Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài
Nấm Trichoderma đã được nghiên cứu và ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại cây trồng từ những năm 1930, khi Weinding lần đầu tiên đề xuất vấn đề này Nhiều nghiên cứu trên đồng ruộng đã chứng minh hiệu quả của nấm Trichoderma trong việc kiểm soát các loại nấm gây hại Tại Nam Mỹ, Trichoderma harzianum cho thấy hiệu quả cao trong việc phòng trừ nấm Phythium spp và Rhizoctonia solani, đặc biệt là trong bệnh chết héo đậu đỗ và củ cải Ở Ấn Độ, nấm này đạt hiệu quả ức chế lên tới 98% đối với Rhizoctonia solani trên cây khoai tây Tại Việt Nam, từ năm 1990, các nghiên cứu đã phân lập nguồn nấm Trichoderma bản địa để khảo sát cơ chế đối kháng và các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng, cho thấy các chủng nấm này có khả năng ức chế hiệu quả các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, và Fusarium sp.
Vào năm 2005, Nguyễn Ngọc Phúc đã thực hiện một cuộc khảo sát thành công về mối liên hệ giữa sự hiện diện của Trichoderma và các yếu tố đất, đồng thời tiến hành thử nghiệm đối kháng các chủng.
Trichoderma đã được phân lập thành công với các loại nấm gây bệnh như Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani, cho thấy khả năng đối kháng mạnh mẽ Đặc biệt, Trichoderma cho kết quả đối kháng với nấm Phytophthora palmivora vượt trội hơn hẳn so với Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani sau 4 ngày thử nghiệm.
Trichoderma là một trong những chủ đề nghiên cứu quan trọng về khả năng kháng nấm bệnh hại trên cây trồng Nghiên cứu của Huỳnh Văn Phục (2006) đã chỉ ra rằng nấm Trichoderma có khả năng kháng hiệu quả đối với nấm Rhizoctonia solani.
Fusarium oxysporum trên môi trường PGA.
Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm Trichoderma, có khả năng xử lý trực tiếp rơm rạ trên đồng ruộng để phục vụ sản xuất lúa Chế phẩm này không chỉ giúp ổn định độ bền vững của đất trong canh tác lúa thâm canh, mà còn nâng cao năng suất và giảm chi phí phân bón hóa học, góp phần vào chiến lược sản xuất nông nghiệp bền vững và bảo vệ môi trường.
Nghiên cứu từ Trường Đại Học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty Sát Trùng Việt Nam và Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã chỉ ra rằng nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani, nguyên nhân gây bệnh thối rễ trên cam quýt và bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu, cũng như một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, trên các cây trồng tại Đồng Bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ.
Trichoderma có khả năng phân hủy cellulose và phân giải lân chậm tan, vì vậy nó thường được trộn vào quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để tăng tốc độ phân hủy chất hữu cơ Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Trichoderma sp có khả năng đối kháng hiệu quả với nấm Phytophthora sp., góp phần bảo vệ cây trồng.
Nấm Trichoderma sp được nghiên cứu bởi Nguyễn Thị Lan Hương (2011) cho thấy có khả năng đối kháng hiệu quả với nấm Phytophthora sp trên cây tiêu, đồng thời có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm phòng trừ nấm bệnh.
Nghiên cứu của Dương Minh (2011) chỉ ra rằng nấm Trichoderma có khả năng kháng bệnh hiệu quả, đặc biệt trong việc kiểm soát nấm F solani và P nicotianea, nguyên nhân gây ra bệnh thối rễ và thối nõn trên cây khóm Điều này đặc biệt hiệu quả trong điều kiện đất ruộng có pH thấp tại tỉnh Tiền Giang.
Nghiên cứu của Trần Kim Loan, Lê Đình Đôn và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng chế phẩm Tricô-VTN có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora trên cây tiêu tại Tây Nguyên Nấm Trichoderma, đặc biệt là hai loài T virens và T asperellum, cho thấy hoạt tính sinh học mạnh mẽ và khả năng đối kháng cao với các nấm gây hại như P capsici và P palmivora, ảnh hưởng đến cây tiêu, ca cao và sầu riêng trong khu vực này.
