MỞ ðẦU
Tớnh cấp thiết của ủề tài
Ninh Bình là một tỉnh có tiềm năng du lịch lớn với vị trí địa lý thuận lợi và cảnh quan thiên nhiên kỳ vĩ Sự phát triển du lịch của Ninh Bình đang thu hút du khách trong và ngoài nước Tuy nhiên, sự phát triển này cũng đi kèm với tác động của con người lên môi trường Khi xã hội phát triển, nhu cầu tiêu thụ động vật quý hiếm trong các nhà hàng sang trọng ngày càng gia tăng, dẫn đến nguy cơ mất cân bằng sinh thái Để bảo tồn quỹ gen và phát triển kinh tế, Nhà nước đã cho phép người dân chăn nuôi một số loài động vật quý hiếm, nhằm tạo ra hình thức kinh tế mới cho ngành chăn nuôi và hỗ trợ các hộ chăn nuôi ở vùng cao.
Vườn quốc gia Cúc Phương, được thành lập vào ngày 8/1/1966, là đơn vị bảo tồn đầu tiên của Việt Nam, với diện tích 22.200 ha trải dài trên ba tỉnh: Hòa Bình, Ninh Bình và Thanh Hóa Nằm ở phía đông nam dãy núi Tam Điệp, phần lớn diện tích của vườn thuộc tỉnh Ninh Bình Đây là khu rừng nguyên sinh với sự đa dạng sinh học cao, nơi sinh sống của nhiều loài động thực vật quý hiếm như Voọc mông trắng, tê tê và rùa Vào tháng 1/2007, vườn quốc gia Cúc Phương đã bắt đầu nghiên cứu nhân nuôi và phát triển đàn gà rừng tai đỏ (Gallus).
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã thành công trong việc lai tạo gà rừng tai ủỏ với gà mỏi Ri vàng rơm vào năm 2009, nhằm phát triển nghề nuôi gà rừng phục vụ nhu cầu du lịch và giảm việc săn bắt gà rừng Các cán bộ khoa học đã tiếp tục lai tạo để tạo ra con lai F2 có 75% gen gà rừng Năm 2010, những con gà lai F2 đầu tiên đã được ấp nở, tuy nhiên, việc này vẫn gặp nhiều thách thức do thiếu tài liệu và chương trình nghiên cứu chuyên sâu về đối tượng này.
Bên cạnh việc chăn nuôi gà rừng thuần và thế hệ con lai F1, F2, việc quản lý bệnh tật gặp nhiều khó khăn do tình hình diễn biến phức tạp Hiện tại, chưa có nghiên cứu chuyên sâu về bệnh của gà rừng, dẫn đến việc phòng chống dịch bệnh chưa được thực hiện theo quy trình cụ thể Mặc dù gà rừng có khả năng thích nghi và kháng bệnh cao, nhưng dịch bệnh, đặc biệt là các bệnh truyền nhiễm như bệnh Newcastle, vẫn xảy ra và có xu hướng gia tăng Điều này cho thấy công tác tiêm phòng bằng vaccine cho đàn gà chưa thực sự hiệu quả Vì vậy, nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch của gà rừng thuần và gà rừng lai F2 sau khi sử dụng vaccine Lasota và vaccine Newcastle Hệ 1 là rất cần thiết Dự án này được thực hiện với sự hỗ trợ của Viện đào tạo sau đại học, khoa Thú y – Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội và sự đồng ý của Vườn quốc gia Cúc Phương – Nho Quan – Ninh Bình.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3
Nghiên cứu về dịch bệnh trên đàn gà rừng và phản ứng miễn dịch đối với bệnh Newcastle sau khi tiêm vaccine phòng bệnh cho gà rừng nuôi tại Vườn quốc gia Cúc Phương rất quan trọng Việc này giúp hiểu rõ hơn về hiệu quả của vaccine và khả năng miễn dịch của gà rừng, từ đó có biện pháp phòng ngừa dịch bệnh hiệu quả hơn trong tương lai.
