Đồ án tốt nghiệp: Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel được thực hiện với mục tiêu nhằm làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichoderma koningii một cách tối ưu nhất. Mời các bạn cùng tham khảo.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 16 tháng 5 năm 2015 đến ngày 16 tháng 8 năm 2015, tại phòng các hoạt chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học của trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh.
Vật liệu
Giống nấm mốc Trichoderma koningii được cung cấp bởi phòng vi sinh ứng dụng – Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp Hồ Chí Minh
Bã mía được phơi khô, cắt nhỏ và cám gạo do Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp
Hồ Chí Minh cung cấp
Các hóa chất cần thiết để chuẩn bị môi trường giữ giống và bổ sung vào môi trường lên men bán rắn bao gồm: (NH4)2SO4, K2HPO4, urea, glucose, peptone, CaCl2, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, MnSO4, ZnSO4 và CoCl2, tất cả đều được sản xuất tại Trung Quốc.
Các hóa chất cần thiết để pha dung dịch đệm bao gồm CH3COONa.3H2O và CH3COOH Để xác định hoạt tính enzyme, các hóa chất sử dụng là glucose (xuất xứ từ Trung Quốc), CMC, giấy lọc và thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid).
Các hóa chất dùng để xác định hàm lượng protein: albumine, thuốc thử Bradford (Coomassie Brilliant Blue, Ethanol 96 0 , Acid phosphoric 85%)
The key chemicals used in the electrophoresis method include Sodium dodecyl sulfate, ammonium persulfate, bromophenol blue, N,N,N’,N’-Tetramethyl ethylenediamine (TEMED), acrylamide/bisacrylamide, β-mercaptoethanol, small molecular weight markers (Sigma), glycerol, and glycine.
Cách pha một số thuốc thử:
Dung dịch đệm acetate 0,05 M pH 5 được chuẩn bị bằng cách pha 2,91 ml acid acetic 0,05 M vào 1000 ml nước Sau đó, cân 4,1 g natri acetate và hòa tan trong 1000 ml nước, cuối cùng điều chỉnh pH bằng máy đo pH để đạt giá trị mong muốn.
Dung dịch thuốc thử Lugol được chuẩn bị bằng cách hòa tan 2 g KI trong khoảng 100 ml nước cất Sau đó, nghiền 1 g tinh thể iode trong cối và hòa tan trong 50 – 100 ml nước cất Cuối cùng, cho dung dịch iode vào dung dịch KI, khuấy đều cho tan hoàn toàn, rồi bổ sung nước cất đến tổng thể tích 300 ml.
- Dung dịch thuốc thử DNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic):
+ Cân 10 g DNS cho vào beaker 1000 ml, thêm khoảng 400 ml nước cất, đặt cốc vào chậu nước 80 0 C và khuấy đều
+ Hòa tan 16 g NaOH trong 150 ml nước cất Thêm dung dịch NaOH từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 80 0 C
+ Tiếp tục thêm 300 g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 80 0 C
Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng, sau đó chuyển vào bình định mức 1000 ml và thêm nước cất đến vạch Lắc đều và bảo quản dung dịch trong chai màu nâu có nắp.
- Dung dịch CMC (1%): cân 10 g CMC hòa tan với 800 ml nước cất, tiếp tục cho vào 100 ml acid acetic 1 M Điều chỉnh pH 5 với NaOH 1N Định mức với nước cất 1000 ml.
Thiết bị và dụng cụ
- Máy đo quang phổ kế UV – Vis 2500
- Kính hiển vi quang học Nikon
- Cân phân tích, cân kỹ thuật
- Hệ thống máy sắc ký cột áp suất thấp BIO-RAD BioLogic
- Cốc thủy tinh 100 ml, 200 ml, 1000 ml
- Ống đong 50 ml, 100 ml, 500 ml
- Pipet thủy tinh 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml
- Bao nilon hấp, dây thun
Môi trường
Môi trường Czapek (môi trường bổ sung khoáng cho môi trường lên men bán rắn)
Bảng 3.1 Thành phần các chất trong môi trường Czapek
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp phân tích độ ẩm cơ chất
Tiến hành theo nguyên tắc: áp dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng sản phẩm không đổi
Để tiến hành thí nghiệm, trước tiên, sấy 3 cốc sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105°C cho đến khi đạt trọng lượng không đổi Sau đó, sử dụng cân phân tích để xác định trọng lượng cốc, ký hiệu là 𝑚₀ (g) Tiếp theo, cho vào mỗi cốc 2g cơ chất, cân phân tích và ghi nhận tổng khối lượng cốc và mẫu, ký hiệu là 𝑚₁ (g).
