Nghiên cứu nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần làm sáng tỏ tác dụng dược lý của nguồn dược liệu quý, đồng thời góp phần cho việc sử dụng hợp lý, hiệu quả và bảo tồn nguồn nguyên liệu biển quý giá của đất nước. Mời các bạn tham khảo!
TỔNG QUAN
Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai
Cầu gai, hay còn gọi là nhím biển, nhum biển, hoặc chôm chôm biển, thuộc lớp cầu gai (Echinoidea) trong ngành động vật da gai (Echinodermata) Loài này có hai phân lớp: cầu gai đều xuất hiện vào kỉ Silua, trong khi cầu gai không đều xuất hiện vào kỉ Jura Hiện nay, có khoảng 800 loài cầu gai đang sống và 2.500 loài đã tuyệt chủng.
Cầu gai, hay còn gọi là nhím biển, là loài hải sản có hình dáng đặc biệt với hàng trăm chiếc gai nhọn xung quanh Chúng thường sống gần các rạn san hô và rạn đá ven biển Mặc dù có vẻ ngoài bất động, nhưng cầu gai thực sự là động vật với khả năng phản ứng nhanh chóng khi bị chạm Các gai của chúng được gắn vào vỏ bằng cơ chế ball-and-socket, cho phép chúng hướng gai về phía tác động Cầu gai không có mắt, chân hay cơ quan di chuyển, nhưng chúng vẫn có thể di chuyển linh hoạt nhờ vào các ống dính kết nối với xương sống.
Cầu gai sống ở nhiều độ sâu khác nhau từ đới gian triều tới biển sâu Hiện biết khoảng hơn 70 loài thuộc các chi Salmacis; Temnopleurus; Diadema; Clypeaster [3]
Có mặt ở hầu hết các vùng biển toàn cầu, chúng sinh sống trong các rạn san hô, từ vùng triều cho đến độ sâu khoảng 70 mét, và thường tìm thấy trên thềm biển, đáy đá hoặc vùi trong cát biển.
Ven biển Miền Trung và Quần đảo Hoàng Sa, cùng với vùng biển Côn Đảo, đã ghi nhận 13 loài thuộc 9 họ khác nhau Tại Vịnh Nha Trang, có 7 loài được phát hiện, trong khi vùng biển Vịnh Phong Vân – Bến Gỏi, Vĩnh Thái Lan, Phú Yên, Khánh Hòa và Phan Thiết thường xuất hiện nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao.
- Thế giới: Loài phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, vùng biển Bắc Đại Tây Dương từ eo biển Anh Quốc sang New Jersey (Hoa Kỳ)
1.1.3 Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm [7]
Vùng biển Địa Trung Hải nổi tiếng với cầu gai ăn được Paracentrotus lividus, một món ăn đặc sản được phục vụ tại các nhà hàng ven biển nơi chúng được đánh bắt Loài cầu gai này có thể tìm thấy tận vùng biển phía Nam Ái Nhĩ Lan, với đường kính lên đến 8 cm Vỏ ngoài của chúng thường được bán làm quà lưu niệm cho du khách.
Vùng Bắc Đại Tây Dương, từ eo biển Anh quốc đến New Jersey, là nơi thường gặp loài Strongylocentrus droebachiensis, nhưng chúng không được ưa chuộng nhiều Loài này xuất hiện chủ yếu tại vùng biển Maine, và thị trường tiêu thụ của chúng khá hạn chế, chỉ tập trung ở một số chợ hải sản quanh New York như Fulton Fish Market Việc chuyên chở cũng là một yếu tố cản trở sự phát triển của thị trường này.
Hình 1.1 Cầu gai S droebachiensis (nguồn www.wallawalla.edu)
Xa hơn về phía Nam Đại Tây Dương, tồn tại nhiều loại cầu gai nhỏ hơn, trong đó chỉ có loài Cidaris tribuloides ở vùng West Indies là có thể ăn được.
