Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm thu nhận và tối ưu hoa điều kiện phát triển của cộng đồng vi khuẩn từ dạ cỏ bò có khả năng sinh hệ enzyme cellulase phân giải cellulose. Thu nhận và tối ưu hoa điều kiện môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme cellulase; khảo sát khả năng thủy phân cellulose từ biomass của hệ enzyme cellulase. Mời các bạn cùng tham khảo.
TỔNG QUAN
Giới thiệu về cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò
1.1.1 Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò
Hình 1.1.Hệ tiêu hóa của trâu bò [2]
Dạ cỏ, chiếm 2/3 dung tích dạ dày, là túi đặc biệt nhất, nơi diễn ra hàng loạt phản ứng sinh hóa liên tục để phân giải, tiêu hóa và hấp thu thức ăn.
Dạ cỏ của bò chứa hàng tỷ vi sinh vật sống cộng sinh, giúp quá trình tiêu hóa thức ăn hiệu quả Những vi sinh vật này không chỉ hỗ trợ bò trong việc tiêu hóa chất xơ và tinh bột mà còn sản xuất axit béo, cung cấp từ 60 đến 80% năng lượng cần thiết Nhờ vào sự đa dạng của hệ vi sinh vật, dạ bò có khả năng tiêu hóa nhiều loại thức ăn khác nhau.
Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò bao gồm vi khuẩn, protozoa và nấm, với số lượng vi khuẩn dao động từ 10^9 đến 10^10 cfu trong mỗi ml chất chứa Đã có hơn 60 loài vi khuẩn được xác định, và số lượng vi khuẩn của từng loài phụ thuộc chủ yếu vào khẩu phần ăn của bò.
Ngoài ra còn có Mycoplasma, các loại virus và các thể thực khuẩn Mycoplasma, virus và thể thực khuẩn không đóng vai trò quan trọng trong tiêu hóa
Quần thể vi sinh vật trong dạ cỏ biến đổi theo thời gian và phụ thuộc vào tính chất của khẩu phần ăn Hệ vi sinh vật này chủ yếu sống nhờ vào năng lượng được tạo ra từ quá trình lên men các chất dinh dưỡng.
Hình 1.2.Protazoa cùng với vi khuẩn và bào tử nấm.[33]
Vi khuẩn được phân chia thành nhiều nhóm có khả năng phân giải cellulose, hemicellulose, tinh bột, đường và protein Chúng xuất hiện trong dạ cỏ của loài nhai lại ở giai đoạn non, dù được nuôi cách biệt hay cùng với mẹ Vi khuẩn thường chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và đóng vai trò chính trong quá trình tiêu hóa xơ Việc phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể dựa vào cơ chất mà chúng sử dụng hoặc sản phẩm lên men cuối cùng Một số nhóm vi khuẩn dạ cỏ chính bao gồm
Vi khuẩn phân giải cellulose là nhóm vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong dạ cỏ của gia súc ăn chủ yếu cellulose Một số loài vi khuẩn quan trọng trong quá trình này bao gồm Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus và Cillobacterium cellulosolvens.
Ruminococcus flavefaciens là một loại vi khuẩn gram dương có khả năng sản sinh ra phức hệ enzyme, giúp bám vào thành tế bào thực vật và xúc tác cho nhiều hoạt động sinh học khác nhau.
Nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải hemicellulose cũng có thể phân giải cellulose, nhưng không phải tất cả các loài sử dụng hemicellulose đều có khả năng thủy phân cellulose Một số vi khuẩn tiêu biểu trong việc sử dụng hemicelluloses bao gồm Butyrivibrio fibrisolvens, Lachnospira multiparus và Bacteroides ruminicola.
Vi khuẩn phân giải tinh bột đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng carbohydrate của các loài nhai lại, đứng thứ hai sau cellulose Phần lớn tinh bột từ thức ăn được phân giải nhờ vi sinh vật trong dạ cỏ, bao gồm cả những vi khuẩn phân giải cellulose Các loại vi khuẩn này rất cần thiết cho quá trình tiêu hóa và chuyển hóa tinh bột ở bò.
Bacteroides amylophilus, Bacteroides Ruminantium, Steptococcus bovis Prevotella bryantil là vi khuẩn gram âm có thể sử dụng polysaccharide hòa tan, là xylans.[8]
Vi khuẩn phân giải đường chủ yếu sử dụng polysaccharide, nhưng cũng có khả năng tiêu thụ disaccharide và monosaccharide Các loài vi khuẩn như Lachnospira multiparus và Selenomonas ruminantium nổi bật với khả năng sử dụng hiệu quả carbohydrate hòa tan.
Vi khuẩn có khả năng sử dụng axit hữu cơ, đặc biệt là axit lactic, mặc dù nồng độ axit này trong dạ cỏ thường rất thấp, ngoại trừ trong một số điều kiện nhất định.
7 những trường hợp đặc biệt Những loài sử dụng lactic là Veillonella gasogenes, Veillonella alacalescens, Peptostreptococuss elsdenii.[8]
Vi khuẩn phân giải protein trong dạ cỏ bò đóng vai trò quan trọng trong việc tiết kiệm nitơ và kiểm soát nguy cơ dư thừa amoniac Amoniac là nguồn cung cấp cần thiết cho vi khuẩn dạ cỏ để tổng hợp protein cho sinh khối của chúng Ngoài ra, một số vi khuẩn còn được kích thích bởi các acid amin, peptid và isoacid, đặc biệt là từ valine, leucine và isoleucine Trong số các loài sinh aminoac, Peptostreptococus và Clostridium có khả năng phân giải lớn nhất.
Vi khuẩn tạo methan, hay còn gọi là methanogens, là những vi khuẩn sinh ra methan trong dạ cỏ của bò thông qua quá trình lên men sử dụng carbon Chúng được phân loại thành hai nhóm chính: Methanosphaera stadtmanae và Methanobrevibacter ruminantium.
Trong dạ cỏ bò, các vi khuẩn thuộc họ Methano bacteriaceae, đặc biệt là Methano sphaera stadtmanae, là phổ biến nhất, tiếp theo là Methano corpusculaceae và Methano spirillaceae Nhóm vi khuẩn Methano brevibacter ruminatium bao gồm Methano microbium, Methano bacterium và Methano sarcina, có khả năng sử dụng khí methan, hình dạng que ngắn, không sinh nội bào tử, với nhiệt độ phát triển tối ưu là 40°C và pH từ 6,1 đến 6,9.
Vi khuẩn tổng hợp vitamin: Nhiều loại vi sinh vật trong dạ cỏ bò có khả năng tổng hợp vitamin B và vitamin K.[8]
Vi khuẩn lên men pectin phát triển ở pH khoảng 6.0, ngoại trừ Bacteroides với pH 5,1 Đã có 32 chủng vi khuẩn lên men pectin được phân lập từ dạ cỏ bò, nhưng chủ yếu có 3 chủng chính: Lachnospira multiparous, Butyrivibrio fibrisolvens và Bacteroides ruminicola Tất cả đều là vi khuẩn kỵ khí với đường kính từ 1,0 – 1,2 𝜇m, thường lên men pectin để tạo ra format và khí H2 Các sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men này được các vi khuẩn khác sử dụng, chẳng hạn như succinate.