Đặt cốc vào tủ sấy ở nhiệt độ 105°C và sấy trong khoảng 4 giờ Sau đó, lấy cốc mẫu ra để nguội trong 30 phút trong bình hút ẩm Tiến hành cân cốc mẫu đã sấy và tiếp tục sấy thêm khoảng 2 giờ, sau đó cân lại cho đến khi trọng lượng cốc mẫu không thay đổi Ghi nhận khối lượng 𝑚2 (g) và tính toán độ ẩm từ kết quả này.
𝑚 0 : khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi
𝑚 1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy
𝑚 2 : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi
3.5.2 Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy (Karimi, 2009)
Công thức tính lượng khoáng cần bổ sung vào môi trường:
A: khối lượng cơ chất nuôi cấy (g)
B: độ ẩm môi trường mình cần (%)
C: độ ẩm trong cơ chất A (%)
F: lượng nước cần bổ sung vào môi trường để đạt độ ẩm thích hợp (ml) 100: độ ẩm 100%
Ví dụ : 20 g cơ chất có độ ẩm khoảng 10% nhưng cần đạt độ ẩm 50%
Từ công thức trên suy ra: F = 20 × (50 − 10)
100 − 50 = 16 ml Như vậy cần bổ sung thêm 16 ml nước cất sẽ được độ ẩm là 50%
3.5.3 Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii
Cấy chuyển giữ giống và nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii trên môi trường bán rắn nhằm thu nhận enzyme cellulase phục vụ cho quá trình nghiên cứu
3.5.3.1 Cấy giống trên môi trường thạch nghiêng PGA
Mục đích : ổn định giống
Môi trường giữ giống PGA gồm có: khoai tây 200 g, glucose 20 g, agar 20 g, nước cất 1000 ml, pH môi trường là 6,5
Gọt vỏ và rửa sạch khoai tây, sau đó cắt thành miếng nhỏ và cho vào cốc với nước cất Nấu khoai tây cho đến khi chín mềm trong khoảng 30 phút, sau đó để nguội và lọc lấy nước Tiếp theo, cho agar vào nước khoai tây và nấu với việc khuấy đều Cuối cùng, thêm glucose vào và khuấy cho đến khi tan hoàn toàn.
Cho môi trường vào 1/4 các ống nghiệm, hấp khử trùng ở 121 0 C, 1 atm trong
15 phút, sau đó xếp nghiêng các ống nghiệm, để nguội tạo môi trường thạch nghiêng Mặt thạch không vượt quá 2/3 chiều dài ống nghiệm
Sử dụng que cấy đã được khử trùng, lấy một ít bào tử từ ống giống và cấy nhẹ nhàng lên bề mặt thạch nghiêng theo hình ziczăc Sau 2 ngày ở nhiệt độ phòng, bào tử nấm sẽ phát triển đều Các ống nghiệm giữ giống sẽ được chuyển sang môi trường giữ giống cấp 2 (môi trường lúa) hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 9 độ C cho các thí nghiệm sau Tất cả thao tác đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng.
3.5.3.2 Nhân giống trên môi trường lúa
Mục đích : nhằm tạo giống tốt hơn, bảo quản được lâu hơn và chuẩn bị giống, đảm bảo lượng giống cho việc nuôi cấy trên môi trường bán rắn
Lấy 40 g lúa cho đều vào 2 bình tam giác 500 ml, bổ sung môi trường khoáng tối ưu và nước sao cho độ ẩm môi trường đạt 50%, hấp thanh trùng môi trường ở
121 0 C trong 15 phút Môi trường lúa sau khi nguội sẽ được cấy mốc giống từ môi trường thạch nghiêng vào
Lượng khoáng bổ sung vào môi trường được tính theo công thức đã được trình bày ở phần 3.5.2
Sử dụng pipet, hút 2 ml nước cất vô trùng và cho vào ống thạch nghiêng chứa giống Dùng que cấy để cạo lớp sinh khối và chuyển dịch này sang bình môi trường lúa, trộn đều và đậy nắp bằng bông Bao gói và ủ ở nhiệt độ 30°C, thực hiện các thao tác cấy gần ngọn đèn cồn với dụng cụ đã được vô trùng bằng cồn 70° Sau 2-3 ngày, khi quan sát thấy nấm mốc mọc đều và bao phủ kín bề mặt các hạt lúa, tiến hành bảo quản ở 4°C trong tủ lạnh.