Tháng 7/2012, một nhóm tác giả thuộc viện BVTV đã nghiên cứu khả năng đối kháng của nấm đối kháng Trichoderma Asperellum trong phòng trừ nấm
Phytophthora sp gây hại nghiêm trọng cho cây cao su Nghiên cứu đã phân lập được 18 nguồn Trichoderma sp., trong đó có 8 nguồn tiềm năng Đặc biệt, nguồn TrBC-CS 2 và TrBC-HT 8 thể hiện khả năng sinh chất kháng sinh mạnh mẽ, ức chế nấm Phytophthora với hiệu quả đạt từ 92,8% đến 93,4%.
Phytophthora Botryosa và 90,4-91,8% đối với nấm Phytophthora Citrophthora.
Các nguồn khác có khả năng ức chế nhưng với hiệu quả thấp hơn (70,3- 85,95) [3]
Mục tiêu đề tài
- Phân lập một số chủng nấm Phytophthora gây bệnh tiêu chết nhanh.
- Sàng lọc một số chủng nấm Trichoderma đối kháng với nấm Phytophthora.
Bài viết này giúp sinh viên làm quen với các phương pháp nghiên cứu vi sinh trong phòng thí nghiệm, đồng thời tìm hiểu ứng dụng của nấm Trichoderma trong việc kiểm soát nấm gây hại.
Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây tiêu.
CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1 Giới thiệu về cây hồ tiêu
Đặc điểm chung của cây hồ tiêu
Cây tiêu, hay còn gọi là Piper nigrum L., có nguồn gốc từ miền Tây Nam Ấn Độ và là một loại cây đặc trưng của vùng nhiệt đới Tại Việt Nam, hồ tiêu đã được trồng từ lâu ở Quảng Trị và Hà Tiên, sau đó lan rộng ra các khu vực Đông Nam Bộ và Tây Nguyên Hồ tiêu là cây trồng có yêu cầu cao về điều kiện sinh thái để phát triển, với nhiệt độ lý tưởng cho sự sinh trưởng dao động từ 20 độ C trở lên.
Nhiệt độ lý tưởng cho cây tiêu dao động từ 25°C, với nhiệt độ cao hơn 40°C và thấp hơn 10°C có thể gây hại cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Cây tiêu cần lượng mưa từ 2000-3000 mm/năm và độ ẩm không khí từ 75-90% Mặc dù cây tiêu ưa sáng, nhưng trong giai đoạn cây con, cần có sự che rợp để bảo vệ Cây tiêu có thể trồng trên nhiều loại đất, bao gồm đất hình thành từ đá basalt, đất phù sa, đất pha cát và đất cát xám.
Giá trị kinh tế của hồ tiêu
Trong những năm gần đây, Việt Nam đã trở thành nhà sản xuất và xuất khẩu hồ tiêu hàng đầu thế giới Xuất hiện từ thế kỷ XVII, hồ tiêu đã phát triển mạnh mẽ, khẳng định vị thế quan trọng trong ngành nông nghiệp không chỉ của Việt Nam mà còn toàn cầu Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2013, xuất khẩu hồ tiêu của cả nước đạt 134.000 tấn, với kim ngạch 899 triệu USD, tăng gần 15% về lượng và hơn 13% về giá trị so với năm 2012.
Việt Nam hiện đang dẫn đầu thế giới về xuất khẩu hồ tiêu, không chỉ về sản lượng mà còn về số lượng Vai trò của ngành hồ tiêu rất quan trọng trong việc điều tiết lưu thông hàng hóa, góp phần bình ổn giá cả và thị trường.
Đến đầu tháng 9 năm 2014, xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam đạt 136.000 tấn với giá trị 1,022 tỷ USD, khẳng định vai trò quan trọng của cây hồ tiêu trong nền kinh tế Nhiều hộ dân đã thoát nghèo và làm giàu từ cây hồ tiêu, với thu nhập hàng năm từ hàng chục triệu đến hàng trăm triệu đồng sau khi trừ chi phí sản xuất Tuy nhiên, sản lượng hồ tiêu gần đây giảm mạnh do dịch bệnh, ảnh hưởng đến đời sống người dân Tính đến cuối năm 2011, tổng diện tích trồng hồ tiêu cả nước đạt 52.171 ha, với Đông Nam Bộ, Tây Nguyên và Duyên Hải Miền Trung là những vùng trồng chủ yếu So với năm 2008, diện tích hồ tiêu đã tăng 1.820 ha, chủ yếu nhờ chuyển đổi từ các cây trồng kém hiệu quả.