Giới thiệu về hệ enzym cellulase
Cellulase là tên chung cho các nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân của cellulose và các dẫn xuất celluoligosaccharide.[11]
According to the classification by the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), the cellulose hydrolysis system includes three key enzymes: endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase (EC 3.2.1.91), and β-glucosidase (EC 3.2.1.21).
Tên thường gọi là cellulase1,4-β –glucanase
Tên hệ thống: 1,2-(1,3:1,4)- β-D-glucan-4- glucanohydrolase
Enzym này, còn được biết đến với các tên gọi như endo-1,4-β-D-glucanase, β-1,4-glucanase và cellulase A, có chức năng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose cũng như các β-D-glucan có trong ngũ cốc.
Tên thường gọi là cellulase 1,4-β-cellobiosidase
Tên hệ thống: 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase
Các tên khác: exo- cellobiohydrolase; exoglucanase; CBH1… Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và cellotetraose từ đầu không khử
Tên thường gọi là β-glucosidase
Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase
Các tên khác: cellobiase; β-glucosid glucohydrolase; β-1,6-glucosidase… Enzym này thủy phân các gốc β-D-glucosid, một số trường hợp cũng thủy phân β-D-galactosidase, β-D-fucoside, β-D-xyloside, α-L- arabinoside
Cellulase là một loại protein được tạo thành từ các đơn vị acid amin liên kết với nhau qua liên kết peptid Cấu trúc của cellulase bao gồm một tâm xúc tác và một đuôi không gian, trong đó đuôi này được bổ sung thêm vùng glycosil hóa và có phần cuối gắn kết với cellulose Vùng gắn kết với cellulose có cấu trúc khác biệt so với các liên kết thông thường của protein, và sự thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.
Enzym cellulase có trọng lượng từ 30-110 KDal và cấu trúc không gian gồm khoảng 280-600 acid amin Chiều dài trung bình của cellulase thường dao động từ 300-450 acid amin, trong đó trung tâm xúc tác chứa khoảng 250 acid amin.
Hệ enzym cellulase, thông qua việc bẽ gãy các liên kết β-1,4-glucan, đã thủy phân cellulose thành glucose Trong quá trình này, exoglucanase đóng vai trò là enzyme chính.
Enzyme exocellulase có khả năng thủy phân liên kết β-1,4-glucoside tại đầu không khử của chuỗi cellulose và cellodextrin, trong khi enzyme endocellulase thủy phân liên kết này ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, cellodextrin và các dẫn xuất cellulose Bên cạnh đó, β-glucosidase có tác dụng thủy phân gốc β-D-glucan của rơm rạ.
Enzyme có đặc tính hóa lý và hóa sinh quan trọng, chịu ảnh hưởng lớn từ nhiệt độ Ở nhiệt độ cao, enzyme dễ bị biến tính, dẫn đến sự giảm hoạt tính mạnh mẽ hoặc thậm chí mất hoàn toàn hoạt tính Ngược lại, ở nhiệt độ thấp dưới 0°C, hoạt tính enzyme cũng giảm đáng kể, nhưng có khả năng phục hồi khi được đưa về nhiệt độ thích hợp.
Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào bản chất của chúng, có thể ở pH trung tính, kiềm hoặc acid Điều kiện môi trường sống ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme, làm thay đổi tốc độ phản ứng Trong tự nhiên, vi sinh vật điều chỉnh điều kiện enzyme để đạt được mức phản ứng tối ưu, hoặc phát triển hệ enzyme thích nghi với các điều kiện sống khắc nghiệt.
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose
Trong đó, ion Hg 2+ ức chế cellulase hoàn toàn, các ion khác như Mn 2+ , Ag + ,
Cellulosome là phức hệ enzyme ngoại bào của vi khuẩn kị khí, đặc biệt là Clostridium thermocellum, có vai trò quan trọng trong việc thủy phân cellulose trong biomass với hiệu quả cao Nhiều gen của C thermocellum mã hóa cho cellulosome, bao gồm các enzyme cellulase, xylanase, xyloglucanases, pectinases, glycosidases, cùng với các protein cấu trúc và một thành phần protein không xúc tác đang được nghiên cứu Các thành phần này không phân bố đồng đều trong phức hợp enzyme và không phải tất cả gen đều được biểu hiện Cellulosome nằm trên bề mặt tế bào, giúp giảm thiểu sự khuyếch tán enzyme và sản phẩm thủy phân, từ đó đảm bảo rằng sản phẩm được hấp thu hoàn toàn vào quá trình chuyển hóa của tế bào.
Các bằng chứng cho thấy bộ máy enzyme phân giải cellulose của
C.thermocellum có hiệu quả gấp 50 đến 100 lần so với enzyme của nấm, trong mỗi gam protein Tuy nhiên việc sản sinh cellulosome bởi thermophilic hiện nay là rất thấp Người ta sẽ cải thiện bằng cách đột biến chọn lọc hoặc dùng kỹ thuật chuyển đổi gen giữa các loài vi khuẩn.[28] Điều đáng chú ý là cellulosome chỉ mới được sản xuất từ loài vi khuần
Clostridiaceae và Lachnospiraceae là những vi khuẩn kỵ khí quan trọng trong dạ cỏ, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình tiêu hóa Phức hợp enzyme của cellulosome đang trở thành một mô hình nghiên cứu hấp dẫn cho các ứng dụng kỹ thuật sinh học in vitro.
Phân giải rơm qua xử lý
Lignocellulose là thành phần chính của rơm rạ, bao gồm ba thành phần là cellulose, hemicellulose và lignin Trong đó, cellulose chiếm 32-47%, hemicellulose chiếm 19-27% và lignin chiếm 5-24%.[16]
Trong hemicellulose các pentoses chiếm ưu thế, trong đó xylose là đường quan trọng nhất chiếm 14,8 – 20,2%.[16]
Thành phần phần trăm các chất trong rơm rạ được thể hiện trong hình 1.4
Hình 1.4 Thành phần của lignocellulose.[25]
1.3.2 Cấu trúc của rơm trong tự nhiên
Hình 1.5 Cấu trúc hiển vi của lignocellulose.[24]
Lignocellulose chủ yếu bao gồm cellulose, với các phân tử glucose liên kết bằng liên kết 𝛽1,4-glucoside Hemicellulose, thành phần phổ biến thứ hai, chứa các đường 5-6 carbon như arabinose, galactose, glucose, mannose và xylose, thường có mặt trong vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ và trấu Lignin, với ba thành phần chính là p-coumaryl alcohol (H), coniferyl alcohol (G) và sinapyl alcohol (S), được hình thành qua các phản ứng trùng ngưng Tỷ lệ các thành phần này khác nhau tùy thuộc vào loại cây, mô gỗ và các lớp tế bào khác nhau.