Dưới sự hướng dẫn của TS Trịnh Đình Thâu tại Bộ môn Giải phẫu Tổ chức – Khoa Thú y – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, cùng với sự hỗ trợ của BSTY Hoàng Xuân Thủy từ Trung tâm cứu hộ và bảo tồn thực vật hoang dã quý hiếm tại Vườn quốc gia Cúc Phương, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm.
Mục ủớch của ủề tài
- Hiểu ủược tỡnh hỡnh bệnh tật của ủàn gà rừng ủang nuụi tại Vườn quốc gia Cúc Phương
Nghiên cứu về ứng dụng miễn dịch bệnh Newcastle sau khi tiêm vaccine Lasota và vaccine Hệ 1 cho đàn gà rừng Tai đỏ thuần chủng và gà rừng lai F2 nuôi tại Vườn quốc gia Cúc Phương nhằm đưa ra phương pháp phòng bệnh hiệu quả cho đàn gà rừng tại đây.
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4
ðỐI TƯỢNG - ðỊA ðIỂM - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ðối tượng, vật liệu
Đàn gà rừng Tai ựỏ thuần và gà lai F2 đang được nuôi dưỡng tại Trung tâm cứu hộ và bảo tồn thực vật hoang dã quý hiếm thuộc Vườn quốc gia Cúc Phương.
- Vacxin Lasota của Xí nghiệp thuốc thú y trung ương – Hoài ðức – Hà Nội, là vacxin nhược ủộc ủụng khụ Mỗi liều vacxin chứa tối thiểu 10 6 EID50 virus
- Vacxin Hệ 1 của Xí nghiệp thuốc thú y trung ương – Hoài ðức – Hà Nội, là vacxin nhược ủộc ủụng khụ Mỗi liều vacxin chứa tối thiểu 10 6 EID50 virus
- Hồng cầu gà 1%: lấy máu gà khỏe mạnh, có phản ứng HI âm tính, hồng cầu ủược pha theo tỷ lệ 1%
- Dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm cần thiết khác (Tại phân xưởng vacxin virus – Xí nghiệp thuốc thú y trung ương – Hoài ðức – Hà Nội.)
ðịa ủiểm nghiờn cứu
- ðịa ủiểm: Trung tõm cứu hộ và bảo tồn ủộng thực vật hoang dó quý hiếm – vườn quốc gia Cúc Phương – Nho Quan – Ninh Bình
Trong ủề tài này chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu cỏc nội dung chớnh sau:
- Tỡm hiểu tỡnh hỡnh chăn nuụi ủàn gà rừng tại vườn quốc gia Cỳc Phương
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 36
Tìm hiểu tình hình bệnh tật trên đàn gà rừng Tai đỏ thuần và gà rừng lai F2 nuôi tại vườn quốc gia Cúc Phương cùng các nông hộ thuộc các xã vùng đệm.
Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu phản ứng miễn dịch đối với bệnh Newcastle sau khi sử dụng vaccine Lasota và vaccine Hệ 1 trên gà rừng Tai đỏ thuần chủng và gà rừng lai F2 được nuôi tại vườn quốc gia Cúc Phương Việc đánh giá hiệu quả của các loại vaccine này sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho công tác phòng chống bệnh Newcastle trong chăn nuôi gia cầm.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp sử dụng vacxin
* Vacxin Lasota: Mỗi lọ vacxin liều 50 ủược pha với nước cất vụ trựng Cho uống hoặc nhỏ mỗi con 4 giọt vào mắt, mũi
* Vacxin Hệ 1: Mỗi lọ vacxin liều 20 ủược pha với nước cất vụ trựng Liều sử dụng 0,2ml/con Vị trí tiêm: tiêm vacxin dưới da
3.4.2 Phương phỏp xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể
- Với gà dưới 2 tuần tuổi, lấy máu tim với lượng 0,5ml/con
- Với gà trên 2 tuần tuổi, lấy máu tĩnh mạch gốc cánh với lượng 1ml/con
Sau khi lấy mẫu vào bơm tiêm nhựa, cần bẻ gập kim và đậy nắp lại Để mẫu nghiêng 30 độ trong môi trường khoảng 30 phút cho mẫu tự ủ, sau đó cho vào phích ủ lạnh và gửi đến phân xưởng vaccine virus thuộc Xí nghiệp thuốc thú y trung ương tại Hoài Đức, Hà Nội.
* Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà HA:
Virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu ở gà, bò và người nhờ vào các kháng nguyên trên bề mặt capsid của nó.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội nghiên cứu virus có khả năng bám vào thụ thể của hồng cầu, dẫn đến hiện tượng ngưng kết hồng cầu thành mạng nhện trong ống nghiệm Sau khi sử dụng enzyme Neuraminidaza, thụ thể hồng cầu bị cắt đứt, khiến hồng cầu lắng xuống và tạo thành cục trụ Do đó, giai đoạn đầu của phản ứng mang lại kết quả chính xác.
Để tạo ra hồng cầu gà 1%, lấy máu từ tim gà khỏe mạnh (phản ứng HI âm tính) và cho vào xi lanh chứa citrat natri 5% Tiến hành ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó hút bỏ phần bạch cầu và huyết tương Tiếp theo, thêm nước sinh lý vào, trộn đều và ly tâm để loại bỏ phần nước phía trên, lặp lại quy trình này ba lần để thu được hồng cầu Cuối cùng, pha 1ml hồng cầu với 99ml nước sinh lý để đạt được hồng cầu 1%.
+ Kháng nguyên là virus Newcasle; nước sinh lý…
+ Phản ứng ủược tiến hành theo sơ ủồ sau:
Hiệu giá virus 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/216 1/512 1/1024 Hồng cầu gà 1% (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 38
Dựng micropipettes vào tất cả các giếng, mỗi giếng chứa 25 µl nước sinh lý Sau đó, cho vào giếng thứ nhất 25 µl kháng nguyên Newcastle, trộn đều rồi hút sang giếng thứ hai 25 µl Tiếp tục thực hiện tương tự cho đến giếng thứ 10 và hút bỏ 25 µl Lúc này, hiệu giá kháng nguyên được pha loãng từ giếng 1 đến giếng 10.
10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; …ủến 1/512; 1/1024 Tiếp ủú cho vào tất cả cỏc giếng 25àl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ, ủể yờn trong 20 phỳt rồi ủọc kết quả ðọc kết quả
Phản ứng dương tớnh: Hồng cầu bị ngưng kết rải ủều thành mảng ở ủỏy giếng
Phản ứng õm tớnh: Hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn ủỏ, nước ở bên trong
Hiệu giá ngưng kết: ðọc ở giếng ngưng kết cuối cùng trước giếng không ngưng kết
Hiệu giỏ phản ứng HA: là ủộ pha loóng virus cao nhất mà ở ủú vẫn cũn ngưng kết hồng cầu, người ta gọi ủú là 1 ủơn vị HA
Trong phản ứng HI, cần sử dụng kháng nguyên virus Newcastle với nồng độ 4 đơn vị HA để đảm bảo độ chính xác Qua thực hiện phản ứng HA, chúng tôi xác định rằng 1 HA tương đương với 1/1024, do đó 4 HA sẽ là 1/216.
Xỏc ủịnh 4 ủơn vị HA
Trên tấm nhựa microtest plate có 4 dãy và 4 giếng, mỗi giếng được nhỏ 25 µl nước sinh lý Đối với giếng 1 của 4 dãy, nhỏ 25 µl khoảng dung dịch nguyên liệu pha ở 4 nồng độ HA, sau đó trộn đều Tiếp theo, hút 25 µl từ giếng 1 sang giếng 2 và thực hiện tương tự cho đến giếng cuối cùng.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội tiến hành nghiên cứu về luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, trong đó khảo sát hiệu quả của các giếng Kết quả cho thấy giếng thứ nhất có 2 đơn vị HA, giếng thứ hai có 1 đơn vị HA, và giếng thứ ba có 0,5 đơn vị HA Sau khi thêm 1% hồng cầu vào tất cả các giếng, giếng thứ tư được sử dụng làm đối chứng chỉ có nước sinh lý và hồng cầu.
