Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
3.1.1 Giám sát để tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới
- Sàng lọc virus cúm A từ các mẫu thu thập được trên gà, ngan/vịt và chim cút;
- Xác định subtybe H5 từ các mẫu dương tính với cúm A;
- Xác định subtybe H5N1 và H5N6 từ các mẫu dương tính với cúm A/H5;
- Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới theo loài (gà, ngan/vịt và chim cút);
- Phân loại virus cúm A/H5 biến chủng mới thu thập được trên gà, ngan/vịt và chim cút;
- Nghiên cứu nguồn gốc phát sinh của virus cúm A/H5 biến chủng mới thu thập được trên gà, ngan/vịt và chim cút;
- Nghiên cứu sự xuất hiện của virus cúm A/H5 biến chủng mới theo thời gian và không gian
3.1.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới
- Xác định đặc điểm phân tử gen HA của virus cúm A/H5 biến chủng mới;
- Xác định chỉ số độc lực của virus cúm A/H5 biến chủng mới;
- Xác định các triệu chứng bệnh tích do virus cúm A/H5 biến chủng mới gây ra trên gà
3.1.3 Nghiên cứu khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của các loại vacxin
- Đánh giá hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1c trên gà;
- Đánh giá hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4a trên gà và vịt;
- Đánh giá hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4b trên gà và vịt.
Nguyên liệu nghiên cứu
Bảo hộ lao động và các vật phẩm y tế như bông cồn sát trùng, tăm bông vô trùng, ống đựng dung dịch bảo quản mẫu, khay inok, thùng bảo quản mẫu, đá khô, nhãn dán mẫu, phiếu ghi thông tin mẫu, túi đựng mẫu, thuốc sát trùng, và găng tay là những yếu tố quan trọng trong việc đảm bảo an toàn và hiệu quả trong quy trình làm việc.
3.2.2 Hóa chất lấy mẫu a Môi trường bảo quản và vận chuyển mẫu
- Môi trường PBS - Glycerol - Dung dịch đệm phốt phát (PBS)
- Hấp vô trùng PBS sau đó trộn với một lượng tương đương PBS và glycerol vô trùng Bổ sung kháng sinh vào 1 lít dung môi PBS/Glycerol
- Điều chỉnh pH = 7,4 rồi lấy 4ml vào 1 ống nghiệm 15ml, bảo quản ở 4 0 C b Dụng cụ, hóa chất cho xét nghiệm mẫu bệnh phẩm
- Cabinet Class 2, tủ lạnh, máy Real time PCR: Biorad IQ5; máy spin, máy vortex, máy ly tâm lạnh;
- Micropipettes (1 kênh và 8 kênh) và đầu típ phù hợp;
- Ống Eppendoff 0,5 ml; 1,5 ml không chứa ARNse Máy đọc kết quả RT- PCR Cerpheid, Biorad IQ5, ABI 7500;
- Nước tinh khiết (Distilled Water);
- Bộ kít chiết tách RNeasy Mini kit - Cat Qiagen No 74106 do hãng Qiagen của Đức sản xuất;
- Bộ kít One-Step RT-PCR Qiagen® (Cat No.210210) hoặc Invitrogen One-step RT-PCR (Cat No.11732-020);
- Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe) để phát hiện virus
3.2.3 Vacxin và động vật thí nghiệm
+ Vacxin Navet-vifluvac (clade 1) do Công ty NAVETCO sản xuất và cung cấp: số lô 27, NSX 03/01/2018, HSD 02/01/2019
+ Vacxin Re-5 (clade 2.3.4) do Trung Quốc sản xuất, Công ty RTD cung cấp: số lô 2015009, NSX 09/02/2018, HSD 08/02/2019
Gà Lương Phượng và vịt bầu cánh trắng được lựa chọn từ đàn khỏe mạnh, không nhiễm virus cúm type A, đã được kiểm tra bằng phương pháp Real time RT-PCR Cả hai loại động vật này chưa được tiêm phòng vacxin CGC và không có kháng thể cúm H5, được xác định qua kiểm tra mẫu huyết thanh bằng phương pháp HI.
Phương pháp nghiên cứu
Đề tài áp dụng nhiều phương pháp nghiên cứu đa dạng, bao gồm các phương pháp cổ điển như phân lập virus, nuôi cấy virus trên trứng và công cường độc cho gia cầm, cùng với các kỹ thuật sinh học phân tử như Realtime RT-PCR và sequencing, cũng như các phương pháp miễn dịch học như ELISA và HI, nhằm thực hiện các nội dung nghiên cứu đã được xác định.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thu thập mẫu dịch hầu họng từ gia cầm như gà, ngan/vịt tại các chợ buôn bán gia cầm sống và chim cút nuôi tại 11 tỉnh giám sát Các tỉnh được chọn có diện tích rộng, số lượng gia cầm nuôi và buôn bán lớn, có dịch CGC trong 3 năm gần đây và không nằm trong địa bàn của chương trình giám sát quốc gia, bao gồm 9/11 tỉnh như Đồng Tháp, Vĩnh Long, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Kon Tum, Hà Nội, Thái Nguyên và Phú Thọ Tại mỗi tỉnh, mẫu được lấy từ 3 chợ thuộc các huyện khác nhau, với số lượng gia cầm buôn bán lớn, mỗi chợ thu thập 30 mẫu gia cầm/tháng trong 24 tháng Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành lấy mẫu hàng tháng tại 5 hộ chăn nuôi chim cút, mỗi hộ cung cấp 10 mẫu/tháng.