Tại Đông Nam Á, cầu gai chủ yếu có kích thước tương đương quả táo tây, trong đó loài Diadema setosum rất phổ biến nhưng chỉ được tiêu thụ tại một số địa phương như đảo Kor Samuy ở Thái Lan, do có nhiều gai dài và nhọn dễ gãy, mỗi gai chứa dịch độc Ở Việt Nam, đặc biệt là vùng ven biển Phan Thiết (Bình Thuận), cầu gai được xem là một đặc sản, với nhiều địa danh liên quan như sông Nhum, cầu Nhum, và bến Nhum Loài Diadema palmeri có vỏ đường kính khoảng 10 cm và gai dài đến 10 cm với màu đỏ, trong khi loài Diadema savignyi có vỏ 10 cm, gai dài 13 cm, với màu lam-đen và có thể có đốm trắng.
Hình 1.2 Cầu gai D setosum (nguồn en.wikipedia.org)
1.1.4 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai
Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài da gai đã chỉ ra rằng, chúng chủ yếu chứa các hợp chất steroit, saponin và cerebrosit Trong năm lớp sinh vật thuộc ngành da gai, hai lớp sao biển (Asteroitea) và hải sâm (Holothuroidea) đã được nghiên cứu chi tiết, với nhiều công trình khoa học công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chúng Đặc biệt, các nghiên cứu của Đặng Ngọc Bách đã tập trung vào asterosaponin và cerebrosit từ sao biển, cùng với các hợp chất saponin dạng khung holostan từ hải sâm.
Mặc dù từ những năm 1980 đã có các nghiên cứu về hợp chất sắc tố quinoit từ loài cầu gai Diadema setosum và D savignije, nhưng hiện nay vẫn còn rất ít công trình nghiên cứu công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển thuộc lớp cầu gai.
Năm 2004, nhóm nghiên cứu của GS Châu Văn Minh đã phân lập và xác định cấu trúc hai hợp chất steroid là 5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol và cholesterol, cùng với glycerol 1-palmitat và glyxerol 1,3-đioleat-2-stearat từ cặn chiết metanol của loài cầu gai D setosum tại Hạ Long, Việt Nam Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào cho thấy hợp chất 5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên ba dòng tế bào ung thư người, với giá trị IC50 lần lượt là 2,0, 3,93 và 2,4 µg/ml.
Vào năm 2008, nhóm nghiên cứu Nhật Bản đã công bố một dẫn xuất gangliosit mới mang tên 1-O-[9-O-metyl-(N-axetyl-α-D-neuraminozyl)-(2→6)-β-D-glucopiranozyl]-ceramit (DSG-A, 2), cùng với bốn gangliosit đã biết trước đó Các hợp chất này cho thấy hoạt tính tạo tế bào thần kinh hình sợi (neuritogenic activity) trên dòng tế bào thần kinh nội tiết từ tủy tuyến thượng thận của chuột PC.
Hợp chất 2 có nhóm metoxi ở đơn vị đường NeuAc cho thấy hoạt tính mạnh nhất trong nghiên cứu trên dòng tế bào pheochromocytoma 12 với sự hiện diện của nhân tố phát triển dây thần kinh Điều này chỉ ra rằng, sự O-metyl hóa của nhánh axit sialic đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hoạt tính tạo tế bào thần kinh hình sợi của các hợp chất gangliosit được phân lập từ các loài da gai.
Gần đây, các hợp chất sắc tố napthoquinon đã được phát hiện trong các loài cầu gai như Tripneustes gratilla, Diadema setosum và Paracentrous lividus Sự đánh giá này được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA.
(photodiode array detector) ghép nối khối phổ ESI (electrospray ionization) Kết quả phân tích cho thấy, loài D setosum có sự xuất hiện của các sắc tố spinochrom E
(3), một sản phẩm oxi hóa của echinochrom A, echinochrom A và 6-etyl-2,7- đihiđroxi-3-metoxinaphthazanrin ; loài T gratilla có sự xuất hiện của 3, spinochrom
The compounds D (4), 2,3-dihydro-2,3,7-trihydroxy-2,3-epoxy-6-ethylnapthazarin, echinochrom A, and anhydroethyldiene-6,6'-bis-(2,3,7-trihydroxynaphtazarin) (5) are present in the species P lividus, along with spinochrom E (3) and spinochrom D (4).
Steroit từ một số loài sinh vật biển Việt Nam
Steroit là nhóm hợp chất thiên nhiên phổ biến và thú vị, phân bố rộng rãi trong cơ thể động vật Chúng có nhiều tính chất quan trọng, được sử dụng trong điều trị bệnh, điều hòa hệ thống nội tiết và chữa viêm khớp Ngoài ra, steroit còn được dùng để chế tạo thuốc tránh thai và ngày càng được công nhận trong chăn nuôi và nông nghiệp Với tác dụng sinh lý đáng chú ý, steroit không chỉ là mối quan tâm khoa học mà còn có ý nghĩa quan trọng trong dược học.