Cấu trúc của cellulose, hemicellulose và lignin, được gọi là microfibrils, đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc trung gian của tế bào thực vật Hình 1.5 minh họa cấu trúc hiển vi của lignocellulose.
Hình 1.6.Cấu trúc của lignocellulose.[35]
Các phân tử cellulose hình thành nên sợi sơ cấp với đường kính khoảng 3nm, và những sợi này kết hợp lại để tạo thành vi sợi Trong điều kiện tự nhiên, vi sợi thường không đồng nhất và tồn tại dưới hai vùng khác nhau.
Vùng kết tinh của cellulose là nơi các mạch cellulose liên kết chặt chẽ nhờ liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl Khu vực này có tính bền vững cao trước các tác động từ môi trường bên ngoài Enzyme cellulase chỉ có khả năng tác động ở bề mặt của hệ sợi trong vùng kết tinh này.
Vùng vô định hình của cellulose được hình thành bởi các mạch liên kết với nhau thông qua lực Vander Waals Trong khu vực này, cấu trúc cellulose không chặt chẽ, khiến nó dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài.
1.3.3 Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ
Rơm rạ chứa các sợi polymer cacbonhydrat phức tạp, bao gồm cellulose và hemicellulose, được bảo vệ bởi lớp lignin dày Lignin này ngăn cản quá trình thủy phân của enzyme, do đó, cần thực hiện bước tiền xử lý để phá vỡ lignin, giúp lộ cellulose và hemicellulose cho quá trình thủy phân hiệu quả hơn.
Tiền xử lý là bước quan trọng nhằm giảm thiểu cellulose kết tinh, tăng diện tích bề mặt biomass, loại bỏ hemicellulose và phá vỡ lớp lignin Quá trình này giúp cellulose trở nên dễ tiếp cận hơn với enzyme, từ đó tăng cường khả năng chuyển đổi polymer carbohydrate thành đường lên men một cách nhanh chóng và hiệu quả hơn.
Tiền xử lý là giai đoạn quan trọng trong việc chuyển đổi đường cellulose để lên men, bao gồm các phương pháp hóa học, vật lý, nhiệt và sự kết hợp giữa chúng Tiền xử lý vật lý giúp tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và khe rỗng bên trong vật liệu, đồng thời giảm độ kết tinh và độ polyme hóa của cellulose, thường được sử dụng để giảm dư lượng lignocellulosic thông qua các phương pháp như hấp, nghiền, xay, chiếu xạ, nhiệt độ và áp suất Trong khi đó, tiền xử lý hóa học cũng mang lại nhiều tiềm năng với các phương pháp hứa hẹn.
Tiền xử lý với kiềm
Tiền xử lý với ammonia
Tiền xử lý với acid
Tiền xử lý với các tác nhân oxy hóa
Tiền xử lý sinh học là một phương pháp hứa hẹn trong việc loại bỏ lignin từ lignocellulose, với ưu điểm sử dụng ít năng lượng và hóa chất Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa có hệ thống nào có khả năng điều khiển nhanh chóng và an toàn cho môi trường Nấm trắng thối thuộc lớp Basidiomycetes được xem là vi sinh vật tiềm năng nhất trong quá trình này, được đánh giá dựa trên sự thay đổi về số lượng và cấu trúc của rơm sau xử lý, cũng như độ nhạy cảm với thủy phân enzym.
Hiệu quả thủy phân lignocellulosic biomass được cải thiện khi sử dụng kết hợp nhiều loại enzyme như cellulase, xylanases và pectinases Tuy nhiên, chi phí của phương pháp này tăng đáng kể, mặc dù từ góc độ sinh thái, nó vẫn được coi là một giải pháp hứa hẹn.
17 d Tiền xử lý kết hợp
Kun et al (2009) đã báo cáo rằng việc tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm kết hợp với xúc tác H2O2 và hỗ trợ từ tiền xử lý vi sóng có thể làm thay đổi đáng kể tính chất vật lý và vi cấu trúc của rơm Bên cạnh đó, Zhu et al (2006) cũng đã nghiên cứu một số phương pháp tiền xử lý vi sóng kết hợp với axit và kiềm, nhằm loại bỏ hemicellulose và lignin trong rơm rạ.
1.3.4 Con đường phân giải rơm
❖ Cơ chế phản ứng theo công nghệ sinh học hiện đại
Endocellulase xúc tác cắt liên kết 1,4 -glucoside trong cellulose, lignin và 𝛼 -
D - glucan ngẫu nhiên Sản phẩm là cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.[6]
Exocellulase : cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose
Cellobiase: tham gia phân giải disaccharide và cellotetrose thành glucose
Cơ chế này được thể hiện qua hình 1.7
Hình 1.7.Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase theo Erikson [1]
Thủy phân enzyme là quá trình phân hủy cellulose và hemicellulose bằng cách sử dụng enzyme, trong đó cellulose chủ yếu chứa glucans, còn hemicellulose bao gồm nhiều loại đường như mannan, xylan, glucan, galactan và arabinan Sản phẩm chính từ thủy phân cellulose là glucose, trong khi hemicellulose tạo ra cả pentoses và hexoses Tuy nhiên, hàm lượng lignin cao trong rơm cản trở sự tiếp xúc của enzyme, làm giảm tốc độ và năng suất thủy phân Ngoài lignin, cellobiose và glucose cũng gây ức chế mạnh mẽ quá trình thủy phân của cellulases.
Thủy phân hemicellulose bởi enzyme thường diễn ra trong điều kiện nhẹ, với áp suất thấp và thời gian lưu giữ dài.
Nghiên cứu về Aspergillus niger cho thấy khả năng sản xuất glucose từ rơm rạ có thể tăng từ 43% đến 87%, với kích thước rơm giảm từ 425 xuống 75 mm khi nhiệt độ tối ưu là 45 - 50°C và pH khoảng 4.5 – 5.0 Nồng độ và tỷ lệ glucose sản phẩm phụ thuộc vào giai đoạn tiền xử lý rơm, nồng độ cơ chất và tế bào Hiệu quả thủy phân lignocellulosic trong biomass được cải thiện khi sử dụng sự kết hợp của nhiều loại enzyme như cellulase, xylanases và pectinaza, thay vì chỉ sử dụng cellulase đơn lẻ.
Hiện trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam và các nước trên thế giới
Rơm rạ vẫn là nguồn năng lượng chính cho việc nấu nướng ở nhiều vùng nông thôn và được sử dụng để sản xuất các vật dụng sinh hoạt như chổi rơm, mũ rơm, giấy, cũng như trong xây dựng nhà cửa.