Trong vòng 24 tháng, chúng tôi đã thu thập mẫu từ đàn gia cầm, bao gồm gà, ngan/vịt và chim cút, tại 2 trong số 11 tỉnh, cụ thể là Kiên Giang, nhằm có cái nhìn toàn diện hơn về tình hình sức khỏe và dịch bệnh trong ngành chăn nuôi.
Nghệ An) thông qua công tác chẩn đoán xét nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương và các Cơ quan Thú y vùng giai đoạn 2015- 2018 (bảng 3.1)
Bảng 3.1 Cơ cấu thu thập mẫu của đề tài
TT Đối tượng lấy mẫu
2 Chim cút tại các hộ chăn nuôi 10 5 24 9 10.800
3 Gà, ngan/vịt, chim cút 150 2015-2018 2 300
Sau khi thu thập, các mẫu sẽ được bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2-8 oC và được vận chuyển đến Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương để thực hiện xét nghiệm sàng lọc virus cúm type A bằng phương pháp rRT-PCR theo tiêu chuẩn TCVN 8400-26:2014 của Việt Nam.
+ Phương pháp lấy mẫu dịch hầu họng
Sử dụng tăm bông vô trùng để lấy mẫu niêm mạc hầu họng của gà, vịt, và chim cút bằng cách ngoáy nhẹ nhàng, sau đó cho tăm bông vào ống nghiệm chứa dung dịch bảo quản Mẫu cần được bảo quản lạnh và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 48 giờ kể từ khi lấy mẫu.
Mẫu cần được bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong 1-2 ngày Nếu chưa được kiểm tra, mẫu phải được lưu trữ ở tủ âm -20°C và chuyển đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt Mỗi mẫu đi kèm với phiếu ghi bệnh phẩm.
+ Phương pháp lấy mẫu máu
Sử dụng kim tiêm vô trùng để lấy 3 - 5 ml máu tĩnh mạch từ cánh của gà, vịt và chim cút, sau đó chuyển vào ống chứa và để đông lạnh, bảo quản ở 4°C trong 24 giờ Huyết thanh sẽ được tách chiết theo quy trình sau.
- Đóng chặt ống chứa máu, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút Huyết thanh và tế bào máu sẽ được phân tách trong ống;
- Dùng pipet vô trùng, nhẹ nhàng hút huyết thanh ở phần trên của ống chuyển sang ống sạch, bảo quản ở 4 0 C
+ Phương pháp mổ khám, lấy mẫu nội tạng gia cầm
Mổ khám gia cầm là quy trình nhằm xác định sự biến đổi đại thể trong các cơ quan của gia cầm mắc bệnh CGC Trong quá trình này, gia cầm được cắt tiết, sau đó các cơ quan nội tạng như phổi, hạch, tim, gan, lách và thận được bộc lộ và tách ra khỏi cơ thể để thu mẫu phục vụ cho các nghiên cứu khác nhau.
3.3.2 Phản ứng Realtime RT-PCR để sàng lọc, phát hiện virus cúm A/H5Nx
Phản ứng Realtime RT-PCR là phương pháp được áp dụng để phát hiện virus cúm type A Các mẫu dương tính với virus này sẽ được kiểm tra tiếp để xác định subtype H5 Nếu mẫu dương tính với H5, chúng sẽ tiếp tục được kiểm tra với các subtype N1 và N6 thông qua các cặp mồi tương ứng.
3.3.2.1 Phương pháp tách chiết ARN
Các mẫu dịch hầu họng trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và tách chiết ARN bằng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #
74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất (phụ lục 1)
3.3.2.2 Phương pháp Realtime RT-PCR xác định virus cúm A/H5N1 và A/H5N6
Phản ứng Realtime RT-PCR (rRT-PCR) được thực hiện với các cặp mồi và probe chuyên biệt cho virus cúm A/H5N1 và A/H5N6, theo quy trình chẩn đoán TCVN 8400-26:2014 (phụ lục 2).
Bảng 3.2 Danh mục primer và probe để xác định virus cúm A/H5N1 và A/H5N6
Primer/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1
Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA
Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1
Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G
Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC
Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1
Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT
Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C
Probe CCA ATA ACA GGA GGG AGCCCAGACCC FAM BHQ1
Xuôi CCC CAC CAA TGG GAA CTG
Ngược TCT AGG AAT GCA AAC CCT TTT ACC
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T
Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì
3.3.2.3 Phương pháp RT-PCR định type, subtype virus cúm gia cầm
Phương pháp RT-PCR được áp dụng để xác định typ H5N1 hoặc H5N6 khi phương pháp rRT-PCR không cho kết quả rõ ràng ARN từ các mẫu huyết thanh hoặc dịch hầu họng được chiết xuất bằng bộ Rneasy Mini Kit (250) QIAGEN Cat 74106 theo hướng dẫn Để thực hiện phương pháp RT-PCR xác định typ cúm A (gen M), subtype H5 và subtype NA, sử dụng kít SuperScript III Platinum One-Step RT-PCR, Invitrogen 12574-026 cùng với các cặp mồi đặc hiệu cho gen M, H5, N1 (theo Fouchier & cs., 2000; Tsukamoto & cs., 2008) và N6 (theo Tsukamoto & cs., 2009) Các cặp mồi phát hiện gen M, H5, N1 và N6 được liệt kê trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Danh mục các cặp mồi phát hiện gen M, H5, N1 và N6
Kích thước Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)
Mã ký hiệu những bazơ nitric hỗn hợp: B, C/G/T; D, A/G/T; K, G/T; M, A/C; R, A/G; V, A/C/G; W,
3.3.2.4 Phương pháp giải trình tự gen và phân tích phả hệ
Giải trình tự gen được thực hiện trên các mẫu virus H5 dương tính, tập trung vào việc khuyếch đại gen HA, bao gồm các đoạn gen HA1 và HA2 bằng kit Platium PCR Supermix của Invitrogen Hai cặp mồi đặc hiệu cho gen HA1 và HA2 được sử dụng để đảm bảo độ chính xác trong quá trình khuyếch đại Tất cả các mồi xuôi và ngược đều được gắn với đoạn trình tự M13, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc giải trình tự gen.