3.5.3.3 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase (Raimbault, 1998), (Tolan, 1999)
Mục đích : tạo môi trường dinh dưỡng tối ưu nhất cho nấm mốc phát triển để thu nhận enzyme hiệu quả nhất
Phối trộn bã mía với cám gạo (BM:CG) theo các tỷ lệ khối lượng cần khảo sát
Cơ chất được chuẩn bị trong các erlen 250 ml, được làm ẩm bằng nước có bổ sung môi trường dinh dưỡng Czapek, với lượng nước và khoáng tính theo công thức ở phần 3.5.2 Cần điều chỉnh độ ẩm ban đầu, pH ban đầu, thời gian nuôi cấy và tỷ lệ giống Môi trường được hấp khử trùng ở 121°C, 1 atm.
Cho nước cất vô trùng từ bình erlen vào bình môi trường lúa, đảm bảo ngập hết cơ chất Lắc đều và dùng đũa thủy tinh vô trùng khuấy để bào tử nấm mốc tách khỏi môi trường, tạo thành huyền phù.
Sử dụng pipet để hút dung dịch chứa nấm mốc từ bình môi trường lúa vào bình môi trường bán rắn, sau đó khuấy đều và đậy nút bông, ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp để trích ly enzyme Để xác định thành phần môi trường và điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme, nấm mốc được nuôi trên môi trường với tỷ lệ bã mía và cám gạo khác nhau (2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3), độ ẩm môi trường ban đầu từ 45 – 65%, pH từ 4 – 8, nồng độ dung dịch dinh dưỡng từ không bổ sung đến 0,5 – 3 lần nồng độ chuẩn, thời gian nuôi cấy từ 8 – 112 giờ, và tỷ lệ giống từ 0,5x10^7 – 3x10^7 bào tử/môi trường.
3.5.4 Phương pháp mô tả hình thái T koningii (Trần Linh Thước, 2003)
Thí nghiệm quan sát hình thái được thực hiện để xác định lại các đặc điểm khuẩn lạc của vi nấm trên môi trường PGA, bao gồm hình thái vi thể và các đặc tính của các chủng vi nấm.
Sử dụng que cấy vô trùng, nhẹ nhàng gạt bào tử nấm mốc và chuyển sang đĩa petri chứa môi trường PGA đã được hấp vô trùng Cắm đầu que cấy xuống mặt thạch tại 3 điểm khác nhau và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 – 7 ngày Sau đó, quan sát hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc nấm mốc.
Để quan sát hình dạng của vi nấm, bước đầu tiên là nuôi cấy trong buồng ẩm Cần chuẩn bị 5 đĩa petri, trong đó có giấy thấm nước đặt ở đáy mỗi đĩa Trên giấy, đặt một miếng lamelle và một miếng lamelle khác Sau đó, tiến hành hấp khử trùng cùng với nước cất, 50 ml môi trường PGA và 1 đĩa petri sạch.
Sau khi hấp khử trùng, trong tủ cấy vô trùng, đổ môi trường PGA vào đĩa petri và chờ nguội, đặc lại Sử dụng dao khử trùng, cắt thạch PGA thành miếng vuông 1,5 x 1,5 cm Đặt miếng thạch lên lamelle trong đĩa petri, dùng que cấy để cấy giống vào 4 góc của miếng thạch Cuối cùng, đặt lamelle lên thạch đã cấy mẫu, nhỏ vài giọt nước cất vô trùng lên giấy thấm ở đáy đĩa và đậy nắp lại, để ở nhiệt độ phòng.
Sau 24 – 48 giờ, lấy miếng lamelle ra khỏi đĩa petri và nhỏ vài giọt cồn 96 độ lên lamelle Lau khô bằng giấy thấm, sau đó nhỏ vài giọt NaOH 10% và đậy lá kính lên Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40X để thấy cuống sinh bào tử và ti thể Mục đích của quy trình này là tăng khả năng thấm nước của sợi nấm, loại bỏ bọt khí và làm cho sợi nấm nở to hơn, giúp dễ quan sát hơn.
3.5.5 Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu (Lê Duy Linh và cộng sự, 1997)
Buồng đếm hồng cầu là thiết bị chuyên dụng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men và bào tử nấm mốc Hai loại buồng đếm hồng cầu phổ biến là buồng đếm Thomas và buồng đếm Goriep.