Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp thu thập số liệu thứ cấp
- Thu thập số liệu từ các nguồn báo chí, internet, bài báo khoa học trong nước và quốc tế
- Kế thừa có chọn lọc từ những tài liệu và nghiên cứu của các nhà khoa học có liên quan đến nghiên cứu
3.4.2 Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu đất, rễ cây và mẫu cây được thu thập tại vùng trồng cây chuyên canh như ngô và rau củ tại Hà Nội và Bắc Giang:
- Mẫu đất được lấy ở vùng rễ cây có độ sâu 5-15cm
Mẫu rễ cây rau và cây ngô khỏe được thu thập làm nguồn phân lập vi khuẩn nội sinh Việc lựa chọn cây khỏe và thu thập vào thời điểm trước thu hoạch là rất quan trọng Sau khi nhổ, cần rũ nhẹ để loại bỏ lớp đất bám ở vùng rễ.
Để phân lập vi khuẩn đối kháng bệnh thối thân (thối nhũn do vi khuẩn) và héo xanh vi khuẩn, cần chọn những mẫu cây khỏe mạnh như cây ngô, cây bắp cải và cây khoai tây, đang trong giai đoạn sinh trưởng phát triển mạnh trước khi thu hoạch.
Từ tháng 9/2018 đến tháng 3/2019, chúng tôi đã thu thập tổng cộng 15 mẫu đất, mẫu cây và rễ cây tại các khu vực và loại cây trồng khác nhau.
Bảng 3.1) Các mẫu được đựng trong túi zip sạch, bảo quản ngay ở 4 o C và tiến hành phân lập vi khuẩn trong vòng 01 tuần
Bảng 3.1 Thông tin mẫu nghiên cứu
STT Kí hiệu mẫu Nguồn mẫu Cây trồng
1 M1 Yên Dũng- Bắc Giang Khoai tây
2 M2 Yên Dũng-Bắc Giang Ngô
3 M3 Gia Lâm - Hà Nội Bắp cải
4 M4 Gia Lâm - Hà Nội Ngô
5 M5 Long Biên – Hà Nội Ngô
6 M6 Yên Dũng - Bắc Giang Cà chua
7 M7 Yên Dũng - Bắc Giang Bắp cải
8 M8 Gia Lâm - Hà Nội Mồng tơi
9 M9 Gia Lâm - Hà Nội Bắp cải
10 M10 Khoa Môi Trường- HVNNVV Cải cúc
11 M11 Khu Khí tượng, Khoa Môi trường, HVNNVN Cà chua
12 M12 Long Biên -Hà Nội Ngô
13 M13 Gia Lâm - Hà Nội Bắp cải
14 M14 Khu Khí tượng, Khoa Môi trường, HVNNVN Dưa chuột
15 M15 Kim Lan - Hà Nội Mồng tơi
3.4.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn
3.4.3.1 Xử lí mẫu và lập dãy pha loãng Đối với mẫu đất: cân 10g đất cho vào bình tam giác chứa 90ml nước vô trùng và lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 30 phút sau đó để lắng thu được nồng độ pha loãng 10 -1 tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10 -2 và 10 -3 Đối với mẫu rễ cây: rễ cây khỏe sau khi được loại bỏ hoàn toàn đất bằng cách rũ nhẹ trong không khí, rễ được rửa lại bằng nước vô trùng, và cồn 95 0 và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần, nghiền nhỏ mẫu sau đó thu dịch pha loãng đến nồng độ 10 -2 Đối với mẫu cây: Mẫu cây được rửa sạch đất bám ở thân và lá Để loại trừ các vi sinh vật có khả năng còn bám ở bề mặt, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, lá dưới vòi nước mạnh; tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt thân, lá thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm; sau đó lần lượt khử trùng mẫu bằng cồn 95% trong 3 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa Cuối cùng, nghiền nhỏ mẫu và thực hiện thao tác tương tự với mẫu rễ và thu dịch
Sử dụng môi trường dinh dưỡng chuyên tính bán rắn để phân lập vi khuẩn, nhỏ 0,1ml dịch đã chuẩn bị với các nồng độ pha loãng khác nhau vào hộp lồng chứa môi trường, thực hiện 4 lần lặp lại Các đĩa thạch được nuôi ở 28°C trong 1 tuần, trong đó kiểm tra sự hình thành khuẩn lạc hàng ngày Sau 1 tuần, tiến hành thuần khuẩn lạc bằng cách cấy truyền sang đĩa thạch mới dựa trên sự khác biệt về hình thái, kích thước và màu sắc của khuẩn lạc Các chủng vi khuẩn thuần khiết sẽ được lưu giữ trong ống giống thạch nghiêng cho các nghiên cứu sau này.
(i) Phân lập vi khuẩn bao gồm cả vi khuẩn đối kháng từ mẫu đất, rễ và thân lá ban đầu bằng môi trường Bacillus
(ii) Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải kali: nuôi cấy trên môi trường Alexandrov
(ii) Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải lân: nuôi cấy trên môi trường kiểm tra VSV phân giải hợp chất photpho vô cơ khó tan
(iii) Phân lập vi khuẩn có khả năng cố định đạm: nuôi cấy trên môi trường
Azotobactor (môi trường không chứa đạm ashby).