Bảng 3.4 Danh mục trình tự mồi giải trình tự gen HA1 và HA2
Cặp mồi Tên Trình tự mồi
S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA
AGC AGG GGT YTA AT S18_H5-1111R CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC
AAC CAT CTA YCA TTC C
S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT
AYA ARA TTG TCA AG
CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA
ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT
Tại Macrogen, Inc (Seoul, Hàn Quốc), các phản ứng giải trình tự theo hai chiều (xuôi và ngược) đã được thực hiện Các trình tự gen HA1 và HA2 được kết hợp trong phần mềm Bioedit phiên bản 7.2.5 để tạo thành các trình tự gen HA hoàn chỉnh, với độ dài khoảng 1700 bp.
Cây phả hệ gen H5 của các virus trong nghiên cứu này được so sánh với các virus tham chiếu từ ngân hàng gen như GenBank và GISAID, cùng với dữ liệu từ Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương (NCVD), nhằm phân tích thông qua phần mềm MEGA.
Phương pháp Neighbor-Joining và mô hình Kimura 2-parameter được sử dụng để phân tích phả hệ, với độ tin cậy được kiểm tra qua phân tích bootstrap 1000 lần lặp lại Các nhánh phả hệ có giá trị bootstrap ≥ 95 được coi là đáng tin cậy Độ tương đồng nucleotide giữa các gen được tính toán bằng công cụ Sequence identity matrix trong phần mềm Bioedit.
3.3.2.5 Phương pháp phân loại clade
Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SAS 9.0 (2002), xác định các giá trị như dung lượng mẫu (n) và tỷ lệ nhiễm (tỷ lệ dương tính) Tỷ lệ nhiễm được đánh giá thông qua phép thử Khi bình phương cho dung lượng mẫu lớn và phép thử chính xác của Fisher cho dung lượng mẫu nhỏ, sử dụng thủ tục FREQ của SAS So sánh cặp đôi giữa các tỷ lệ nhiễm dựa trên chênh lệch tỷ lệ và sai số chuẩn của sự khác biệt.
Dữ liệu về điểm lâm sàng và giá trị Ct đã được phân tích bằng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố, sử dụng phép thử Kruskal-Wallis thông qua thủ tục NPAR1WAY trong phần mềm SAS.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Giám sát để tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới
4.1.1 Kết quả thu thập mẫu và sàng lọc virus cúm A
Sau khi hoàn thành lấy mẫu xét nghiệm trên 6649 gà, 12991 ngan/vịt và
10900 chim cút Mẫu được thu thập và sàng lọc virus cúm A Kết quả xét nghiệm được thể hiện ở phụ lục 5, biểu diễn qua hình 4.1 và hình 4.2
Hình 4.1 Kết quả sàng lọc virus cúm A tại các tỉnh giám sát
Virus cúm A được phát hiện ở tất cả 11 tỉnh nghiên cứu, tỷ lệ nhiễm virus cúm
Theo thống kê, Nghệ An có tỷ lệ cao nhất với 34,67%, tiếp theo là Kiên Giang 32,67% và Kon Tum 27,17% Các tỉnh khác bao gồm Vĩnh Long (10,68%), Quảng Ngãi (9,11%), Đồng Tháp (8,15%), Hà Nội (7,26%), Quảng Nam (7,23%), Thừa Thiên Huế (4,64%), Phú Thọ (4,55%), trong khi Thái Nguyên có tỷ lệ thấp nhất chỉ 1,34%.
Trong tổng số 30.540 mẫu thu được từ 11 tỉnh, có 2.794 mẫu dương tính với virus cúm A, chiếm tỷ lệ 9,15% Kết quả này thấp hơn so với giám sát tại 14 tỉnh của Cục Thú y trong giai đoạn 2011-2013, khi tỷ lệ gia cầm dương tính với virus cúm A đạt 22,1% (2162/9790 mẫu dương tính) (Nguyen & cs., 2014).
Theo kết quả so sánh tỷ lệ phát hiện virus cúm A theo các miền, miền Trung có tỷ lệ nhiễm cao nhất với 12,29%, tương ứng với 1.670 mẫu dương tính trong tổng số 13.590 mẫu xét nghiệm Miền Nam đứng thứ hai với 9,93%, ghi nhận 682 mẫu dương tính trong 6.870 mẫu Trong khi đó, miền Bắc có tỷ lệ thấp nhất, chỉ đạt 4,38% với ba tỉnh được khảo sát.