Rơm trong sản xuất nông nghiệp đóng vai trò quan trọng như nguồn thức ăn cho gia súc, phân bón hữu cơ, và nguyên liệu cho việc trồng nấm rơm, nấm bào ngư, nấm sò cùng rau sạch Nó cũng giúp giữ ẩm và giữ ấm cho cây trồng Việc áp dụng các giải pháp kỹ thuật để nâng cao giá trị dinh dưỡng và sử dụng rơm hiệu quả sẽ mang lại lợi ích lớn trong chăn nuôi gia súc nhai lại.
Trong ngành công nghiệp hiện đại, rơm rạ được chế biến thành ván ép để sản xuất đồ nội thất, thay thế gỗ trong làm tường ngăn, và được sử dụng làm phụ gia trong sản xuất xi măng.
Rơm không chỉ thân thiện với môi trường mà còn góp phần quan trọng trong sản xuất công nghiệp và nông nghiệp, tạo ra việc làm cho người lao động và nâng cao đời sống tinh thần cho xã hội Bên cạnh đó, việc tận dụng nguồn rơm rạ, thường được xem là phế phẩm, có thể tạo ra giá trị nghệ thuật và các vật dụng cần thiết trong cuộc sống hàng ngày.
Rơm lúa là nguồn thức ăn phổ biến cho trâu bò ở các nước nhiệt đới, với 75% rơm lúa rẫy và 82% rơm lúa nước tại Thái Lan được sử dụng cho chăn nuôi Tại Bangladesh, tỷ lệ này là 47% Ở Mỹ, có 538 dự án xây dựng nhà bằng rơm rạ đã được đăng ký, trong đó khu vực xung quanh thủ đô Washington có một số dự án đã hoàn thành Những công trình như nhà ở, trường học và công sở với tường làm từ rơm rạ được đánh giá cao nhờ khả năng chống thấm nước, chống cháy, bảo toàn năng lượng và khả năng chịu bão, góp phần bảo vệ môi trường.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu
Rơm đã qua tiền xử lý và chưa qua xử lý từ trường Đại Học Bách Khoa TPHCMtheo dự án JICA (Japan International Cooperation Agency)
Enzyme được chiết xuất từ hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò, được lấy từ một lò mổ tại huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai Mẫu dạ cỏ bò này đã được thu thập vào tháng 2 năm 2014.
Sơ đồ 2.1.Quy trình thu nhận enzyme cellulase
Môi trường PCS có pH đạt chuẩn Hấp khử trùng 121°C, 15 phút
50 ml môi trường PCS có pH phù hợp với từng cộng đồng vi sinh vật
Mẫu thức ăn dạ cỏ bò
Ly tâm 6000 vòng trong 5 phút, nhiệt độ phòng
Bảo quản trong tủ lạnh
1 ml dịch mẫu dạ cỏ bò Đồng nhất mẫu
Thiết bị, hóa chất
Máy so màu OD 1100RS Spectrophotometer
Một số thiết bị thông dụng khác như: Tủ cấy Laminar; Nồi hấp thanh trùng Hirayama HVE-50; Cân điện tử Excell; Tủ ấm Memmert; máy ly tâm Hettich…
A Hóa chất trong phản ứng xác định hoạt tính enzyme Cellulase
➢ Agar CMC 1% (Carboxymethylcellelose Sodium Salt):
Nước cất vừa đủ 1000 ml
CMC là hợp chất không tan trong nước ở nhiệt độ thường, cần gia nhiệt và khuấy để tan hoàn toàn Sau khi CMC đã tan, trút agar vào, khuấy đều và hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút.
Nước cất vừa đủ 500 ml
➢ Dung dịch NaOH 1M giải nhuộm congo red:
Dung dịch acid citric 0.1M (a): 21,01g C6H8O7.H2O hòa tan và định mức đến
Dung dịch trinatri citrate 0.1M (b): 29,41g C6H5O7Na3 2H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml
Bảng 2.1.Dung dịch đệm citrate a (ml) b (ml) pH
Dung dịch mononatri orthophosphate (A): 27,8g Na2PO4 hòa tan và định mức đến 1000ml
Dung dịch dinatri hydrophosphate (B): 53,05g Na2HPO4 7H2O hoặc 71,7g
Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000ml
Bảng 2.2.Dung dịch đệm phosphate
A (ml) B (ml) pH A (ml) B (ml) pH
➢ Thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid):
Hòa tan 7,486 g DNS và 6,92 g NaOH trong 1000 ml nước cất, sau đó thêm 216 g muối sodium potassium tartrate (KNaC4H4O6) và 5,36 ml phenol ở nhiệt độ 50 °C cùng với 5,86 g Na2S2O5 Lưu trữ hỗn hợp trong chai sẫm màu và bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
➢ Dung dịch đường chuẩn 1mg/ml: cân 10mg đường để chuẩn độ bằng cân phân tích, pha trong 10ml nước cất, lắc đều và giữ lạnh
Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue 0,1g được hòa tan trong 50ml ethanol 99%, sau đó pha loãng với nước cất thành 500ml để tạo thành dung dịch (1) trong chai màu tối Dung dịch (2) được tạo ra bằng cách pha loãng 100ml H3PO4 85% thành 500ml Khi cần sử dụng, hòa 1 phần dung dịch (1) với 1 phần dung dịch (2) để lấy dịch trong.
➢ Dung dịch protein chuẩn 1mg/ml: cân 10mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 10ml nước cất, lắc đều và giữ lạnh
B Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
• Môi trường PCS medium (Peptone cellulosic solution):
Rice straw (rơm rạ khô xay) 20 g/l
Môi trường được chuẩn độ pH bằng NaOH hoặc HCl để thay đổi pH từ 5,5 – 7,0, hấp khử trùng 121 o C, 15 phút
Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ 2.2.Tóm tắt toàn bộ thí nghiệm
Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính cellulase bằng pp Filter paper:
- pH 6.0, 6.1, 6.3, 6.5, 6.7, 6.9 Thu dịch enzyme cellulase thô
Phân giải rơm qua xử lý Chọn lọc hệ enzyme cellulase tối ưu
Khảo sát lượng đường khử sinh ra bằng pp DNS:
- Nhiệt độ, pH: tùy mẫu
Khảo sát khả năng sử dụng rơm rạ Chọn lọc mẫu
Tăng sinh trong PCS có kèm theo miếng giấy lọc để làm chất chỉ thị,
Thử CMC và kiểm tra sự phân giải giấy lọc sau 4, 7, 10, 13 ngày
Mẫu thức ăn từ dạ cỏ bò
Thử CMC và kiểm tra sự phân giải giấy lọc sau 7, 10, 13 ngày
Khảo sát điều kiện phát triển của hệ vi sinh vật:
2.3.1 Quy trình tăng sinh chọn lọc
Mục đích của việc tăng sinh là phát triển hệ vi sinh vật mong muốn trong môi trường nuôi cấy thích hợp Quá trình tăng sinh được thực hiện nhiều lần để đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vật.
