24a hoặc 26b) ủược chuyển sang mụi trường cứng tạo microcallus, ta ủược kết quả sau:

Môi trường OX5 là điều kiện tối ưu cho phản ứng cảm ứng, cho phép tạo ra microcallus với mật độ dày đặc Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường cứng, các hạt gợn trắng trong sẽ hình thành và tiếp tục phát triển, tăng dần về kích thước để tạo thành microcallus.

Trong môi trường OX1, OX2 và OX3, phản ứng hình thành Microcallus diễn ra với tỷ lệ thấp nhất, khiến các cụm tế bào khó phát triển thành Microcallus Thời gian ủ để hình thành Microcallus ở các môi trường này kéo dài hơn nhiều so với OX5, với thời gian trung bình khoảng 6 – 7 tuần để hạt Microcallus mới xuất hiện.

OX4 có tỷ lệ Microcallus cao nhưng vẫn thấp hơn so với OX5 Sau một thời gian, các Microcallus trên môi trường OX4 sẽ chuyển sang màu vàng và có sức sống kém.

Kết luận: OX5 là mụi trường thớch hợp nhất ủể cảm ứng tạo Mirocallus

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu để xác định thời gian cấy chuyển thích hợp cho các protoplast nhằm kích thích tạo Microcallus, bên cạnh việc tìm ra môi trường thích hợp cho quá trình này.

Thí nghiệm 6: Kết quả ảnh hưởng thời gian chuyển sang môi trường

Sau một thời gian nuôi cấy, những protoplast có sức sống kém sẽ chết, trong khi các tế bào khỏe mạnh tiếp tục phân chia và hình thành các cụm tế bào Những cụm tế bào này sẽ phát triển thành microcallus khi được chuyển sang môi trường thích hợp.

Áp suất thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy protoplast đóng vai trò quan trọng, không chỉ giúp bảo vệ protoplast khỏi sự vỡ, mà còn đảm bảo quá trình phân chia tế bào diễn ra thuận lợi.

Việc chuyển protoplast quá sớm sẽ khiến các cụm tế bào chưa đạt kích thước cần thiết không thể kích thích phân chia tiếp để hình thành Microcallus.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu về thời gian chuyển sang môi trường OX5 thích hợp cho từng dòng khoai tây Sau 4 tuần, các microcallus đã được hình thành, tuy nhiên số lượng microcallus hình thành ở các thí nghiệm là khác nhau Dữ liệu thu được cho thấy kích thước của microcallus có thể được quan sát bằng mắt thường, với sự phân loại thành các kích thước to và nhỏ.

Bảng 8: Sự tạo thành Microcallus trên môi trường OX5

Hình 8: Sự tạo thành Microcallus trên môi trường OX5 (B208)

Nhận xột: Khi thay ủổi thời gian chuyển ta thấy cú sự khỏc biệt rừ rệt về số microcallus tạo thành

- Các protoplast sau 2 tuần nuôi cấy có khả năng hình thành microcallus Trong khi ủú cỏc cụm tế bào phõn chia 3 – 4 tuần thỡ lượng microcallus tạo ra khá cao

Các dòng dũng khác nhau có đặc điểm sinh trưởng và khả năng phân chia Protoplast khác nhau Dòng H1959/195, A56, A16, H1929/34, A41, A15 cho hiệu quả hình thành microcallus cao nhất sau 3 tuần nuôi cấy, với số lượng từ 60 đến 74 microcallus Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian nuôi cấy tới 4 tuần, số lượng callus tạo thành giảm do môi trường phân chia không đáp ứng đủ nhu cầu dinh dưỡng cho tế bào phát triển Đối với dòng B208 và B186, hai dòng này hình thành nhiều microcallus nhất và có số lượng callus cao nhất sau 4 tuần nuôi cấy (B208: 93 microcallus, B186: 91 microcallus) Lượng callus tạo ra sau 3 tuần nuôi cấy lại nhiều hơn so với sau 2 tuần Do đó, đối với dòng B208 và B186, sau 4 tuần nuôi cấy phân chia, nên chuyển sang môi trường tạo microcallus để đạt hiệu quả cao nhất.

Để hình thành microcallus, tế bào phải phân chia đến một kích thước nhất định và phát triển trong môi trường có đủ điều kiện dinh dưỡng cùng các yếu tố kích thích sinh trưởng Nếu chuyển giao quá sớm, protoplast sẽ chưa đạt kích thước cần thiết, dẫn đến lượng microcallus hình thành ít và kém phát triển Ngược lại, nếu để quá lâu, tế bào sẽ chết do thiếu dinh dưỡng và các chất kích thích sinh trưởng, làm cho microcallus không hình thành hoặc nếu có thì cũng yếu ớt và có màu vàng.