Nhóm chất steroid đã được phát hiện trong hầu hết các mẫu nghiên cứu thuộc ba nhóm hải miên, san hô mềm và da gai tại Việt Nam Cholesterol là hợp chất chiếm hàm lượng cao và xuất hiện phổ biến trong các loài sinh vật biển được thu thập Hợp chất này đã được phân lập từ các loài như san hô mềm Cladiella sp., sao biển Archaster tyicus, hải miên Xestospongia testudinaria và Gellius varius.
Các dẫn xuất cholesterol như 7α-hiđroxi-cholesterol, 7β-hiđroxi-cholesterol và 7α-metoxi-cholesterol đã được phân lập từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Nghiên cứu hóa học của hải miên Dysidea cinerea cho thấy sự phong phú của nhóm steroit, bao gồm ostreasterol, isofucosterol và 5,8-epiđioxicholest-6-en-3β-ol, cũng được tìm thấy ở hải miên Varius, X testudinaria và cầu gai Diadema setosum.
Nghiên cứu hóa học của loài hải miên Haliclona clathrata đã phân lập hợp chất mới 24-nor-5α-cholestan-3β,23,24-triol cùng với (24R)-24-etylcholest-4-en-3,6-đion và (24R)-24-etylcholest-3,6-đion Ngoài ra, các hợp chất cholesterol như cholest-7-en-3β,5α,6β-triol và 6β-metoxicholest-7-en-3β,5α-điol cũng được tìm thấy từ loài hải miên G varius Hơn nữa, saringosterol và cholest-7-en-3-on đã được xác định từ loài hải miên X testudinaria, trong đó saringosterol được ghi nhận có hoạt tính kháng vi khuẩn lao.
Mycobacterium tuberculosis có giá trị nồng độ tối thiểu (MIC) là 0,25 µg/ml, đây là giá trị MIC nhỏ nhất trong các hợp chất thiên nhiên được nghiên cứu tính đến năm 2001 Giá trị này tương đương với MIC của thuốc chữa lao rifampin, đồng thời hợp chất này cũng có độ độc thấp và tính đặc hiệu cao.
Gần đây, các nhà nghiên cứu đã phân lập ba hợp chất steroid mới có cấu trúc vòng propan từ loài hải miên Ianthella sp., bao gồm petrosterol-3,6-đion, 5α,6α-epoxipetroterol và iantheketal A, cùng với petrosterol và aragusterol B.
Từ loài san hô mềm Cladiella sp, các nhà nghiên cứu đã phân lập thành công hợp chất mới 9,11-secosteroitglycozit có tên là cladiasterol, cùng với hợp chất 3β,6α,11-trihydroxi-24-metyl-9,11-secocholest-7-en-9-on Đây là hợp chất đầu tiên được chiết xuất từ thiên nhiên Tiếp theo, hợp chất 9,11-secosteroit được phát hiện là sarcomilasterol, cùng với sarcoaldesterol B và ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol từ loài san hô mềm.
24-nor-5α-cholestan-3β,23,24-triol saringosterol petrosterol-3,6-đion 5α,6α-epoxipetroterol Đặng Ngọc Bách 10 Hóa hữu cơ
Sarcophyton mililatensis; Các hợp chất 3β,11-đihiđroxi-24-metyl-9,11- secocholestan-5-en-9-on, (24S)-ergostan-3β,5α,6β,25-tetraol được phân lập từ san hô mềm Lobophytum compactum
Gần đây, các hợp chất mới như lobophytosterol, (22S,24S)-24-metyl-22,25-epoxifurost-5-en-3β,20β-điol, (24S)-ergost-5-en-3β,7α-điol và pregnenolon đã được phân lập từ san hô mềm Lobophytum laevigatum Nghiên cứu cho thấy lobophytosterol có hoạt tính mạnh mẽ trên ba dòng tế bào ung thư: phổi, ruột và máu, cùng với các hợp chất như cladiasterol và sarcomilasterol.