➢ Quy trình tăng sinh lần 1 được thể hiện theo các bước ở sơ đồ 2.3
Sơ đồ 2.3 Quy trình tăng sinh chọn lọc mẫu
Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm nhằm kiểm tra khả năng nhiễm khuẩn sau quá trình khử trùng Tiến hành đồng nhất mẫu, sau đó hút 1 ml dịch và lấy khoảng 0,1 g mẫu rơm dạ cỏ bò để phân phối vào các bình chứa môi trường.
Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37°C, pH 7.0, kèm mẫu đối chứng trong 13 ngày
Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ thị khả năng phân giải cellulose
Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc
Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13mm) và ngày phân giải giấy lọc ngắn (≤7ngày)
2.3.2 Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật
➢ Quy trình tăng sinh lần 2: Khảo sát nhiệt độphát triển của hệ vi sinh vật được thể hiện theo sơ đồ 2.4
Sơ đồ 2.4.Quy trình khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật
Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng
Lựa chọn các mẫu đã phân hủy hết giấy lọc trong đợt tăng sinh lần 1
Lắc mạnh, trộn đều các mẫu được chọn, hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào bình môi trường PCS
Mẫu được ủ ở 2 nhiệt độ 39°C và 41°C, pH 7.0, kèm mẫu đối chứng
Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ thị khả năng phân giải cellulose
Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc
Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13 mm) và ngày phân giải giấy lọc ngắn (≤7 ngày)
2.3.3 Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật
➢ Quy trình tăng sinh lần 3: Khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật được thể hiện theo sơ đồ 2.5
Sơ đồ 2.5.Quy trình khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật
Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng
Lựa chọn các mẫu đã phân hủy hết giấy lọc trong đợt tăng sinh lần 2
Lắc mạnh, trộn đều các mẫu được chọn, hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào bình môi trường PCS
Tùy từng mẫu được ủ ở các nhiệt độ thích hợp, thay đổi pH
Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ thị khả năng phân giải cellulose
Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc
Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13 mm) và ngày phân giải giấy lọc ngắn (≤7 ngày)
Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase
2.4.1 Quy trình phát hiện sinh tổng hợp enzyme endoglucanase trên thạch đĩa CMC
Sau quá trình tăng sinh, kiểm tra sinh tổng hợp enzyme endoglucanase bằng thuốc thử Congo red 0,1% trên thạch đĩa CMC
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường PCS ở nhiệt độ khảo sát trong khoảng thời gian 4, 7, 10 và 13 ngày Sau đó, môi trường CMC được khử trùng và đổ vào đĩa, tạo các giếng trên bề mặt thạch Tiếp theo, 20𝜇l dịch nuôi cấy được bơm vào từng giếng và ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ khảo sát.
Cho 5 ml dung dịch thuốc thử Congo red 0,1% vào các đĩa thạch đã ủ 24 giờ ở nhiệt độ khảo sát Sau 30 phút, loại bỏ dung dich thuốc thử và thực hiện bước giải nhuộm với 5ml NaCl 1M Sau 15 phút, loại bỏ NaCl và đọc kết quả Mẫu nào có sự phân giải CMC sẽ tạo vùng phân giải nhạt màu hơn so với màu của thuốc thử Congo red
2.4.2 Định lượng hàm lượng protein tổng trong dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford
Nguyên tắc của phương pháp phát hiện protein bằng Coomassie Brilliant Blue là hình thành hợp chất màu hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, với cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch Phương pháp này có độ nhạy cao, có thể phát hiện protein ở nồng độ tới vài µg/ml, đồng thời dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Phương pháp này giúp xác định các hệ vi sinh vật có khả năng sản sinh enzyme cellulase cao, từ đó khảo sát các điều kiện lên men tối ưu.
Thuốc thử Coomasie Brilliant Blue
Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml
Dịch enzyme thô được pha loãng 50 lần
➢ Lập đồ thị đường chuẩn Để dung dich albumin chuẩn có cỏc nồng độ từ 10-40 àg/ml ta thực hiện như sau:
Bảng 2.3: Thông số xây dựng đường chuẩn albumin Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4
Nồng độ albumin (àg/ml) 0 10 20 30 40
Dung dịch albumin chuẩn (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4
Nước cất vô trùng (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6
Để thực hiện thí nghiệm với thuốc thử Bradford, sử dụng 2 ml thuốc thử cho mỗi ống nghiệm, bắt đầu với ống 1 tại thời gian 0 phút Tiếp theo, tiến hành phản ứng ở các ống 2, 3, 4 với khoảng thời gian cách nhau 1 phút Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị tương tự, với độ pha loãng điều chỉnh để đảm bảo mật độ quang đo được nằm trong khoảng của đường chuẩn Quá trình đo được thực hiện tại bước sóng 595 nm.
Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (àg/ml) và mật độ quang OD595 giúp xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích Dựa vào phương trình của đường tuyến tính này, ta có thể tính toán chính xác lượng protein có trong mẫu.
Tổng hàm lượng protein trong 1ml dịch enzyme thô được tính theo công thức:
Với: X: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (àg/ml) n: hệ số pha loãng (50 lần) m: khối lượng mẫu (500 𝜇l=0.5 ml)
V: thể tích mẫu hút đi đo OD (1 ml)
2.4.3 Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper
➢ Nguyên lý phương pháp Filter Paper:
Phương pháp FPA, được IUPAC khuyên dùng, là kỹ thuật phổ biến nhất để kiểm tra hoạt tính của enzyme cellulase Phương pháp này dựa trên việc chuyển đổi lượng cơ chất, cụ thể là 2mg đường từ 50mg giấy lọc (bao gồm cả dạng không kết tinh và kết tinh) trong thời gian 60 phút, với nồng độ đường được đo bằng phương pháp DNS Hoạt tính của cellulase được thể hiện bằng đơn vị giấy lọc (FPU) trên thể tích dung dịch enzyme ban đầu Ưu điểm của FPA là sử dụng cơ chất phổ biến và dễ bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của cellulase, nhưng nhược điểm là cần thời gian cho phản ứng và dễ bị ảnh hưởng bởi sai số thiết bị.
Dung dịch đường glucose chuẩn 1mg/ml
Dịch enzyme: dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PCS sau 14 ngày
Bảng 2.4.Thông số xây dựng đường chuẩn glucose Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4
Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4
Dung dịch glucose chuẩn(ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4
Dung dịch đệm photphate pH 6.3 (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6
▪ Chuẩn bị ống trắng và ống đối chứng
▪ Ống trắng : 1,5ml đệm phosphate
▪ Ống đối chứng: {1 ml đệm + 0,5 ml enzyme.