Hình 4.2 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A theo giai đoạn và khu vực giám sát
Trong nghiên cứu, mẫu được thu thập qua ba giai đoạn: từ tháng 1/2015 đến tháng 6/2016 (giai đoạn 1), từ tháng 7/2016 đến tháng 6/2017 (giai đoạn 2), và từ tháng 7/2017 đến tháng 3/2018 (giai đoạn 3) Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm virus cúm A cao nhất là ở giai đoạn 1 với 12,78% (786 mẫu dương tính trong tổng số 6148 mẫu kiểm tra), tiếp theo là giai đoạn 3 với 9,94% Giai đoạn 2 ghi nhận tỷ lệ nhiễm thấp nhất, chỉ 7,16%.
Kết quả xét nghiệm cho thấy gia cầm khỏe mạnh tại các chợ buôn bán gia cầm sống có thể mang virus CGC ở đường hô hấp mặc dù không có triệu chứng lâm sàng (9,15%) Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đó, cho thấy vịt là vật mang virus CGC, thường xuyên bài thải mầm bệnh ra môi trường, tạo nguồn lây nhiễm cho động vật cảm thụ khác Thủy cầm, đặc biệt là vịt, là bể chứa tự nhiên của virus CGC type A, có khả năng truyền virus cho gia cầm và động vật có vú khác, bao gồm cả con người, dẫn đến các đợt bùng phát dịch bệnh nghiêm trọng Do đó, chợ buôn bán gia cầm sống được xác định là một nguồn lây lan quan trọng của bệnh CGC, với đặc điểm tập trung nhiều loại gia cầm từ nhiều nguồn khác nhau, góp phần vào quá trình nhân lên, duy trì và lan truyền virus CGC.
Việc tiếp tục giám sát virus CGC tại các chợ buôn bán gia cầm sống là cần thiết để hiểu rõ hơn về sự phân bố của virus này và áp dụng các biện pháp phù hợp nhằm giảm thiểu nguy cơ cho sức khỏe cộng đồng.
Để giảm thiểu nguy cơ lây lan bệnh cúm từ các chợ gia cầm, nhiều biện pháp đã được áp dụng như đóng cửa tạm thời, tăng cường vệ sinh và khử trùng, giảm số lượng gia cầm buôn bán theo quý, cũng như cấm lưu giữ gia cầm qua đêm tại chợ Những biện pháp này đã chứng minh hiệu quả trong việc giảm sự lưu hành virus cúm tại các chợ.
4.1.2 Kết quả xác định subtype H5 từ các mẫu dương tính với virus cúm A
Các mẫu dương tính với virus cúm A đang được xác định subtype H5 thông qua phương pháp rRT-PCR, với kết quả được trình bày trong phụ lục 6 và minh họa qua hình 4.3 và hình 4.4.
Hình 4.3 Kết quả sàng lọc virus cúm A/H5 tại các tỉnh giám sát
Trong số 11 tỉnh được khảo sát, có 8 tỉnh phát hiện mẫu dương tính với virus cúm A/H5, bao gồm Hà Nội, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Kon Tum, Đồng Tháp, Vĩnh Long và Kiên Giang Tỉnh có tỷ lệ dương tính cao nhất là Kon Tum với 4,32%, tiếp theo là Vĩnh Long với 3,33% và Nghệ An với 2,67%.
2 %, Quảng Nam 1,73%, Quảng Ngãi 0,42%, Đồng Tháp 0,39% Có 3/11 tỉnh không có mẫu dương tính với virus cúm A/H5 là Thừa Thiên Huế, Thái Nguyên và Phú Thọ (hình 4.3)
Trong tổng số 30.540 mẫu xét nghiệm, có 350 mẫu dương tính với virus cúm A/H5, chiếm tỷ lệ 1,15% Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 ở các tỉnh miền Trung và miền Nam gần tương đương, lần lượt là 1,63% và 1,86%, trong khi miền Bắc chỉ có tỷ lệ rất thấp, chỉ 0,01%.
Hình 4.4 Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 theo giai đoạn và khu vực giám sát
Trong giai đoạn 1 (từ tháng 1 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016), tỷ lệ mẫu dương tính với virus cúm A đạt 2,11%, cao hơn tỷ lệ 1% của giai đoạn 3 (từ tháng 7 năm 2017 đến tháng 3 năm 2018) Giai đoạn 2 (từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017) ghi nhận tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 thấp nhất, chỉ đạt 0,87%.
Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 trong nghiên cứu này thấp hơn so với các kết quả giám sát hàng năm của Cục Thú y trước đây Từ năm 2007 đến 2009, đã có 5 đợt giám sát virus CGC trên đàn vịt, thu thập tổng cộng 2571 mẫu thủy cầm, trong đó có 151 mẫu dương tính với virus cúm A/H5, chiếm tỷ lệ 5,87% (Phan & cs., 2013).
Chương trình giám sát bệnh CGC từ năm 2011 đến 2013 tại 14/63 tỉnh thành phố đã kiểm tra 9790 mẫu, trong đó phát hiện 531 mẫu dương tính với virus cúm A/H5, tương đương 5,4%.
Nghiên cứu về subtype H5 cho thấy có 350 mẫu dương tính với virus cúm A/H5 trong tổng số 2794 mẫu dương tính cúm A, chiếm tỷ lệ 12,53% Điều này cho thấy bên cạnh virus cúm A/H5, còn tồn tại nhiều subtype khác của virus cúm A.