3β,11-đihiđroxi-24-metyl-9,11- -secocholestan-5-en-9-on (24S)-ergostan-
-3β,5α,6β,25-tetraol Đặng Ngọc Bách 11 Hóa hữu cơ
Các nghiên cứu về thành phần steroid từ các loài da gai đã phát hiện nhiều hợp chất đáng chú ý Cụ thể, hợp chất 2α,3β,12α,21,24R,25-hexahydroxylanost-8-en được chiết xuất từ hải sâm H scabra Từ loài sao biển A typicus, các nhà nghiên cứu đã phân lập được nhiều hợp chất steroid như 27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,24R-octol, 27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α,24R-nonol, và ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,22E,24R,25R,26-nonol, cùng với lobophytosterol (24S)-ergost-5-en-3β,7α-diol.
14α,15α,24R-octol ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,14α, 15α,22E,24R,25R,26-nonol Đặng Ngọc Bách 12 Hóa hữu cơ
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Tên Việt Nam: Cầu gai Sa-vít
- Tên khoa học: Diadema savignyi
- Địa điểm thu mẫu: Nha Trang
- Người giám định loài: ThS Nguyễn Thị
Mỹ Ngân, Viện Hải Dương học Nha Trang
Màu sắc của con trưởng thành thường là màu đen, bao gồm cả chóp nón hậu môn Trong ánh sáng ban ngày, các đốm mắt tạo thành một vòng xanh quanh hệ thống đỉnh, cùng với những đốm trắng xuất hiện trên mặt lưng trong mỗi đường xen tia, mặc dù không rõ ràng Các con non gai tay có băng ngang, ngay cả khi đường kính ngang của vỏ đạt đến 30 mm, điều này trái ngược với màu đen của các gai ở D setosum.
Mỗi mảnh xương ở vùng chân ống có 3 đôi lỗ, với vùng lỗ gần miệng trụi gai và rộng, chứa 2 hàng nấm gai nguyên thủy Vùng trung gian cũng có 2 hàng nấm gai nguyên thủy, thường có từ 4-5 nấm gai trong mỗi hàng ngang Vỏ trụi gai còn thể hiện các đường sọc xanh giữa các mảnh gián tiếp.
Kích thước: đường kính ngang thường gặp của vỏ ở con trưởng thành từ 40-65 mm (có khi đạt tới 100 mm), chiều cao từ 20-40 mm
Loài D savignyi có đặc điểm dễ phân biệt với D setosum nhờ màu sắc của hậu môn Cụ thể, hậu môn của D setosum có một vòng màu cam, trong khi hậu môn của D savignyi hoàn toàn màu đen.
Sinh học -Sinh thái học
Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi Đặng Ngọc Bách 13 Hóa hữu cơ
Diadema savignyi sống ở các vùng nước nông Sống trong rạn san hô, từ vùng triều đến độ sâu khoảng 70 mét
Trong nước: ven biển Miền Trung và Quần đảo Hoàng Sa
Thế giới: loài phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương.
Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Marck 1,05715) và RP18 F254S (Merck) được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 368nm Ngoài ra, có thể sử dụng dung dịch H2SO4 10% phun lên bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng từ từ trên bếp điện cho đến khi xuất hiện màu.
2.2.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60G F254 (Merck, mã 105875), với việc phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 368nm Ngoài ra, có thể cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử dưới dạng dung dịch.
Để phát hiện vết chất, sử dụng dung dịch H2SO4 10% và hơ nóng, sau đó ghép lại bản mỏng như ban đầu để xác định vùng có chất Tiếp theo, cạo lớp silica gel chứa chất và giải hấp phụ bằng dung môi phù hợp.
Sắc kí cột sử dụng chất hấp phụ là silica gel, bao gồm cả pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có kích thước hạt từ 0,040 đến 0,063 mm (240-430 mesh), trong khi silica gel pha đảo ODS hoặc YMC có kích thước hạt từ 30 đến 50 μm, được cung cấp bởi Fujisilisa Chemical Ltd.
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được thu thập bao gồm 1 H-NMR (600 MHz), 13 C-NMR (150 MHz), HMQC và HMBC, sử dụng máy Bruker AM600 FT-NMR Spectrometer tại Viện Nghiên cứu khoa học cơ bản Hàn Quốc (KBSI).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một trong những phương pháp phổ hiện đại và hiệu quả nhất hiện nay Bằng cách kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có khả năng xác định cấu trúc của hợp chất, bao gồm cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý cơ bản của phương pháp phổ NMR, bao gồm phổ proton và cacbon, là sự cộng hưởng của các hạt nhân 1H và 13C trong từ trường ngoài Sự cộng hưởng này được thể hiện qua độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) Thêm vào đó, đặc trưng của hạt nhân còn được xác định thông qua tương tác spin giữa các hạt nhân từ.