▪ Ống phản ứng : 1 ml đệm + giấy lọc + 0,5 ml enzyme, sao cho giấy lọc phải được ngập hết trong dung dịch đệm Votex nhẹ
▪ Ủ các ống vào 39°C trong 60 phút để thực hiện phản ứng
▪ Sau ủ, hút dung dịch thí nghiệm vào effendorf 1,5ml và ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút
▪ Sau khi ly tâm, hút 1ml dung dịch nổi phía trên vào trong một ống nghiệm khác và thêm 2ml thuốc thử DNS và trộn đều
▪ Đun sôi các ống nghiệm trong 5 phút (có đậy nút)
▪ Chuyển các ống nghiệm vào nước lạnh để làm nguội
▪ Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm
Số đo OD của lượng đường khử thực sự được giải phóng là:
∆OD= OD ống nghiệm phản ứng – OD ống nghiệm đệm + giấy lọc – OD ống nghiệm đệm+enzyme
Sử dụng phương trình của đường chuẩn để tính hàm lượng đường khử thực sự X(mg/ml) được giải phóng bởi phản ứng thủy phân
Tính hàm lượng đường trong 1ml mẫu ban đầu (mg/ml) = 𝑋∗𝑛∗𝑉1
Với: X: nồng độ đường suy ra từ đường chuẩn (mg/ml) n: hệ số pha loãng (3lần)
V: thể tích mẫu phân tích (0,5ml)
V1: thể tích mẫu hút đi đo OD (1ml)
Hoạt tính enzyme FPU (U/ml)= ℎà𝑚 𝑙ươ𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 1 𝑚𝑙 𝑚ẫ𝑢 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢
2.5 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp của hệ enzyme cellulase
Các enzyme cellulase từ các nguồn khác nhau có điều kiện phản ứng tối ưu khác nhau Nhiệt độ và pH là hai yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của cellulase Vì vậy, việc xác định các điều kiện tối ưu cho hoạt tính cellulase là cần thiết.
2.5.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase
Xác định hoạt tính FPase của enzyme cellulase bằng phương pháp DNS tại dung dịch đệm phosphate có pH: 6.0, 6.1, 6.3, 6.5, 6.7 và 6.9
2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase
Nghiên cứu xác định hoạt tính FPase của enzyme cellulase bằng phương pháp DNS ở các nhiệt độ phản ứng 37°C, 39°C và 41°C Sử dụng đệm phosphate với pH phù hợp cho từng mẫu đã được khảo sát Mục tiêu là xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của enzyme cellulase.
Khảo sát quá trình enzyme cellulase thủy phân cellulose từ rơm rạ
Sơ đồ 2.6: Quy trình phân giải rơm bằng hệ enzyme cellulase
Rơm đã qua xử lý được xay nhuyễn và sấy khô ở nhiệt độ 70°C trong 1 ngày, sau đó được để vào bình hút ẩm để nguội Tiếp theo, sử dụng cân điện tử để cân 500mg rơm cho vào bình chứa, và thêm 10ml dịch đệm phosphate phù hợp với pH của từng hệ enzyme, sau đó tiến hành hấp khử trùng.
Thu nhận rơm còn lại, sấy khô
Thu nhận kết quả và phân tích,xử lý số liệu Ủ ở nhiệt độ, pH thích hợp
Sau 2, 3, 4 và 5 ngày, thu dịch, thử đường khử theo phương pháp DNS
500 mg rơm qua xử lý + 10 ml đệm phosphate
Để tiến hành phân tích hàm lượng đường khử trong rơm, đầu tiên, đun nóng ở 121°C trong 15 phút, sau đó thêm 1ml enzyme thô vào bình rơm và khuấy trộn, ủ ở nhiệt độ thích hợp Sau 2 ngày, thu dịch và quay ly tâm ở 10.000 vòng trong 5 phút để thu dịch trong Sử dụng phương pháp DNS để xác định lượng đường khử tạo ra vào ngày thứ 3, 4 và 5 Sau 5 ngày, thu nhận rơm còn lại, lọc qua giấy lọc đã sấy khô và cân khối lượng khô, sau đó sấy khô giấy lọc và rơm ở 70°C trong 1 ngày Cuối cùng, phân tích kết quả hàm lượng đường khử và mức độ phân giải của rơm.
2.6.1 Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS
➢ Nguyên lý phương pháp DNS
Phương pháp xác định hàm lượng đường khử dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một khoảng nhất định, và việc so màu được thực hiện ở bước sóng 540nm Dựa vào đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS, có thể tính toán hàm lượng đường khử trong mẫu nghiên cứu.
➢ Dụng cụ, thiết bị: Máy so màu, bếp điện, pipetman, effenphore 1.5ml, ống nghiệm có nắp, pipetman
Dung dịch đường glucose chuẩn 1 mg/ml để dựng đường chuẩn glucose tương tự như phương pháp ở mục 2.4.3
Dịchthu nhận từ bình phân giải rơm được ly tâm 10000vòng trong 5 phút Hút 1ml dịch trong cho vào ống nghiệm Thêm 2 ml thuốc thử DNS
Lắc đều các ống nghiệm và đun sôi trong 5 phút với nắp đậy Sau đó, làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước mát Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540nm bằng 0 và đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở cùng bước sóng này.
Sử dụng phương trình của đường chuẩn để tính hàm lượng glucose có trong dịch phân giải rơm
Tính hàm lượng đường trong 1ml mẫu ban đầu (mg/ml)= X*n
Với: X: nồng độ đường suy ra từ đường chuẩn (mg/ml)
34 n: hệ số pha loãng (9,09 lần)
2.6.2 Khả năng phân giải rơm rạ
➢ Mục đích: Xác định lượng rơm được phân giải sau 5 ngày thủy phân bằng enzyme
Bình hút ẩm có silicagel
Tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 70℃
Cân phân tích độ chính xác đạt ± 0.001 g
Để thực hiện thí nghiệm, đầu tiên cân khối lượng rơm và giấy lọc đã được sấy khô ở 70℃ trong 1 ngày Sau 5 ngày, thu lượng rơm còn lại bằng cách lọc qua giấy lọc và tiếp tục sấy khô ở 70℃, bắt đầu tính thời gian khi tủ sấy đạt nhiệt độ này Sau 1 ngày sấy, lấy giấy lọc và rơm ra, để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng (khoảng 30 – 40 phút) Cuối cùng, cân lại khối lượng rơm và giấy lọc, lặp lại quy trình cho đến khi lượng rơm mất đi được ghi nhận.
2 lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 50 mg
➢ Kết quả mrơm tiêu thụ = m rơm ban đầu – (m rơm còn lại + giấy lọc – m giấy lọc)
Trong nghiên cứu này, khối lượng rơm khô bị thủy phân bởi enzyme cellulase được gọi là mrơm tiêu thụ (mg) Khối lượng rơm khô ban đầu được ký hiệu là mrơm ban đầu (mg) Sau quá trình lọc, khối lượng rơm còn lại và giấy lọc được sấy khô ở 70℃ trong 1 ngày được ghi nhận là mrơm còn lại + giấy lọc (mg) Cuối cùng, khối lượng giấy lọc sấy khô và cân trước khi lọc rơm được ký hiệu là mgiấy lọc (mg).