Hx khác cũng đang lưu hành trong đàn gia cầm
Nghiên cứu của Theo Chu và cộng sự (2016) tại tỉnh Thừa Thiên Huế cho thấy sự đa dạng của các subtype virus cúm A trong đàn gia cầm và môi trường tại các chợ gia cầm sống, với 178 mẫu virus được phân lập, bao gồm các subtype H3 (19), H4 (2), H5 (8), H6 (30), H9 (114) và H11 (5) Cụ thể, các subtype H3N2 (18), H3N6 (1), H4N6 (2), H6N2 (14), H6N6 (16), H9N2 (109), H9N6 (5), H11N6 (1) và H11N7 (4) đã được ghi nhận Do đó, cần tăng cường công tác tiêu độc khử trùng và nghiên cứu xác định rõ các chủng virus cúm A/H5 để có biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, đồng thời tạo cơ sở cho việc sản xuất vacxin và tiếp tục giám sát virus.
4.1.3 Kết quả xác định subtype H5N1 từ mẫu dương tính với virus cúm A/H5
Một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới
4.2.1 Đặc tính sinh học phân tử tiểu phần HA1 của các biến chủng
4.2.1.1 Đặc điểm trình tự amino acid ở gần vị trí cắt protein HA
HA là protein bề mặt của virus cúm, có vai trò thiết yếu trong việc gắn kết với màng tế bào, khởi đầu quá trình lây nhiễm Phân tích trình tự amino acid gần vị trí cắt được thể hiện trong hình 4.16.
Ghi chú: Đặc tính của mỗi amino acid được thể hiện qua các màu sắc khác nhau: màu đen cho kỵ nước, màu đỏ cho có tính axit, màu xanh dương cho kiềm tính, màu tím cho trung tính và màu xanh lá cây cho phân cực Mũi tên chỉ vị trí cắt giữa hai tiểu phần HA1 và HA2 Các chữ số bên phải trình tự thể hiện số mẫu tương ứng với tổng số trình tự của mỗi clade.
Hình 4.16 Trình tự amino acid gần vị trí cắt của protein HA
Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra mối liên hệ giữa trình tự amino acid gần vị trí cắt và độc lực của virus cúm Đối với virus cúm có độc lực cao, tiểu phần HA1 và vị trí cắt có nhiều amino acid kiềm tính, phù hợp với motif B-X-B-R của các chủng virus cúm A độc lực cao Trong số 84 chủng được giải trình tự, 6 chủng bị khuyết thiếu nucleotit ở vị trí cắt giữa HA1 và HA2, dẫn đến chỉ 78 trình tự gen HA1 được phân tích Kết quả cho thấy 77/78 chủng virus thuộc clade 2.3.2.1c và 2.3.4.4a/b đều mang đặc trưng này Motif cơ bản của các chủng virus trong nghiên cứu là PQRERRRKR|GLF (2.3.2.1c) và PLREKRRKR|GLF (2.3.4.4a/b), cho thấy các biến chủng virus cúm này là thể độc lực cao.
4.2.1.2 Đặc điểm trình tự amino acid ở hốc gắn thụ thể
Theo nghiên cứu của Sun và các cộng sự (2013), ba vùng cấu trúc đã được xác định tạo nên hốc gắn thụ thể của tế bào chủ.
Trong 78 trình tự gen HA1 lựa chọn phân tích đặc điểm trình tự amino acid ở hốc gắn thụ thể, tiếp tục cắt bỏ những trình tự giống nhau (dùng công cụ Duplicate finder) còn lại 56 trình tự gen HA1
Trong 56 trình tự HA1 của virus cúm H5Nx, chỉ giữ lại các trình tự đại diện, với tần suất xuất hiện được thể hiện trong dấu [] trước tên chủng virus Các vị trí amino acid đặc hiệu cho thụ thể của gia cầm được đóng khung, trong khi các amino acid thay đổi khác biệt được chỉ ra bằng mũi tên.
Hình 4.17 Trình tự amino acid ở hốc gắn thụ thể tế bào vật chủ
Trong 56 trình tự HA1 lựa chọn nghiên cứu, chỉ giữ lại các trình tự đại diện (13 trình tự), với tần suất xuất hiện (số virus cùng đặc điểm trình tự amino acid ở hốc gắn thụ thể tế bào vật chủ) được thể hiện ở trước tên chủng virus Về đột biến ở hốc gắn với thụ thể của vật chủ, 18/18 chủng thuộc clade 2.3.2.1c, 9/9 chủng thuộc clade 2.3.4.4a và 25/29 chủng thuộc clade 2.3.4.4b mang trình tự amino acid Q-222 và G-224 có ái lực cao, đặc hiệu với receptor ở gia cầm (Ha & cs., 2001; Bui & cs., 2014; Tzarum & cs., 2015) Tuy nhiên, có 4/29 chủng virus thuộc clade 2.3.4.4b mang đột biến G-224-E (hình 4.18) Đặc biệt, trong 4 chủng kể trên có 1 chủng (16H5-KT2-242) đột biến ở cả 2 vùng đặc hiệu với thụ thể của gia cầm là E-186-K và G-224-E (mũi tên hình 4.18) Ảnh hưởng của các đột biến này chưa được làm rõ trong phạm vi nghiên cứu
4.2.1.3 Đặc điểm trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E
Tiểu phần HA1 của protein HA có vai trò quan trọng trong việc tạo ra các kháng nguyên trên bề mặt virus, giúp hệ miễn dịch nhận diện và phản ứng Đặc điểm đột biến của trình tự amino acid ở 5 vùng kháng nguyên trên tiểu phần HA1 được phân tích để hiểu rõ hơn sự khác biệt giữa các virus trong cùng clade và giữa các clade khác nhau (Kirkpatrick & cs., 2018).