Năm 2013, diện tích hồ tiêu tại Bình Dương đạt khoảng 320 ha, chủ yếu tập trung ở huyện Phú Giáo với 295 ha, Dầu Tiếng 23 ha, Bến Cát 2 ha và Thị xã Thủ Dầu Một 2,8 ha Sản lượng hồ tiêu ước tính đạt 803,84 tấn, đứng sau cao su và điều trong cơ cấu cây trồng.
Bệnh tiêu chết nhanh
Bệnh thối gốc rễ Phytophthora, hay còn gọi là bệnh chết nhanh, là một trong những dịch bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng hạt tiêu Dịch bệnh này thường gây chết hàng loạt cây hồ tiêu, dẫn đến mất trắng hoặc giảm đáng kể năng suất cây trồng.
Bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora sp thường xuất hiện trong mùa mưa, đặc biệt ở những vườn không thoát nước tốt Trong những năm mưa nhiều, bệnh có thể lây lan nhanh chóng và gây hại nặng, thậm chí thành dịch Ngược lại, trong những năm hạn hán kéo dài, cây có sức đề kháng kém, dễ bị nấm tấn công khi mưa đến Triệu chứng của bệnh bao gồm thối thân ngầm, thối rễ và thối các bộ phận trên mặt đất như thân, cành, lá, dẫn đến hiện tượng rụng hoa và quả bị đen Do bệnh diễn biến rất nhanh, biện pháp phòng ngừa là rất quan trọng.
Để phòng trừ bệnh cho cây tiêu, cần áp dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp, chú trọng vào canh tác và sinh học Lựa chọn đất trồng tiêu phải có tầng canh tác dày, thoát nước tốt và mực nước ngầm thấp, đồng thời tránh lấy giống từ những cây tiêu đã bị nhiễm bệnh Trong quá trình chăm sóc, cần cẩn thận để không gây vết thương cho thân ngầm và rễ cây Khi phát hiện cây bệnh, cần kiên quyết đào bỏ và thu dọn tàn dư để tiêu hủy, nhằm loại trừ nguồn bệnh Ngoài ra, sử dụng các chế phẩm sinh học cũng là một giải pháp hiệu quả.
Trichoderma để hạn chế sự phát triển của nấm Phytophthora Phòng trừ biện pháp hóa học như sử dụng một trong các loại thuốc sau Aliette 80 WP, Ridomil MZ 72
WP, Ridomil Gold 68 WP, Mexyl MZ 72 WP… [2]
Giới thiệu về nấm Phytophthora
Tên của giống nấm Phytophthora có nguồn gốc Hi Lạp ( Phyto có nghĩa là thực vật; phthora có nghĩa là vật phá hoại) Phytophthora là nhóm nấm thuộc lớp
Oomycetes, bộ Peronosporales, giống Phytophthora [10] Đặc điểm sợi nấm
Phytophthora là một loại nấm không màu, không vách ngăn và đơn bào, với kích thước không đồng nhất Khi túi bào tử ở trong nước, chúng có hình dạng giống quả trứng hoặc quả chanh, có thể có hoặc không có núm ở đầu, và có màu trong suốt Bào tử có hình cầu hoặc hình thận, sở hữu hai lông roi và di chuyển nhanh chóng trong nước Nhiệt độ lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm này dao động từ 25-30 độ C, với pH lý tưởng từ 6-7.
Bà Rịa-Vũng Tàu, sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PGA
Khi Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường phù hợp, khuẩn ty của nó phát triển nhanh chóng và tạo ra bào tử trực tiếp trên môi trường agar, khác với nhiều loài khác cần môi trường nước hoặc dung dịch pha loãng để tạo bào tử Sự hình thành bào tử của Phytophthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng, và trong môi trường ẩm ướt, nó sản sinh bào tử vô tính gọi là túi bào tử (sporangia) hoặc túi bào tử động (zoosporangia) Những túi bào tử này có khả năng nảy mầm trong nước hoặc khi nhiệt độ giảm.