Trong phổ 1 H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được đo trong thang ppm từ 0-14ppm Độ dịch chuyển này phụ thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử và các đặc trưng của tương tác spin, từ đó giúp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất.
Phổ 13 C-NMR cung cấp tín hiệu từ các nguyên tử cacbon, với mỗi nguyên tử cộng hưởng ở một trường khác nhau, tạo ra các tín hiệu phổ riêng biệt Thang đo của phổ 13 C-NMR được tính bằng ppm, với dải độ rộng từ 0 đến 230 ppm.
Phổ 2D-NMR là một kỹ thuật phổ hai chiều giúp xác định các tương tác giữa các hạt nhân từ trong phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ yếu thường được áp dụng trong các luận văn bao gồm các phương pháp phân tích tương tác hạt nhân.
Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) cho phép xác định các tương tác trực tiếp giữa proton (H) và carbon (C) thông qua các tín hiệu trên phổ Trong đó, trục ngang là phổ 1H-NMR và trục dọc là phổ 13C-NMR Các tương tác HMQC được biểu thị bằng các đỉnh nằm trên các ô vuông trong phổ, giúp phân tích cấu trúc phân tử một cách hiệu quả.
Phổ 1 H- 1 H COSY (Homocosy), ( 1 H- 1 H Chemical Shift Correlation
Phổ H-NMR thể hiện các tương tác giữa các proton gắn liền với các nguyên tử carbon lân cận, cho phép xác định cấu trúc phân tử Qua phổ này, chúng ta có thể nhận diện cách các phân tử liên kết với nhau một cách rõ ràng.
Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoạt tính diệt tế bào ung thư của các hợp chất sẽ được xác định bằng phương pháp MTT (3-[4,5-đimetylthiazol-2-yl]-2,5-điphenyltetrazol brom) Ba dòng tế bào ung thư người dự kiến sẽ được sử dụng trong nghiên cứu này là HL-60 (bạch cầu cấp tính promyeloid người).
- ung thư máu), PC-3 (human prostate cancer - ung thư tuyến tiền liệt), SNU-C5 (human colon cancer - ung thư ruột kết) được nuôi cấy trong môi trường RPMI
Trong nghiên cứu, 1640 được bổ sung 10% huyết thanh phổi bò (fetal bovine serum) cùng với penicillin/streptomycin (100 U/mL và 100 mg/mL) và được ủ ở 37 °C trong môi trường 5% CO2 ẩm Các tế bào phát triển theo cấp số nhân đã được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Phương pháp MTT được thực hiện bằng cách xử lý các dòng tế bào ung thư người, bao gồm HL-60 (3 × 10^5 tế bào/mL), PC-3 (5 × 10^5 tế bào/mL) và SNU-C5 (1 × 10^5 tế bào/mL) trong 3 ngày với các hợp chất ở các nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50.
Trong nghiên cứu này, các mẫu chiết xuất được thử nghiệm ở nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 μg/mL, cùng với 100 μM Sau khi ủ, 0,1 mg MTT (50 μL dung dịch 2 mg/mL) được thêm vào mỗi giếng và tiếp tục ủ ở 37°C trong 4 giờ Các phiến được ly tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó loại bỏ môi trường cẩn thận Để hòa tan các tinh thể formazan, 150 μL đimetylsunfoxit được thêm vào mỗi giếng, và kết quả được đọc ở bước sóng 540 nm trên thiết bị đọc vi phiến Tất cả thí nghiệm được lặp lại ba lần và giá trị trung bình được tính toán Kết quả thể hiện phần trăm ức chế dựa trên sự giảm cường độ hấp phụ so với đối chứng âm Đường cong phụ thuộc nồng độ được xây dựng và nồng độ ức chế 50 phần trăm (IC50) được xác định cho các mẫu thử và dòng tế bào Giá trị IC50 < 100 μM với chất sạch và IC50 < 100 μg/ml với các cặn chiết được xem là có hoạt tính.