Bài viết ghi chú rằng có 5 vùng kháng nguyên được đánh dấu bằng các màu sắc khác nhau: đỏ (A), xanh lá cây (B), đen (C), vàng (D) và tím (E) Ký hiệu “X” đại diện cho vị trí của amino acid chưa xác định chính xác, trong khi “.” biểu thị vị trí có amino acid giống với trình tự ở trên cùng.
Hình 4.18 Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.2.3.1c
Bài viết ghi chú rằng có năm vùng kháng nguyên được đánh dấu bằng các màu sắc khác nhau: đỏ (A), xanh lá cây (B), đen (C), vàng (D) và tím (E) Ký hiệu “X” chỉ vị trí chưa xác định chính xác của amino acid, trong khi “.” biểu thị vị trí có amino acid giống với trình tự ở đầu.
Hình 4.19 Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.3.4.4b
Bài viết ghi chú rằng có 5 vùng kháng nguyên được đánh dấu bằng các màu sắc khác nhau: đỏ (A), xanh lá cây (B), đen (C), vàng (D) và tím (E) Các ký hiệu “X” và “.” lần lượt đại diện cho vị trí của amino acid chưa xác định chính xác và vị trí có amino acid tương đồng với trình tự ở trên cùng.
Hình 4.20 Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.3.4.4a
So với hai chủng virus vacxin clade 1 và clade 2.3.4, hầu hết các chủng virus thuộc clade 2.3.2.1c và 2.3.4.4a/b đều có sự thay đổi amino acid tại năm vùng kháng nguyên A, B, C, D, và E, trong đó vùng A và D có nhiều đột biến nhất, đặc biệt ở các vị trí 123, 127, 134-137 (vùng A) và 192, 198-199 (vùng D) Sự thay đổi amino acid ở các vùng kháng nguyên là phổ biến đối với virus cúm, đặc biệt là subtype H5Nx Tuy nhiên, một số vị trí trong các vùng kháng nguyên vẫn giữ nguyên, như vị trí 112 (vùng A), 177, 179-180 (vùng B), 43-44 (vùng C), 165, 196, 208, 211 (vùng D), và 63, 83 (vùng E) Hình 4.19 đến 4.21 cho thấy đột biến điểm ở tiểu phần HA1 cũng xuất hiện ở những vị trí gần các vùng kháng nguyên, điều này đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu về virus cúm gia cầm.
4.2.1.4 Đặc điểm glycosyl hóa ở tiểu phần HA1
Kết quả dự đoán khả năng gắn kết một gốc đường (oligosaccharide) vào amino acid asparagin (N) ở tiểu phần HA1 được trình bày ở hình 4.22
Phần mềm NetNGlyc 1.0 dự đoán có 10 vị trí glycosyl hóa trong trình tự amino acid Dấu “.” biểu thị amino acid giống với trình tự trên cùng, trong khi dấu “-“ cho biết không có amino acid ở vị trí tương ứng Trong tổng số 56 trình tự HA1 của virus cúm H5Nx, chỉ giữ lại các trình tự đại diện, với tần suất xuất hiện được thể hiện trong dấu [] trước tên chủng virus.
Hình 4.21 Đặc điểm hiện tượng glycosyl hóa ở tiểu phần HA1
Trình tự glycosyl hóa của 56 chủng virus cúm H5Nx trong nghiên cứu này rất đa dạng, với 12 kiểu khác nhau Mỗi vị trí glycosyl hóa đều có sự biến đổi, gây ra hiện tượng thêm hoặc mất khả năng glycosyl hóa.
Trong số 34/58 chủng virus, có 6 vị trí glycosyl hóa quan trọng, bao gồm 10-NNS, 11-NST, 23-NVT, 165-NNT, 193-NPT và 286-NSS Đặc biệt, các chủng thuộc clade 2.3.2.1c có thêm 2 vị trí glycosyl hóa so với clade 1 và clade 2.3.4, đó là 140-NSS và 236-NDT Hiện tượng glycosyl hóa đóng vai trò quan trọng trong việc giúp virus lẩn tránh hệ miễn dịch, điều này đã được ghi nhận ở virus cúm type A (Abe & cs.).
Khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của các loại
Nghiên cứu tại mục 4.2 chỉ ra rằng ba biến chủng virus cúm A/H5Nx thuộc clade 2.3.2.1c, 2.3.4.4a và 2.3.4.4b có độc lực cao và khác biệt về trình tự amino acid trên gen HA so với các chủng virus vacxin hợp lệ tại Việt Nam Mặc dù có đáp ứng miễn dịch chéo clade khi sử dụng vacxin phòng bệnh cúm gia cầm, nhưng đáp ứng này là có điều kiện, phụ thuộc vào liều kháng nguyên, dẫn đến khả năng tạo ra miễn dịch vô trùng hoặc miễn dịch mang trùng Nghiên cứu tại mục 4.3 nhằm kiểm tra khả năng và mức độ vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của ba biến chủng này.