Sau khi được phóng thích, bào tử động sẽ bơi lội trong một thời gian dài trước khi ngừng lại để cuộn tròn hoặc kết kén Qua thời gian, chúng hình thành vách tế bào Các bào tử có vách dày, gọi là chlamydospore, có thể có hình cầu hoặc hình trứng, và chúng có thể xuất hiện dưới dạng một đốt nằm giữa sợi nấm hoặc ở tận cùng của sợi nấm, đóng vai trò là cấu trúc nghỉ vô tính.
Hình 3 Bào tử vách dày của nấm Phytophthora.
Hình 4 Bào tử hình quả chanh trong nước của nấm
1.2.3 Khả năng gây bệnh của Phytophthora trên cây trồng.
Các loài Phytophthora tấn công các bộ phận khỏe mạnh của cây, bao gồm cả rễ, và có thể tồn tại mà không có dấu hiệu rõ ràng Theo nghiên cứu của Thanh, Ngô và Andre' Drenth (2004), bệnh Phytophthora đã được ghi nhận trên một số cây trồng chính tại Việt Nam.
Phytophthora là tác nhân gây hại nghiêm trọng cho nhiều loại cây trồng, bao gồm bệnh tàn lụi lá trên cà chua, khoai tây, khoai sọ; bệnh thối nõn trên dứa; cùng với các triệu chứng như thối rễ, loét thân, thối trái và rụng lá trên sầu riêng Nấm này thường phát triển mạnh mẽ trong điều kiện thời tiết thuận lợi, khi độ ẩm và lượng mưa cao, cùng với nhiệt độ ổn định, dẫn đến nguy cơ bùng phát dịch bệnh.
Quá trình xâm nhiễm của các loại nấm vào cây phụ thuộc vào từng loại cụ thể Bào tử trứng, bọc bào tử động và du động bào tử là những yếu tố chính trong việc xâm nhiễm các bộ phận khác nhau của cây Mưa có thể phân tán bào tử lên lá, từ đó khởi đầu quá trình xâm nhiễm tại thân, lá hoặc quả, tùy thuộc vào từng loài nấm.
Phytophthora là tác nhân gây ra nhiều dịch bệnh nghiêm trọng trên toàn cầu, nổi bật là bệnh mốc sương mai (hay tàn lụi muộn) trên cây khoai tây Bệnh này đã dẫn đến nạn đói lớn ở Châu Âu vào những năm 1840, do nấm P infestans gây ra.
Bệnh Phytophthora, đã được nghiên cứu kỹ lưỡng tại Châu Âu, là một vấn đề phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm Bệnh này gây ra nhiều nguy hiểm, dẫn đến mất mùa nghiêm trọng cho nhiều loại cây ăn quả.
Chi Phytophthora đã gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho nhiều loại cây trồng ở Việt Nam, làm giảm năng suất và mất thu nhập của nông dân Cụ thể, bệnh thối nõn dứa do P cinnamomi và P nicotianae gây ra đã làm mất đến 60% sản lượng Đối với cây ăn quả có múi như bưởi, P citrophthora tấn công thân và quả, gây bệnh chảy nhựa và thối quả, làm giảm năng suất tới 30% Ngoài ra, bệnh chết nhanh hại tiêu do Phytophthora có thể dẫn đến mất năng suất lên đến 70%.
Giới thiệu về Trichoderma
Trichoderma thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes [21] Năm 1801, Persoon ex Gray đã xác định Trichoderma thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp
Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma [17]
Trichoderma là loại nấm có hình dạng ống phấn phân nhánh, chứa chất nguyên sinh di động Khuẩn ty của chúng không màu, với cuống sinh bào tử phân nhánh và tạo thành khối tròn mang bào tử trần không có vách ngăn, liên kết thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy Bào tử Trichoderma có màu xanh hoặc xanh xám, với hình dạng cầu, elip hoặc thuôn Nhờ khả năng tạo ra chlamydospores, Trichoderma có thể tồn tại từ 110-130 ngày mà không cần dinh dưỡng Chlamydospores là cấu trúc dạng ngủ giúp Trichoderma sống sót trong môi trường khắc nghiệt, và chúng có thể được sử dụng để phát triển chế phẩm phòng trừ sinh học.