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Kết quả tăng sinh trên môi trường PCS
Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc trong môi trường PCS và vòng phân giải trên đĩa thạch CMC tại 37°C, pH 7.0 được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc trong môi trường PCS và vòng phân giải trên đĩa thạch CMC tại 37°C, pH 7.0
Mẫu Ngày phân giải giấy lọc
(ngày) Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
Ghi chú:“ –“ : không có vòng phân giải CMC, hoặc giấy lọc chưa bị phân giải
Kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng sử dụng giấy lọc và tạo vòng phân giải CMC không đồng nhất So sánh với các nghiên cứu trước đây của Lương Ngọc Tuấn Anh (2012) và Hoàng Nguyên (2011), kết quả này tương tự Dựa trên những phát hiện này, chúng tôi quyết định lựa chọn các mẫu có khả năng này để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
• Ngày phân giải giấy lọc trước 7 ngày và đường kính vòng phân giải CMC khoảng 13mm cùng với sự ổn định qua các ngày thử
• Đó là các mẫu M4, M5, M15, M16, M17, M19, M20, M22 và M24
Hình 3.1.Chín mẫu dạ cỏ bò tăng sinh ở 37°C, pH 7.0
Hình 3.2.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 sau 7 ngày tăng sinh trong môi trường PCS
Hình 3.3.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 sau 10 ngày tăng sinh trong môi trường PCS
Hình 3.4.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 sau 13 ngày tăng sinh trong môi trường PCS.
Kết quả khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật
Kết quả tối ưu nhiệt độđược thể hiện qua các bảng 3.2, 3.3 và 3.4
Bảng 3.2.Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 37°C, pH 7.0
Mẫu Ngày phân giải giấy lọc (ngày) Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
Bảng 3.3.Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 39°C, pH 7.0
Mẫu Ngày phân giải giấy lọc (ngày) Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
Bảng 3.4.Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 41°C, pH 7.0
Mẫu Ngày phân giải giấy lọc (ngày) Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
Ghi chú:“ –“ : không có vòng phân giải CMC, hoặc giấy lọc chưa bị phân giải
Kết quả kiểm tra cho thấy các mẫu M4, M5 và M20 phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C, trong khi mẫu M15 và M19 thích hợp với nhiệt độ 39°C Các mẫu M16, M17, M22 và M24 lại thích ứng ở nhiệt độ 41°C Điều này phản ánh sự thay đổi của cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò, phụ thuộc vào nguồn thức ăn.
Kết quả khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật
Kết quả tối ưu pH của 9 mẫu nuôi cấy trên môi trường PCS lỏng được thể hiện qua bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở các pH khác nhau
Ngày phân giải giấy lọc (ngày) Đường kính vòng phân giải CMC
Ghi chú:“ –“ : không có vòng phân giải CMC, hoặc giấy lọc chưa bị phân giải
Sau khi kiểm tra sinh tổng hợp cellulase trên thạch đĩa CMC ở các pH khác nhau, chúng tôi nhận thấy đường kính vòng CMC có sự khác biệt rõ rệt Đa số các mẫu tập trung ở khoảng pH 6.5 - 7.0, ngoại trừ mẫu M20 ở pH 6.0 Đặc biệt, mẫu M19 cho kết quả phân giải vòng CMC và thời gian phân giải giấy lọc ngắn hơn, với pH hoạt động rộng hơn và vượt trội so với các mẫu khác Kết quả tối ưu về nhiệt độ và pH này tương tự như môi trường trong dạ cỏ bò, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của hệ vi sinh vật.
✓ Mẫu M4 thích hợp phát triển ở pH 7, mẫu M5 thích hợp phát triển ở pH 6.5, mẫu M20 thích hợp phát triển ở pH 6.0 và tại nhiệt độ 37°C
✓ Mẫu M15 và M19 thích hợp phát triển ở pH 7, tại nhiệt độ 39°C
✓ Mẫu M16, M24 thích hợp phát triển ở pH 6.5 và mẫu M17 , M22 thích hợp phát triển ở pH 7, tại nhiệt độ 41°C
Kết quả hàm lượng protein tổngtheo phương pháp Bradford
Kết quả nồng độ protein tổng của 9 mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò đo theo phương pháp Bradford được thể hiện trong bảng 3.6 và biều đồ 3.1
Bảng 3.6.Nồng độ protein tổng của 9 mẫuvi sinh vật dạ cỏ bò
Mẫu OD Nồng độ protein (μg/ml)
Biểu đồ 3.1.Nồng độ protein tổng của 9 mẫuvi sinh vật dạ cỏ bò
Từ đồ thị cho ta thấy nồng độ protein tổng của mẫu M5 (4073,9𝜇g/ml) và M19 (4160,9𝜇g/ml)là cao nhất và thấp nhất là mẫu M20 (1900,0𝜇g/ml) và M24 (1552,2𝜇g/ml)
Mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò
Kết quả đo hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper
Kết quả đo vòng phân giải CMC trên đĩa thạch cho thấy hoạt tính của hệ enzyme cellulase, chủ yếu mang tính chất định tính Do đó, cần tiến hành kiểm tra hoạt tính tổng số cellulase bằng phương pháp FPA.
3.5.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase
Kết quả đo mật độ quang học ở bước sóng 540nm của 9 mẫu enzyme cellulase theo phương pháp FPA ở 39°C và thay đổi pH từ 6.0 – 6.9 được thể biện trong bảng 3.7
Bảng 3.7 Giá trị OD 540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi pH từ
Mẫu pH6.0 pH6.1 pH6.3 pH6.5 pH6.7 pH6.9
Kết quả khảo sát cho thấy pH tối ưu cho hoạt tính cellulase bằng phương pháp FP là từ 6.0 đến 6.9 ở nhiệt độ 39°C Các mẫu M15, M20 và M22 thích ứng tốt nhất ở pH 6.0, trong khi mẫu M5 phù hợp với pH 6.3 Các mẫu còn lại như M4, M16, M17, M19 và M24 thích ứng ở pH 6.5 Những kết quả này phù hợp với đặc điểm phát triển của cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò, nơi mà pH này được duy trì nhờ sản phẩm của các hệ vi khuẩn, tạo điều kiện cho chúng cùng tồn tại trong môi trường không khắc nghiệt.
3.5.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase
Kết quả đo mật độ quang học ở bước sóng 540nm của 9 mẫu enzyme cellulase theo phương pháp FPA đã được thực hiện với các nhiệt độ 37°C, 39°C và 41°C, cùng với pH tối ưu, và được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8.Giá trị OD540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi nhiệt độ
Từ kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính cellulase bằng phương pháp
Khi thay đổi nhiệt độ ở 37°C, 39°C và 41°C tại pH tối ưu, các mẫu M16, M19 và M22 cho thấy sự phù hợp tốt nhất với nhiệt độ hoạt động enzyme ở 37°C Trong khi đó, các mẫu M20 và M24 thích hợp cho nhiệt độ hoạt động enzyme ở 39°C, còn các mẫu M4, M5, M15 và M17 phù hợp với nhiệt độ hoạt động enzyme ở 41°C.