4.3.1 Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.3.2.1c
4.3.1.1 Kết quả tạo miễn dịch dị chủng cho gà thí nghiệm Để chuẩn bị nguyên liệu cho thí nghiệm, gà đã được gây miễn dịch bằng 2 loại vacxin phòng bệnh cúm gia cầm là Navet-vifluvac (clade 1) và Re-5 (clade 2.3.4) Ba tuần sau khi tiêm phòng vacxin, tiến hành kiểm tra đáp ứng miễn dịch dịch thể (sử dụng kháng nguyên đồng chủng với kháng nguyên vacxin)
Kết quả xác định hiệu giá kháng thể (HGKT) cho thấy gà tiêm vacxin Navet-vifluvac đạt HGKT trung bình 5,0 log2, trong khi gà tiêm vacxin Re-5 có HGKT trung bình 7,6 log2 Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Phạm Thành Nhương & cs (2016), cho thấy 94% gà thử nghiệm được bảo hộ huyết thanh với HGKT ≥ 4 log2 khi sử dụng vacxin Navet-vifluvac Ngoài ra, nghiên cứu của Nguyễn Văn Cảm & cs (2011) cho thấy mức độ bảo hộ kháng thể của vacxin Re-5 đạt trung bình 4,1-8,3 log2 Điều này chứng tỏ gà có đáp ứng miễn dịch trên ngưỡng bảo hộ, đủ điều kiện để thử thách công cường độc.
Hình 4.27 Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch trong thí nghiệm công cường độc bằng virus clade 2.3.2.1c
4.3.1.2 Kết quả công cường độc bằng virus H5N1 clade 2.3.2.1c
Kết quả theo dõi lâm sàng ở nhóm gà thí nghiệm và đối chứng sau công cường độc được trình bày ở hình 4.28
Hình 4.28 Khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.2.1c ở gà có đáp ứng miễn dịch dị chủng
Nhóm gà đối chứng sau 1 ngày nhiễm virus xuất hiện triệu chứng lâm sàng như mệt mỏi, ủ rũ, chảy nước mũi và nước mắt, dẫn đến tỷ lệ chết 100% sau 3 ngày Trong khi đó, gà nuôi cách ly không có triệu chứng bệnh Gà có đáp ứng miễn dịch chống lại virus cúm gia cầm clade 1 hoặc clade 2.3.4 vẫn bị ảnh hưởng bởi virus clade 2.3.2.1c Gà tiêm vacxin Navet-vifluvac không có triệu chứng trong 5 ngày đầu, nhưng từ ngày thứ 6 đến 7, 20% gà bị liệt chân và chết, với tỷ lệ sống sót 80% sau 10 ngày Ngược lại, nhóm gà tiêm vacxin Re-5 tiến triển bệnh nhanh hơn, với 50% gà chết từ ngày thứ 2 đến 7, trong khi 50% còn lại không có triệu chứng và sống sót sau 10 ngày Điều này cho thấy virus cúm gia cầm clade 2.3.2.1c vẫn có khả năng gây bệnh ở gà đã được miễn dịch, với tỷ lệ tương ứng 20% và 50%.
4.3.1.3 Biến đổi bệnh lý gây ra bởi virus cúm clade 2.3.2.1c ở gà có đáp ứng miễn dịch dị chủng
Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể của toàn bộ số gà ở các lô thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.1
Bảng 4.1 Bệnh tích đại thể trên gà ở các lô thí nghiệm sau công cường độc
TT Biến đổi bệnh lý
Số con biểu hiện/ số con thí nghiệm Đối chứng Re - 5 Navet- vifluvac
1 Mào, tích thâm tím, phù nề 5/5 0/10 0/10
2 Xoang miệng, mũi nhiều dịch nhầy 3/5 0/10 0/10
4 Xuất huyết cơ đùi, cơ lườn 5/5 8/10 0/10
5 Xuất huyết mỡ vành tim 4/5 0/10 0/10
6 Phổi phù, sung huyết, xuất huyết 5/5 9/10 8/10
7 Dạ dày tuyến xuất huyết 3/5 0/10 0/10
9 Tuyến ức sung huyết, xuất huyết 2/5 0/10 0/10
10 Túi Fabricius sưng, phù, xuất huyết 3/5 0/10 0/10
Trong nhóm gà đối chứng, virus cúm thuộc clade 2.3.2.1c gây ra bệnh tích điển hình của cúm gia cầm thể độc lực cao, bao gồm hiện tượng sung huyết và xuất huyết ở hầu hết các cơ quan nội tạng, với tỷ lệ xuất hiện bệnh tích dao động từ 40%-100% Những bệnh tích này tương đồng với các trường hợp gà mắc bệnh cúm gia cầm được ghi nhận trong tự nhiên và điều kiện thí nghiệm, đặc biệt là ở đường hô hấp và đường tiêu hóa.
Chủng virus thuộc clade này gây bệnh tích ở một số cơ quan nội tạng của gà đã có miễn dịch bằng clade 2.3.4 hoặc clade 1 Đặc biệt, bệnh tích phổi với nhiều dịch phù, sung huyết và xuất huyết lan tràn toàn bộ phổi được quan sát ở nhóm gà đối chứng và hai nhóm gà được gây miễn dịch dị chủng Biến đổi bệnh lý đại thể này được tóm tắt trong hình 4.29.
Bài viết đề cập đến các hiện tượng xuất huyết trong cơ thể, bao gồm: (A) lỗ huyệt xuất huyết, (B) tuyến ức có các điểm xuất huyết, (C) mỡ vành tim xuất huyết lấm chấm, (D) sung huyết ở lớp màng não, (E) phổi phù và xuất huyết tràn lan, (F; I) xuất huyết cơ đùi, (G; J) ruột xuất huyết, (H) phổi phù, sung huyết và xuất huyết, cùng với (K) gan xuất huyết và (L) phổi phù, sung huyết và xuất huyết Mũi tên trong hình minh họa chỉ rõ các điểm xuất huyết ở tổ chức.