Hầu hết các loài Trichoderma không trải qua giai đoạn sinh sản hữu tính, mà thay vào đó, chúng sinh sản chủ yếu bằng bào tử đính từ khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty khí sinh không màu, với cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều và phát triển nhanh chóng trong môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 25 độ C.
30 0 C, thường không phát triển ở 35 0 C Khuẩn lạc không màu trong môi trường đường bột bắp hay trên môi trường giàu dinh dưỡng như PGA [14]
Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, thành phần hữu cơ và dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng trong sự hiện diện của các loài Trichoderma Những yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển và phân bố của chúng trong môi trường sống.
Các loài nấm Trichoderma có nhu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau, với dãy nhiệt độ phát triển rộng, từ dưới 0°C (T polysporum) đến 40°C (T koningii) Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Trichoderma thường nằm trong khoảng 25-30°C, mặc dù một số loài có thể phát triển ở 40°C Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến sự tăng trưởng mà còn tác động đến hoạt tính biến dưỡng, bao gồm sự tổng hợp kháng sinh bay hơi và enzyme Theo nghiên cứu của Prasun K M và Kanthadai R (1997), hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma cũng thay đổi theo nhiệt độ.
Ở nhiệt độ 35°C, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc rắn bất thường, với sự hình thành bào tử nhỏ và mép mở không bình thường Trong khi đó, ở 37°C, vi khuẩn không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.
Các loại nấm trong hệ gen Trichoderma phát triển tốt trong môi trường có độ pH acid, với mức pH tối ưu từ 3,5 đến 5,6, điều này giúp cải thiện sự nảy mầm của bào tử Một số loài thậm chí có khả năng phát triển ở pH 2,1 Ngoài ra, nồng độ CO2 trong môi trường nuôi trồng cũng đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng của nấm đối kháng trong đất.
Nồng độ pH của môi trường đất ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sản xuất của Trichoderma, trong đó hàm lượng CO2 trong đất đóng vai trò quan trọng Theo nghiên cứu của Papavizas (1985), pH đất có sự phụ thuộc mạnh mẽ vào nồng độ CO2.
CO2 trong đất phản ứng với H2O để tạo thành acid cacbonic, dẫn đến sự phân tách thành H + và HCO3 -, làm giảm pH của đất nhanh chóng (Killham, 1994) Nghiên cứu cho thấy các loài Trichoderma có khả năng phát triển trên môi trường có tính base yếu khi nồng độ CO2 cao Đặc biệt, nồng độ CO2 10% không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma.
Trichoderma là nhóm nấm ưa ẩm, thường phát triển mạnh mẽ ở những khu vực ẩm ướt như rừng Các loài T hamatum và T pseudokoningii nổi bật với khả năng chịu đựng điều kiện độ ẩm cao hơn so với các loài khác trong nhóm.
Trichoderma sp thường nhạy cảm với độ ẩm thấp, điều này ảnh hưởng đến sự phân bố và số lượng của chúng Yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm của các loài Trichoderma sp khác nhau, cho thấy sự đa dạng trong điều kiện sinh trưởng của chúng.
Hình 5 Khuẩn lạc một số chủng Trichoderma
1.3.3 Khả năng đối kháng của Trichoderma với nấm bệnh
Nhiều giống nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát hiệu quả các loài nấm gây bệnh thực vật khác nhau Tuy nhiên, một số giống lại tỏ ra hiệu quả hơn đối với những loại nấm bệnh cụ thể Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm Trichoderma có thể tiêu diệt nhiều loại nấm gây thối rễ, đặc biệt là Pythium.
Rhizoctonia, Phytophthora, Fusarium và Sclerotinia là những loại nấm gây ra các bệnh như khô vằn ở lúa, thối gốc chảy mủ ở cam quýt, và thối gốc trên nhiều loại cây trồng như tiêu, bắp và đậu nành Trichoderma có khả năng đối kháng với những nấm hại này thông qua việc cạnh tranh dinh dưỡng, ký sinh trên nấm gây hại, hoặc tiết ra các chất sinh học và enzyme như chitinase và β-1,3-glucanase, giúp phân hủy vách tế bào của nấm gây bệnh.
Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào nhiều cơ chế khác nhau, chúng ta có thể khái quát thành 3 cơ chế chính sau:
- Kháng sinh: Chúng tạo ra chất có hoạt tính tương tự như "thuốc kháng sinh" có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng các tác nhân gây bệnh.
Trichoderma cạnh tranh với các sinh vật gây bệnh bằng cách chiếm lĩnh nguồn tài nguyên như dinh dưỡng và không gian sống, giúp ngăn chặn sự phát triển của các tác nhân gây hại trước khi chúng xuất hiện.
Ký sinh là quá trình tiêu diệt các loài gây bệnh thông qua việc xâm nhập vào bên trong loài nấm gây hại hoặc tiết ra các enzyme để phân hủy chúng.
Dưới kính hiển vi, nấm Trichoderma thể hiện hiện tượng ký sinh rõ rệt, khi tiếp xúc với nấm bệnh, Trichoderma khiến nấm bệnh teo lại và chết Ngược lại, những khu vực không có sự tiếp xúc với nấm Trichoderma vẫn duy trì tình trạng bình thường.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2 Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu tiêu bệnh chết nhanh dùng để phân lập nấm Phytophthora sp được thu nhận tại các vườn tiêu ở Bình Dương, Bình Phước, Bà Rịa-Vũng Tàu.
Nấm Trichoderma sp do PTN Sinh học trường Đại học Thủ Dầu Một cung cấp.
Phạm vi nghiên cứu
Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma từ PTN trường Đại học Thủ Dầu Một với nấm Phytophthora sp đã được phân lập, nhằm tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh mẽ.
Môi trường dùng trong nghiên cứu
Nước cất vừa đủ 1 lít
Nước cất vừa đủ 1 lít
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp phân lập nấm bệnh Phytophthora [12 ] Đất được chuẩn bị (khoảng 50g đất có khả năng chứa nấm bệnh được bóp vỡ vụn, rồi cho vào một cốc thủy tinh) Sau đó thêm vào 100ml nước cất và để đất lắng xuống; cho vào trên bề mặt nước cốc một lá tiêu bánh tẻ (lá trưởng thành, không quá già) giống tiêu Vĩnh Linh (giống nhiễm bệnh), cốc để trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm khoảng 25–30 0 C và dưới điều kiện ánh sáng tán xạ. Chú ý lá tiêu phải được giữ nổi trên mặt nước trong suốt thời gian bẫy Quan sát vết bệnh phát triển trên lá tiêu sau 2–5 ngày Mô bệnh trên lá được cắt thành từng miếng nhỏ (kích thước khoảng 0,5cm 2 ) và cho vào đĩa petri có chứa môi trường PGA và môi trường WA Ủ ở nhiệt độ phòng cho đến khi tơ nấm phát triển Làm thuần trên môi trường PGA Chọn lọc các chủng có đặc điểm tơ nấm và bào tử giống Phytophthora.
2.3.2 Phương pháp kích thích bào tử nang các chủng Phytophthora sp [8]
Chuẩn bị các đĩa petri trung gian chứa nấm bệnh:
Cấy nấm Phytophthora sp vào đĩa petri với hai môi trường PGA và CA đã chuẩn bị sẵn, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng cho đến khi nấm phát triển đầy đĩa.
Cắt một miếng thạch 1×1 cm từ môi trường PGA và CA, sau đó cho vào đĩa petri và đổ nước cất ngập mặt thạch Tiến hành sốc ở nhiệt độ 40°C trong 10 phút Mỗi loại môi trường thực hiện 3 nghiệm thức và quan sát ở hai điều kiện: ngoài sáng và trong tối trong khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ, và 72 giờ.
2.3.3 Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng của Trichoderma và nấm bệnh.
Chuẩn bị các đĩa petri trung gian chứa nấm Trichoderma và nấm bệnh:
Cấy các chủng Trichoderma và nấm bệnh vào đĩa petri chứa môi trường PGA đã được hấp khử trùng, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng cho đến khi chúng phát triển đầy đĩa.
Tiến hành khảo sát khả năng đối kháng:
Cắt những miếng thạch có kích thước bằng nhau có chứa nấm bệnh và
Trichoderma sp được nuôi cấy trên các đĩa petri trung gian, nơi mà hai khối thạch vừa cắt được đặt lên đĩa petri chứa môi trường PGA để thực hiện quá trình đối kháng Các khối thạch được đặt cách mép đĩa khoảng 1cm và phải được sắp xếp đối xứng qua tâm của đĩa.