Dựa trên kết quả tối ưu về pH và nhiệt độ cho hoạt tính của hệ enzyme cellulase, hoạt tính cellulase tổng số được trình bày trong bảng 3.9 và biểu đồ 3.2.
Bảng 3.9.Kết quả hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp FPA
Hàm lượng glucose (mg/ml)
Biểu đồ 3.2.Hoạt tính cellulase tổng số của 9 mẫuenzyme cellulase
Biểu đồ 3.2 cho thấy hoạt tính cellulase tổng số của 9 mẫu enzyme cellulase từ cộng đồng vi khuẩn dạ cỏ bò khác nhau có sự khác biệt Kết quả này không hoàn toàn nhất quán với nồng độ protein tổng Nguyên nhân có thể là do thành phần cộng đồng vi khuẩn dạ cỏ bò cần thích nghi với điều kiện thức ăn thay đổi, dẫn đến việc chúng phải sản sinh hệ enzyme cellulase có hoạt tính mạnh hơn.
Sự cạnh tranh và đồng tồn tại giữa các hệ enzyme cellulase cho thấy hoạt tính cellulase tổng số không hoàn toàn tỷ lệ thuận với hàm lượng protein tổng Các hệ enzyme cellulase khác nhau sẽ có tỷ lệ các thành phần enzyme khác nhau.
Theo nghiên cứu của Faridha Begum et al (2013) [22], hoạt tính của hệ enzyme cellulase trong 9 mẫu cho kết quả thấp hơn, trong khi Nurulnisa Binti Nor Azman (2009) [15] lại cho thấy kết quả cao hơn Cụ thể, các mẫu M4, M5, M17 và M20 có hoạt tính cellulase từ 0.064 U/ml đến 0.075 U/ml, trong khi các mẫu M15, M16, M19, M22 và M24 đạt hoạt tính từ 0.088 U/ml đến 0.161 U/ml Ngoài ra, các mẫu M4, M5, M16 và M22 có đường kính vòng phân giải CMC trung bình từ 15,67 mm đến 17,33 mm, còn các mẫu M15, M17, M19, M20 và M24 đạt từ 18,33 mm đến 22,33 mm Dựa trên kết quả này, ba hệ enzyme cellulase có khả năng cao đã được chọn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
✓ Mẫu M15 có hoạt tính cellulase tổng số là 0,088 U/ml, ngày phân giải giấy lọc là 7ngày, trung bình đường kính vòng phân giải CMC là 22,00 mm
✓ Mẫu M19 có hoạt tính cellulase tổng số là 0,114 U/ml, ngày phân giải giấy lọc là 7ngày, trung bình đường kính vòng phân giải CMC là 22,33 mm
✓ Mẫu M24 có hoạt tính cellulase tổng số là 0,088 U/ml, ngày phân giải giấy lọc là 7ngày, trung bình đường kính vòng phân giải CMC là 18,67 mm.
Kết quả đo lượng đường khử sau khi phân giải rơm theo phương pháp DNS
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Tuyên (2011) và Jadhav A.R et al (2013), thời gian thủy phân có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quá trình thủy phân bằng enzyme Để khảo sát, tôi đã chọn các mốc thời gian 2, 3, 4 và 5 ngày Các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện tối ưu cho enzyme cellulase, với lượng enzyme ban đầu là 1ml và rơm là 500 mg Sau khi hoàn tất quá trình thủy phân, dịch lọc được thu lại và mật độ quang tại OD 540nm được đo theo phương pháp đã định.
DNS Kết quả nồng độ dịch đường khi theo dõi thời gian thủy phân rơm được thể hiện trong bảng 3.10 và biểu đồ 3.3 như sau
Bảng 3.10.Kết quả hàm lượng glucose trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase
Mẫu 0ngày 2ngày 3ngày 4ngày 5ngày
M15 có nồng độ 1,78 mg/ml, 1,90 mg/ml, 2,10 mg/ml, 2,24 mg/ml và 2,15 mg/ml M19 có nồng độ 1,66 mg/ml, 1,83 mg/ml, 2,54 mg/ml, 2,74 mg/ml và 2,80 mg/ml M24 có nồng độ 2,09 mg/ml, 2,15 mg/ml, 2,19 mg/ml, 2,47 mg/ml và 2,39 mg/ml.
Biểu đồ 3.3.Hàm lượng glucose tạo thành trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase
Phân tích từ bảng 3.10 và biểu đồ 3.3 cho thấy hàm lượng glucose có sự thay đổi theo thời gian Cụ thể, mẫu M19 ghi nhận sự tăng rõ rệt về hàm lượng glucose sau 5 ngày, đạt 2,80 mg/ml Trong khi đó, mẫu M15 và M24 có nồng độ glucose tăng dần và đạt mức cao nhất vào ngày thứ 4 với 2,24 mg/ml và 2,47 mg/ml, nhưng không có sự gia tăng đáng kể khi kéo dài đến 5 ngày Điều này cho thấy quá trình thủy phân bằng enzyme diễn ra mạnh mẽ đến ngày thứ 4, sau đó hoạt động xúc tác của enzyme diễn ra chậm lại Do đó, với hệ enzyme cellulase M19, thời gian thủy phân rơm cần ít nhất là 5 ngày.
0ngày 2ngày 3ngày 4ngày 5ngày
Nồng độ glucose (mg/ml)
48 còn hệ enzyme cellulase M15 và M24 nên diễn ra ít nhất 4 ngày mới đạt được hiệu suất thủy phân cao.
Kết quả phân giải rơm rạ
Kết quả khả năng phân giải rơm sau xử lý được trình bày trong bảng 3.11 và biểu đồ 3.4 dưới đây:
Bảng 3.11.Khả năng phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase
Mẫu Khối lượng rơm bị thủy phân (mg) % Rơm bị thủy phân
Biểu đồ 3.4.Khả năng phân giải rơmcủa 3 mẫu enzyme cellulase
Phân tích thống kê cho thấy cả ba hệ enzyme cellulase đều có khả năng tiêu thụ rơm cao, trong đó mẫu M19 nổi bật với tỷ lệ 21,01% sau 5 ngày phân giải Kết quả này phù hợp với việc từng hệ enzyme cellulase có thành phần enzyme khác nhau, trong đó enzyme endoglucanase đóng vai trò chủ yếu trong việc phân giải lignocellulose Do đó, mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò M19 với khả năng sinh ra enzyme endoglucanase vượt trội sẽ dẫn đến khả năng phân giải rơm rạ hiệu quả hơn.