ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Dịch chiết polyphenol từ bã ổi đào được tách chiết tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Quả ổi đào được thu mua tại chợ Minh Phương (Việt Trì - Phú Thọ) khi đạt độ chín 90%, với vỏ màu xanh nhạt, mùi thơm và vị ngọt vừa phải, vẫn giữ được độ cứng Quá trình lựa chọn quả đảm bảo đồng đều về kích thước, màu sắc, và độ chín, đồng thời không có dấu hiệu dập nát, sâu bệnh hay thối hỏng Sau khi thu hoạch, quả được rửa sạch bằng nước và để khô tự nhiên.
- Thức ăn chăn nuôi giàu chất béo: Cám lợn với hàm lượng chất béo 5,6%
Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
STT Hóa Chất Nơi sản xuất
3 Thuốc thử Folin Ciocalteu Trung Quốc
10 Cao nấm men Trung Quốc
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
STT Dụng cụ Nơi sản xuất
1 Bình tam giác Trung Quốc
5 Cốc đong có mỏ Trung Quốc
6 Bình định mức Trung Quốc
Thiết bị thí nghiệm Nơi sản xuất
2 Cân phân tích có độ chính xác 0,001g Trung Quốc
4 Máy lắc Shaking Incubator NB-205 Trung Quốc
5 Tủ lạnh Samsung Việt Nam
7 Tủ cấy vi sinh LV-VC 1200 Trung Quốc
8 Nồi hấp thanh trùng paster Nhật Bản
Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm.
Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu một số thông số tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào
Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình tách chiết polyphenol
Phân tích, đánh giá tác dụng của dịch chiết polyphenol
3.2.2 Địa điểm nghiên cứu Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Thời gian thực hiện: từ 12/2019 - 5/2020.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1 : Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
- Trọng lượng khô của nguyên liệu
- Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu
Nội dung 2: Nghiên cứu lựa chọn một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp
- Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp
- Nghiên cứu thời gian chiết thích hợp
- Nghiên cứu nhiệt độ chiết thích hợp
Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn là một bước quan trọng để nâng cao hiệu quả chiết xuất Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm polyphenol giúp xác định khả năng ứng dụng trong bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo, từ đó góp phần cải thiện chất lượng và độ an toàn của sản phẩm.
- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol bằng thử nghiệm DPPH
- Ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
Nội dung 5: Hoàn thiện quy trình dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích
- Quy trình tách chiết polyphenol.
Phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích nội dung 1: phương pháp Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
3.4.1 Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu
Sử dụng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5631:1991
Sử dụng nhiệt độ để tách ẩm trong vật liệu mà vẫn giữ lại các chất có trong đó là rất quan trọng Do đó, cần đảm bảo rằng nhiệt độ sấy không quá cao hoặc quá thấp để đạt hiệu quả tối ưu.
Nhiệt độ cao khiến ẩm bốc hơi nhanh, nhưng cũng có thể làm thay đổi tính chất hóa học của các chất, đặc biệt là các chất dễ bay hơi, dẫn đến ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Nhiệt độ thấp khiến hơi nước thoát ra chậm, dẫn đến thời gian kéo dài và các chất bị biến đổi Độ ẩm được xác định thông qua phương pháp sấy cho đến khi khối lượng ổn định.
- Xác định độ ẩm TCVN 5613 – 1991
- Bản chất của phương pháp: Phương pháp dựa trên việc sấy mẫu bã quả ổi đào đến khối lượng không đổi trong điều kiện xác định
- Thiết bị và vật liệu để tiến hành xác định độ ẩm, cần sử dụng:
+ Cân phân tích với sai lệch cho phép không vượt quá 0,001g
+ Tủ sấy đảm bảo điều chỉnh được nhiệt độ (105˚C) hoặc (120˚C)
+ Chén cân bằng thủy tinh, sứ hoặc nhôm đường kính 50mm và có nắp đậy kín + Bình hút ẩm
Lấy chén cân có khả năng chứa 10g mẫu, rửa sạch và sấy ở 105°C cho đến khi trọng lượng ổn định Sau đó, để chén nguội trong bình hút ẩm từ 20-25 phút và tiến hành cân với độ chính xác cao.
- Sau đó cho vào cốc khoảng 10 g mẫu Cân tất cả ở cân phân tích một cách chính xác
- Cho tất cả vào tủ sấy ở 105 0 C, sấy trong vòng từ 6h cho đến khi trọng lượng không đổi
- Sấy xong, làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25 phút) và đem cân ở cân phân tích một cách chính xác
Cho mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ 105°C trong 1 giờ, sau đó để nguội trong bình hút ẩm trong khoảng 20-25 phút Tiến hành cân mẫu trên cân phân tích cho đến khi trọng lượng không thay đổi.
Tính kết quả: Độ ẩm (W) được tính theo phần trăm khối lượng xác định bằng công thức:
- W: Độ ẩm của thực phẩm (%)
- m: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g)
- m₁: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)
3.4.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết bã quả ổi đào được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một số điều chỉnh Dịch chiết bã quả ổi đào được pha loãng, sau đó 0,1 ml dịch chiết pha loãng được trộn với 0,9 ml nước cất, tiếp theo là 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5% Hỗn hợp này được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm bằng máy quang phổ kế Gallic acid được sử dụng làm chất chuẩn, và hàm lượng polyphenol tổng số được biểu diễn theo mg đương lượng gallic acid (GAE) trên 1g chất khô (DW) hay mg GAE/g DW.