Cách xác định hiệu quả đối kháng của Trichoderma đối với nấm bệnh.
Công thức tính hiệu quả ức chế:
Dđc: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng (cm).
Dtt: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa thủ thật (cm).
2.3.4 Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng bằng dịch chiết của
Cấy các chủng Trichoderma T13, T14 và T15 vào bình tam giác chứa môi trường nước khoai tây không agar, sau đó cho vào máy lắc trong 7 ngày Tiếp theo, sử dụng máy ly tâm để lọc sạch tơ nấm và thu được dịch chiết Đồng thời, cấy các chủng Phytophthora vào đĩa petri với môi trường PGA đã được hấp khử trùng và ủ ở nhiệt độ phòng cho đến khi chúng mọc đầy đĩa.
Cắt những miếng thạch đồng nhất chứa nấm Phytophthora và đặt vào 36 đĩa petri đã khử trùng, mỗi đĩa 4 miếng Sau đó, cho nước cất ngập ngang mặt thạch ở đĩa đối chứng Tiếp theo, sử dụng một nửa dịch chiết từ các chủng Trichoderma T13 và T14.
Trichoderma T15 được pha loãng và sau đó dịch chiết của từng chủng được cho vào các đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn, bao gồm 5 đĩa loãng và 5 đĩa nguyên cho mỗi chủng Các đĩa này sau đó được đặt trong môi trường tối Sau 7 ngày, tiến hành quan sát sự phát triển của bào tử.
Phân lập nấm bệnh Phytophthora
Chúng tôi đã áp dụng phương pháp bẫy lá tiêu để phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây tiêu từ các mẫu tiêu bệnh ở Bà Rịa-Vũng Tàu, Bình Dương và Bình Phước Kết quả nghiên cứu cho thấy chúng tôi đã thu được một chủng nấm bệnh tại Bà Rịa-Vũng Tàu.
Chúng tôi đã phân lập được một chủng nấm Phytophthora từ mẫu tiêu bệnh ở Bà Rịa-Vũng Tàu Nấm bệnh này có đặc điểm là tơ màu trắng, hình dạng gồ ghề và viền không đều.
Trên môi trường PGA chủng phát triển nhanh, đạt khoảng 4,3-4,7cm sau 3 ngày nuôi cấy.
Nấm Phytophthora trên môi trường thạch đĩa có sợi tơ dai, không màu, kích thước không đều, chủ yếu không có vách và ít phân nhánh Bào tử của nấm này có hình dạng túi giống quả chanh hoặc hình cầu, với bào tử hậu có vách dày Khi gặp điều kiện thuận lợi, các bào tử này sẽ phát triển thành cơ thể nấm mới Trên môi trường nước, túi bào tử cũng có hình quả chanh, có thể có núm hoặc không, và trong điều kiện tối, túi bào tử hình thành sau khoảng 3 ngày Tơ nấm trong môi trường nước cũng không màu, kích thước không đều, không có vách và ít phân nhánh.
Hiệu quả đối kháng của Trichoderma và Phytophthora
3.2.1 Đối kháng trên môi trường thạch đĩa
Chuẩn bị các đĩa petri trung gian chứa nấm Trichoderma và nấm bệnh:
Cấy các chủng Trichoderma và nấm bệnh vào đĩa petri chứa môi trường PGA đã được hấp khử trùng, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp để chúng phát triển đầy đĩa.
Tiến hành khảo sát khả năng đối kháng:
Cắt những miếng thạch có kích thước bằng nhau có chứa nấm bệnh và
Trichoderma sp được nuôi cấy trên các đĩa petri trung gian bằng cách đặt hai khối thạch đã cắt lên đĩa petri chứa môi trường PGA để tiến hành quá trình đối kháng Các khối thạch cần được đặt cách mép đĩa khoảng 1cm và phải đối xứng qua tâm đĩa để đảm bảo hiệu quả thí nghiệm.
Bảng 1: Hiệu quả đối kháng của Trichoderma và Phytophthora.