Kết luận về thời gian chuyển thớch hợp ủối với từng dũng

- ðối với dòng H1959/195, A56, H1929/34, A16, A41 và A15: Sau 3 tuần nuôi cấy protoplast thì cấy chuyển sang môi trường OX5

- ðối với các dòng B208, B186: Sau 4 tuần nuôi cấy cấy chuyển

Sau khi thực hiện các thí nghiệm, chúng tôi đã rút ra phương thức cấy chuyển protoplast như sau: Protoplast sau khi tách sẽ được nuôi cấy trong môi trường lỏng 24a hoặc 24b Mỗi tuần, cần bổ sung 1-2 giọt môi trường nuôi Quá trình này nên diễn ra trong bóng tối ở nhiệt độ 24-25 độ C Sau 3-4 tuần, protoplast sẽ được chuyển sang môi trường cứng OX5 để phát triển microcallus.

Nghiên cứu xây dựng quy trình dung hợp protoplast bằng hoá chất PEG

4.7.1 Nghiên c ứ u quy trình dung h ợ p protoplast b ằ ng PEG

Kao và Mychayluk (1974) là những người đầu tiên công bố việc sử dụng PEG để dung hợp protoplast Từ đó đến nay, phương pháp dung hợp bằng PEG đã trở nên phổ biến và đạt hiệu quả cao, với khả năng kích thích dung hợp lên tới 70 – 100%.

Cơ chế tỏc ủộng của PEG vẫn chưa ủược biết ủến một cỏch rừ ràng

Cú nhiều ý kiến cho rằng hoạt động của phân tử PEG giống như một cầu nối phân tử, giúp phân rã các sợi liên bào và kích thích sự kết tụ các tế bào lại với nhau Với trọng lượng phân tử cao, PEG kích thích sự kết tụ của các phân tử protein và lipid, thành phần chính cấu trúc nên màng sinh chất Ngược lại, nếu PEG có trọng lượng phân tử thấp, sẽ không tạo ra sự kết dính.

Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm xác định các thông số tối ưu cho quy trình dung hợp bằng PEG và môi trường nuôi sau dung hợp.

Xung ủiện ỏp cao gây ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất tại vị trí tiếp xúc giữa các tế bào, dẫn đến quá trình dung hợp và tái tổ chức màng một cách hợp lý.

4.7.1.1 Thớ nghi ệ m1: K ế t qu ả thớ nghi ệ m v ề ả nh h ưở ng n ồ ng ủộ PEG khỏc nhau t ớ i ch ấ t l ượ ng protoplast sau quá trình dung h ợ p Ở thớ nghiệm này nồng ủộ của PEG quyết ủịnh sự thành cụng của thớ nghiệm dung hợp Nếu nồng ủộ PEG quỏ cao thỡ sẽ dẫn ủến kết quả là cỏc protoplast kết dớnh thành cụm dày ủặc, bị vỡ và rất khú rửa sạch Ngược lại nếu nồng ủộ quỏ thấp thỡ khụng ủủ kớch thớch sự kết dớnh của 2 protoplast Trong thí nghiệm này chúng tôi xử lý hỗn hợp protoplast của 2 dòng nhị bội (B186 và B208) trong cựng 1 thời gian 3 phỳt ở cỏc nồng ủộ PEG từ cao xuống thấp, kết quả thu ủược như sau:

Hình 9: K ế t qu ả dung h ợ p protoplast c ủ a hai dòng B208 và B186 b ằ ng hoá ch ấ t PEG ở cỏc n ồ ng ủộ khỏc nhau trong cựng th ờ i gian ủ PEG 3 phỳt

Hình ảnh cho thấy sự ảnh hưởng rõ rệt của các nồng độ PEG khác nhau đến chất lượng của Protoplast sau quá trình dung hợp.

Ở nồng độ PEG 40%, việc rửa sạch PEG trở nên khó khăn, dẫn đến các protoplast sau dung hợp kết dính chặt chẽ với nhau và hình thành các mảnh lớn Sự kết tụ này không chỉ làm giảm hiệu suất dung hợp mà còn có thể gây ra sự phá vỡ tế bào trong môi trường nuôi cấy.

Với PEG 30%, các protoplast vẫn kết dính thành những mảnh lớn, tuy nhiên, lượng tế bào kết dính và số lượng protoplast bị vỡ trong quá trình dung hợp ít hơn so với PEG 40%.

- Ở nồng ủộ PEG 25% hầu như PEG ủược rửa sạch nhưng số tế bào chập 3 nhiều, cỏc protoplast vẫn kết dớnh thành những ủỏm nhỏ

So với các nồng độ PEG khác, PEG 22,5% cho tỷ lệ tế bào dính thành từng cụm cao hơn, trong khi các tế bào dính thành cụm nhỏ hơn hoặc ba Sau khi dung hợp, protoplast bị vỡ nhiều hơn và PEG cần được rửa sạch.