Bảng 3.2 Thành phần môi trường phân lập
STT Tên môi tường Thành phần Khối lượng
Dung dịch muối tiêu chuẩn 10ml
Môi trường kiểm tra VSV phân giải hợp chất photpho vô cơ khó tan
3.4.4 Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học của vi khuẩn
Các chủng vi sinh vật được phân lập sẽ được cấy trên môi trường chuyên dụng và nuôi ở nhiệt độ 28C Thời gian mọc của chúng sẽ được theo dõi, trong đó các chủng mọc trước 72 giờ được coi là mọc nhanh, trong khi các chủng mọc sau 72 giờ được đánh giá là mọc chậm.
3.4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng vi sinh vật: Cấy từng chủng vi sinh vật trên môi trường chuyên tính, nuôi ở các mức nhiệt độ khác nhau 10 o C;
20 o C; 30 o C; 40 o C, đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành
3.4.4.3 Khả năng thích ứng tính pH
Giá trị pH của môi trường được điều chỉnh ở các ngưỡng khác nhau (4, 5,
Để điều chỉnh pH môi trường nuôi cấy, dung dịch đệm pH được pha chế từ Na2HPO4 và K2HPO4 được bổ sung vào môi trường Sau khi hấp khử trùng, môi trường được đổ vào đĩa petri và cấy vi sinh vật phân lập lên các đĩa có pH khác nhau Các đĩa này sau đó được nuôi ở nhiệt độ 28 oC, và số lượng khuẩn lạc được hình thành sẽ được đếm.
3.4.4.4 Xác định khả năng kháng kháng sinh
Để tiến hành thí nghiệm, cân các mức kháng sinh Steptomyxin (300; 500; 800; 1000 mg/l) vào môi trường chuyên tính đã được khử trùng Sau đó, đổ hỗn hợp vào đĩa petri, cấy vi sinh vật và nuôi ở nhiệt độ 28 độ C Cuối cùng, đếm số lượng khuẩn lạc hình thành để đánh giá hiệu quả của kháng sinh.
3.4.5 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh
3.4.5.1 Lựa chọn phương pháp đánh giá Đánh giá khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh theo phương pháp của Soad et al (2004) và Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9300:2014
Vi khuẩn gây bệnh héo xanh và thối nhũn (Ralstonia solanacearum và
E.carotovora) được cung cấp bởi PGS Hà Viết Cường, Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, nay là bệnh viện cây trồng, Học viện NNVN
Khả năng đối kháng của vi sinh vật được xác định thông qua việc đo đường kính vòng kháng khuẩn Kích thước vòng đối kháng, tính bằng millimet, được xác định theo công thức cụ thể.
Kích thước vòng đối kháng (mm) = D - d
D là đường kính vòng đối kháng, tính bằng milimet (mm); d là đường kính lỗ giếng, tính bằng milimet (mm)
Kết quả là giá trị trung bình cộng của 4 lần lặp lại
3.4.5.2 Thao tác thực hiện thí nghiệm
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh (vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh và E.carotovora gây bệnh thối nhũn):
Lấy một vòng que cấy vi khuẩn gây bệnh và cấy vào môi trường dịch thể đã được chuẩn bị sẵn bởi King’B Tiến hành nuôi cấy lắc trong 48 giờ ở nhiệt độ từ 28-30°C, đảm bảo mật độ tế bào vi khuẩn đạt ít nhất 10^8 CFU/ml.
Bước 2: Nuôi cấy vi sinh vật đối kháng:
- Lấy một vòng que cấy vi sinh vật cho vào bình tam giác chứa môi trường chuyên tính dịch thể đã chuẩn bị sẵn
- Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp từ 28-30°C trong 2 ngày
Bước 3: Xác định hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng thông qua kích thước vòng đối kháng:
Sử dụng pipet vô trùng để lấy 0,1 ml dịch vi khuẩn gây bệnh và cấy vào đĩa petri chứa môi trường King’B đã chuẩn bị Dùng que chang vô trùng để trải đều dung dịch huyền phù vi khuẩn trên bề mặt thạch Chờ từ 20-30 phút cho bề mặt thạch khô, sau đó dùng ống nghiệm vô trùng có đường kính 1cm để đục lỗ ở trung tâm đĩa petri Cuối cùng, dùng que cấy vô trùng có mũi nhọn để loại bỏ phần thạch vừa đục.
Sử dụng pipet vô trùng để lấy 0,1 ml dịch vi sinh vật đối kháng và đưa vào các giếng đã loại bỏ thỏi thạch, giữ ở điều kiện thích hợp cho từng chủng vi sinh vật (từ 28-30°C, trong thời gian tối thiểu 2 ngày) Mỗi mẫu cần được cấy lặp lại ít nhất 3 lần và tiến hành trong tủ cấy vô trùng.
3.4.6 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng và tổng hợp chất dinh dưỡng
3.4.6.1 Phương pháp đánh giá khả năng cố định đạm
Tiến hành nuôi lắc các chủng vi khuẩn trong môi trường Ashby không chứa nitơ giúp xác định khả năng cố định đạm của chúng Những dòng vi khuẩn sống sót và phát triển trong điều kiện này là minh chứng cho khả năng sinh trưởng của chúng Thành phần pha chế môi trường Ashby được chi tiết trong Bảng 3.2.