Lắc nhẹ tấm nhựa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút trước khi kiểm tra kết quả Nếu hiện tượng ngưng kết hồng cầu chỉ xuất hiện ở ống nghiệm thứ hai, thì không cần pha loãng mẫu ở 4 đơn vị.
* Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà HI:
Dựa trờn nguyờn lý gà mắc bệnh Newcastle hoặc ủó ủược tiờm phũng vacxin
Kháng thể trong huyết thanh Newcastle có khả năng chống lại virus Newcastle, giúp trung hòa virus và ngăn chặn khả năng gây ngưng kết hồng cầu ở gà.
+ Hồng cầu gà 1%; khỏng nguyờn là virus Newcastle pha ở 4 ủơn vị HA; huyết thanh gà cần chẩn đốn; nước sinh lý…
+ Phản ứng ủược tiến hành theo sơ ủồ sau:
Nước sinh lý (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Huyết thanh gà (àl) 25 ðộ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/216 1/512 1/1024
Newcastle (4 HA) (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Hồng cầu gà 1% (àl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 40
Dựng khay nhựa cú 96 giếng ủỏy chữ U (cú 8 dóy giếng, mỗi dóy giếng dùng cho một mẫu huyết thanh)
Dựng micropipettes nhỏ vào tất cả cỏc giếng, mỗi giếng 25àl nước sinh lý, riờng ụ ủối chứng (+) cho 50àl nước sinh lý
Sau khi ủ, cho vào ống thứ nhất 25µl huyết thanh cần kiểm tra, trộn đều và hút sang ống thứ hai 25µl Tiếp tục quy trình này cho đến ống thứ 10, sau đó hút bỏ 25µl mẫu Lúc này, hiệu giá huyết thanh pha loãng từ ống 1 đến ống 10 lần lượt là 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, … cho đến 1/512 và 1/1024.
Tiếp ủ 25ml hỗn hợp kháng nguyên pha ở 4 đơn vị HA vào tất cả các giếng trừ giếng chứng (+) Lắc nhẹ và ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút để kháng nguyên kết hợp với kháng thể nếu có.
Tiếp tục cho hồng cầu gà 1% vào tất cả cỏc giếng, lắc nhẹ, ủể ở nhiệt ủộ phũng trong vũng 20 phỳt rồi ủọc kết quả ðọc kết quả
Phản ứng ôm tớnh là hiện tượng hồng cầu bị ngưng kết rải rác dưới đáy ống nghiệm Trong khi đó, phản ứng dương tớnh xảy ra khi hồng cầu lắng xuống và tạo thành cục trũn ở đáy ống, do virus Newcastle bị kháng thể Newcastle trong huyết thanh trung hòa, làm mất khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
Hiệu giỏ HI là ủộ pha loóng huyết thanh cao nhất tại ủú khỏng thể vẫn cũn khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 41
Thông qua hiệu giá HI, người ta đánh giá mức độ miễn dịch của đàn gà Hiệu giá HI (log2) từ 1/8 trở lên được coi là có khả năng bảo hộ với bệnh Newcastle Hiệu giá HI càng cao thì khả năng bảo hộ càng lớn.
Thớ nghiệm ủược tiến hành trờn 60 gà (30 gà rừng Tai ủỏ thuần và 30 gà lai F2)
3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được từ kết quả nghiên cứu và điều tra đã được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học thông qua chương trình Excel, sử dụng các tham số phù hợp để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong phân tích dữ liệu.
Sai số của số trung bình mx
Sử dụng chương trình Microsoft Ofice Excel
Số mẫu ủạt HLKT bảo hộ
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 42