Vì vậy PEG 22,5% thích hợp nhất cho dung hợp protoplast khoai tây và dùng nó cho các thí nghiệm dung hợp tiếp theo

4.7.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ PEG khác nhau ủến khả năng kết dớnh của protoplast

Sau khi xác định nồng độ PEG thích hợp cho dung hợp, việc xác định thời gian ủ hỗn hợp protoplast là rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng lớn đến hiệu quả dung hợp Thời gian ủ quá ngắn sẽ không đủ để các protoplast kết dính, trong khi ủ quá lâu sẽ dẫn đến việc các protoplast kết dính thành cụm dày đặc, khó rửa sạch PEG sau xử lý Do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định thời gian ủ PEG thích hợp nhất cho sự kết dính của hai protoplast từ hai dòng nhị bội Kết quả thí nghiệm trước với nồng độ PEG 22,5% cho hỗn hợp hai dòng B208 và B186 ở các thời gian ủ khác nhau cho thấy

Hỡnh 10: K ế t qu ả dung h ợ p b ằ ng hoỏ ch ấ t PEG ở n ồ ng ủộ 22,5% khi thay ủổ i th ờ i gian ủ

Thời gian ủ PEG có ảnh hưởng đáng kể đến độ kết dính của tế bào, ngay cả khi lượng PEG sử dụng là như nhau Càng kéo dài thời gian ủ, tế bào sẽ kết gắn chặt chẽ hơn, dẫn đến sự hình thành nhiều cụm tế bào.

Khi sử dụng 25àl PEG ủể dung hợp thỡ:

Thời gian ủ 3 phút là thời gian lý tưởng để tạo ra sự gắn kết hiệu quả giữa các tế bào, giúp PEG dễ dàng rửa sạch hơn và ngăn chặn hiện tượng tế bào co cụm thành từng cụm.

Thời gian ủ 5 phút và 10 phút tạo ra nhiều cụm tế bào, nhưng việc ủ lâu có thể khiến các tế bào dính chặt với nhau Việc rửa sạch bằng PEG có thể làm tế bào bị vỡ, đặc biệt là sau 10 phút ủ, khi tế bào dễ bị vỡ nát và tạo thành từng cụm không tách rời.

Do vậy bổ sung 25àl PEG 22,5% thời gian ủ 3 phỳt là thớch hợp nhất

4.7.1.3 Thớ nghiệm 3: Nghiờn cứu ảnh hưởng của mật ủộ protoplast tới hiệu suất của quá trình dung hợp ðối với phương phỏp dung hợp bằng hoỏ chất PEG, ủể xỏc suất tạo ra sự kết dớnh ủụi giữa 2 protoplast của 2 dũng nhị bội khỏc nhau (yếu tố mong muốn cú ủược tạo ủiều kiện cho dung hợp xảy ra trong quỏ trỡnh nuụi cấy tỏi sinh) thỡ việc xỏc ủịnh mật ủộ tế bào thớch hợp của cỏc dũng trước khi dung hợp là rất quan trọng Nếu mặt ủộ tế bào quỏ thưa thỡ sự kết lắng của protoplast ít và sẽ bị mất trong qúa trình dung hợp (khi hút bỏ PEG và dung dịch rửa dung hợp), nếu mặt ủộ tế bào quỏ dầy thỡ số tế bào kết dớnh 2 ớt và số tế bào kết dớnh 3,4,…nhiều Hơn nữa nếu mật ủộ protoplast của 2 dũng dung hợp không tương thích thì khả năng tạo tế bào lai giữa 2 dòng là rất ít Chính vỡ vậy chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm sử dụng cỏc mật ủộ protoplast khỏc nhau ủể dung hợp thu ủược hiệu quả cao (xỏc nhận mật ủộ thụng qua việc ủếm tế bào bằng buồng ủếm hồng cầu)

Tiến hành thớ nghiệm và thu ủược kết quả sau:

Hình 11 minh họa ảnh hưởng của mật độ protoplast đến hiệu suất của quá trình dung hợp Số lượng protoplast chập ủi và chập ba sau khi dung hợp được ghi nhận ở các mật độ khác nhau, dựa trên thị trường của vật kính 20 Bảng số liệu dưới đây cung cấp thông tin chi tiết về kết quả này.

Bảng 9: Sự kết tập của protoplast sau khi dung hợp

2.10 6 tế bào/1ml 2,5.10 6 tế bào/1ml

2,75.10 6 tế bào/1ml 3.10 6 tế bào/1ml

Định dạng
Số trang	84
Dung lượng	8,27 MB