Biểu đồ 1: Hiệu quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma sp đối với nấm
Trong quá trình làm đề tài, chúng tôi đã sử dụng 10 chủng nấm
Trichoderma có khả năng đối kháng hiệu quả với nấm Phytophthora Tất cả các chủng Trichoderma đều cho thấy tốc độ và khả năng đối kháng tốt Sau 3 ngày, khả năng chống lại nấm Phytophthora của các chủng này được ghi nhận rõ rệt.
Trichoderma có khả năng đối kháng với Phytophthora ở mức tương đối thấp, dao động từ 35,5% đến 56,7% Đặc biệt, các chủng Trichoderma T9, T7.2 và T8.1 cho thấy khả năng kháng bệnh cao hơn, đạt từ 60,7% đến 76,3% Tuy nhiên, sau 5 ngày, khả năng đối kháng của các chủng này cần được đánh giá lại.
Trichoderma T7.2 và Trichoderma T9 cho thấy sự giảm hiệu quả, trong khi các chủng Trichoderma T13, T14 và T15 lại tăng cường khả năng đối kháng, đạt từ 81,3% đến 84,5% Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương (2011), cho thấy khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma sp với nấm Phytophthora sp.
Trichoderma sp nghiên cứu đều đối kháng tốt với nấm bệnh sau 4 ngày Do đó, chúng tôi chọn các chủng Trichoderma này để làm các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Đối kháng trên môi trường lỏng
Từ các chủng Trichoderma đã chọn ở các thí nghiệm trước, cấy vào môi trường lỏng thu được dịch chiết, cho vào đĩa petri đã chứa nấm Phytophthora Sau
7 ngày, chúng tôi quan sát sự hình thành bào tử Phytophthora Kết quả thí nghiệm được thể hiện thông qua bảng 2:
Bảng 2: Hiệu quả đối kháng dịch chiết Trichoderma đối với Phytophthora
Khả năng hình thành bào tử
Bào tử vách dày Túi bào tử a Trichoderma T11 b Trichoderma T14. c Trichoderma T8.1 d Trichoderma T8.2. e Trichoderma T9 f Trichoderma T10. g Trichoderma T12. g
(bào tử hậu) Đối chứng + +
Ghi chú: +: có xuất hiện bào tử.
++: xuất hiện nhiều bào tử.
-: không xuất hiện bào tử. a b c d
Qua thí nghiệm, dịch chiết từ các chủng Trichoderma cho thấy khả năng ức chế sự hình thành bào tử của chủng Phytophthora với mức độ khác nhau Cụ thể, chủng Trichoderma T13 không ức chế sự hình thành bào tử túi và bào tử hậu, dẫn đến việc Phytophthora tạo ra nhiều bào tử hơn so với đĩa đối chứng ở cả nồng độ 100% và 50% Nguyên nhân có thể do T13 không có khả năng ức chế và môi trường dịch chiết giàu dinh dưỡng hơn nước Trong khi đó, chủng Trichoderma T14 có khả năng ức chế hình thành bào tử túi ở nồng độ dịch chiết 100%, nhưng không ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử hậu.
Trichoderma T15 có khả năng ức chế mạnh mẽ sự hình thành bào tử túi và bào tử hậu, đặc biệt ở nồng độ dịch chiết 50%.
Chủng Trichoderma T15 cho thấy tiềm năng đối kháng mạnh mẽ, có khả năng ức chế sự hình thành bào tử túi và bào tử hậu của Phytophthora Do đó, việc nghiên cứu sâu hơn về chủng này là cần thiết để ứng dụng hiệu quả trong thực tiễn.
Hình 7 minh họa khả năng đối kháng của dịch chiết Trichoderma đối với Phytophthora Trong đó, hình a và b là đối chứng với Phytophthora Hình c cho thấy Phytophthora tạo bào tử hậu trên môi trường chứa dịch chiết Trichoderma T13, trong khi hình d ghi nhận sự hình thành bào tử túi của Phytophthora trên cùng môi trường Hình e thể hiện Phytophthora tạo bào tử hậu trong môi trường dịch chiết Trichoderma T14, và hình f chỉ ra rằng Phytophthora không tạo bào tử khi được nuôi trong môi trường chứa dịch chiết Trichoderma T15.