Trong nghiên cứu về bệnh tích đại thể ở gà, nhóm đối chứng cho thấy nhiều biểu hiện bệnh lý như lỗ huyệt xuất huyết, tuyến ức có điểm xuất huyết, và mỡ vành tim xuất huyết Ngoài ra, các triệu chứng khác bao gồm sung huyết ở lớp màng não, phổi phù và xuất huyết tràn lan, cũng như xuất huyết ở cơ đùi và ruột Nhóm gà sử dụng vacxin Re-5 ghi nhận một số bệnh tích cúm gia cầm như phổi phù, xuất huyết cơ đùi và ruột Trong khi đó, nhóm gà được tiêm vacxin Navet-vifluvac chỉ xuất hiện bệnh tích ở phổi, trong khi các cơ quan nội tạng khác không có dấu hiệu bệnh lý.
4.3.1.4 Kết quả xét nghiệm virus clade 2.3.2.1c bài thải sau công cường độc Định lượng ARN của virus bài thải (sau đây gọi là định lượng virus) ở các nhóm gà được thực hiện vào ngày thứ 3, thứ 10 và khi gà chết sau công cường độc (hình 4.30)
Ghi chú về các ngày quan trọng: ngày 3 (D3), ngày 10 (D10) và ngày gà chết (Dx) sau khi tiếp xúc với công cường độc Đường nét đứt màu đỏ thể hiện ngưỡng dương tính (Ct ≤ 35) và âm tính (Ct > 35) với virus cúm.
Hình 4.30 Hiện tượng thải virus ở gà có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau công cường độc bằng chủng virus clade 2.3.2.1c
Kết quả phân tích cho thấy việc sử dụng vacxin đã bảo hộ lâm sàng cho gà với hiệu quả từ 50%-80%, giảm tổn thương nội tạng khi nhiễm virus cúm gia cầm độc lực cao clade 2.3.2.1c Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch không đạt trạng thái miễn dịch vô trùng, dẫn đến hiện tượng thải virus Gà được gây miễn dịch dị chủng thải mầm bệnh ít nhất đến ngày thứ 7 sau khi nhiễm virus, nhưng đến ngày thứ 10, tất cả gà sống sót không còn thải virus Trong khi đó, gà chết trong vòng 10 ngày theo dõi có lượng virus bài thải cao, trong khi nhóm đối chứng chết 100% và thải lượng lớn virus.
Đáp ứng miễn dịch dị chủng đối với clade 2.3.2.1c không hoàn toàn bảo vệ gà thí nghiệm khỏi triệu chứng lâm sàng và hiện tượng thải virus Điều này cho thấy virus clade 2.3.2.1c đã vượt qua một phần đáp ứng miễn dịch do virus clade 1 và clade 2.3.4 gây ra Nhận định này nhấn mạnh sự cần thiết phải tiếp tục nghiên cứu về sự lưu hành của các biến chủng virus cúm để điều chỉnh công thức vacxin, nhằm tạo ra đáp ứng miễn dịch vô trùng hiệu quả cho gia cầm được tiêm vacxin phòng bệnh.
4.3.2 Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.3.4.4a
4.3.2.1 Kết quả tạo miễn dịch dị chủng cho động vật thí nghiệm Ở nội dung này, cả gà và vịt được dùng để tạo miễn dịch dị chủng (đối với clade 2.3.4.4a) Kết quả được tóm tắt ở hình 4.31
Hình 4.31 Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch cho gà và vịt trong thí nghiệm công cường độc bằng virus clade 2.3.4.4a
Gà được miễn dịch với virus clade 1 (vacxin Navet-vifluvac) và clade 2.3.4 (vacxin Re-5) có hiệu giá kháng thể (HGKT) trung bình lần lượt là 5,2 log2 và 7,4 log2 Sau khi được tiêm nhắc lại, vịt đạt HGKT trung bình rất cao, tương ứng là 9,0 log2 và 9,3 log2 với hai loại vacxin này Điều này cho thấy cả gà và vịt đều đã tạo được đáp ứng miễn dịch vượt ngưỡng bảo hộ, sẵn sàng thử thách với chủng virus clade 2.3.4.4a.
4.3.2.2 Kết quả công cường độc với virus cúm H5N6 clade 2.3.4.4a
Kết quả theo dõi lâm sàng ở nhóm gà thí nghiệm và đối chứng sau công cường độc được trình bày ở hình 4.32
Hình 4.32 Khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.4.4a ở gà và vịt có đáp ứng miễn dịch dị chủng
Sau khi tiêm virus clade 2.3.4.4a, sự tiến triển bệnh giữa nhóm đối chứng (không có miễn dịch) và nhóm thí nghiệm (có miễn dịch dị chủng) thể hiện rõ rệt Nhóm đối chứng cho thấy triệu chứng lâm sàng sau 2-3 ngày, với gà chết đột ngột và toàn bộ chết sau 4 ngày theo dõi Trong khi đó, vịt có triệu chứng nhẹ hơn, chết rải rác từ ngày thứ 4, một số hồi phục sau 3-4 ngày Tổng cộng, 7/10 vịt ở nhóm đối chứng đã chết Đối với nhóm gà có miễn dịch dị chủng bằng clade 1, không có triệu chứng nào được ghi nhận trong 3 ngày đầu tiên.
4 có 1/10 con bị liệt chân, nằm bẹp và có biểu hiện khó thở, dịch mũi chảy nhiều