- TPC là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW)
- X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml)
- V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu bã quả ổi đào (ml)
- K là hệ số pha loãng
- V là thể tích dịch chiết được sử dụng (ml)
- m là khối lượng mẫu thí nghiệm (g)
- w là độ ẩm của mẫu (%)
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu
Quả ổi đào chín 90% được thu hoạch, loại bỏ tạp chất và sâu bệnh, sau đó rửa sạch và để khô tự nhiên Bã ổi đào được chiết xuất bằng phương pháp trích ly với dung môi nước, ở nhiệt độ 40°C trong 30 phút, với tỉ lệ nguyên liệu so với dung môi là 1/10 (w/v) Dịch chiết thu được sẽ được xác định hàm lượng polyphenol.
3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.5.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: phương pháp xác định một số thông số tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào
Phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố được sử dụng Thí nghiệm sau kế thừa kết quả nghiên cứu của thí nghiệm trước
Để tách chiết polyphenol từ bã ổi đào, trước tiên, ổi đào được thu hái và rửa sạch, sau đó xay nhỏ để lấy bã Tiếp theo, 4g bã ổi đào được cho vào bình tam giác, bịt kín và đặt vào thiết bị rung lắc để thực hiện quá trình trích ly bằng các dung môi như methanol, ethanol và nước.
Sau 30 phút chiết xuất với cường độ 200 vòng/phút và nhiệt độ 40°C, quá trình ly tâm được thực hiện ở 4°C với tốc độ 5000 vòng/phút Sau đó, dịch chiết được lọc lại để thu được dịch chiết trong, có màu hồng phớt nhẹ.
Thí nghiệm 1 tập trung vào việc nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến khả năng trích ly Ba loại dung môi được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm nước (H2O), methanol (CH3OH) 60 độ và ethanol (C2H5OH) 60 độ Để đánh giá hiệu quả của từng dung môi, thí nghiệm được bố trí theo công thức cụ thể nhằm xác định sự khác biệt trong khả năng trích ly của chúng.
Trích ly ở các loại dung môi
Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 1/10 (w/v)
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn loại dung môi tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 1 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo
Trong thí nghiệm 2, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol Thí nghiệm được thiết kế với 4 công thức khác nhau và được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác của kết quả.
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nồng độ dung môi
Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:
Dung môi sử dụng là dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu :1/10 (w/v)
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol
Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, nồng độ dung môi chiết tối ưu đã được lựa chọn Kết quả từ thí nghiệm 2 sẽ được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tỷ lệ dung môi/nguyên liệu phù hợp nhằm đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ này đến khả năng chiết Bố trí thí nghiệm được thực hiện theo công thức đã được xác định.
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Phân tích Chiết ở cùng điều kiện:
Loại dung môi và nồng độ dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1,2 Nhiệt độ tách chiết 40 0 C
Thời gian tách chiết 30 phút
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm polyphenol
Dựa trên kết quả phân tích, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tách chiết tối ưu đã được xác định Kết quả từ thí nghiệm 3 sẽ được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết nhằm đánh giá tác động của thời gian đến khả năng chiết Bố trí thí nghiệm được thực hiện theo công thức thí nghiệm đã được xác định.
Trích ly ở các khoảng thời gian
Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được thời gian chiết tách tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 4 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
Thí nghiệm 5 nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất Để đánh giá tác động của nhiệt độ, chúng tôi đã thiết lập một bố trí thí nghiệm cụ thể nhằm phân tích hiệu quả của quá trình chiết xuất dưới các mức nhiệt độ khác nhau.
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nhiệt độ
Phân tích Chiết ở cùng điều kiện:
Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu, thời gian tách chiết tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3, 4
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được nhiệt độ tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 5 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
3.5.2.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3
Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết bã ổi đào
Sau khi khảo sát các yếu tố, chúng tôi đã xác định ba yếu tố A, B, C là những yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng polyphenol trong bã ổi đào Để đánh giá khả năng ảnh hưởng của chúng, chúng tôi áp dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-Benhken với ba yếu tố và ba cấp độ.
Bảng 3.3 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu
Biến chữ Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1
A Thời gian tách chiết phút 25 35
C Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1/g 5/1 15/1
Ma trận thực nghiệm Box-Behnken bao gồm 17 thí nghiệm, trong đó kết hợp các yếu tố với ba mức độ: +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình) Đặc biệt, có 5 thí nghiệm được lặp lại ở tâm với tất cả các yếu tố ở mức 0 (xem bảng 3.4).
Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng polyphenol của dịch chiết bã ổi đào
A Thời gian B Nhiệt độ C Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Dựa vào kết quả thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho có kết quả hàm lượng polyphenol là cao nhất
3.5.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
3.5.3.1 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và CS
Năm 2002, phương pháp được điều chỉnh với khoảng 30 àl đến 120 àl dịch chiết trộn với nước cất để đạt tổng thể tích 3 ml Sau đó, thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối trong 30 phút Độ hấp thụ quang học được đo ở bước sóng 517 nm bằng máy đo quang phổ, từ đó xác định khả năng khử gốc tự do DPPH theo công thức đã quy định.
- ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết
- ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết
Giá trị IC50 được báo cáo là nồng độ dịch chiết cần thiết để ức chế 50% gốc tự do DPPH trong điều kiện xác định; giá trị IC50 thấp hơn cho thấy hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao hơn Mỗi phân tích được thực hiện ba lần và kết quả cuối cùng là giá trị trung bình.
3.5.3.2 Ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20 So sánh sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng so sánh Duncan
Dữ liệu thu thập được đã được thống kê và xử lý bằng phương pháp bề mặt theo thiết kế thí nghiệm Box-Behnken, với ba biến và ba cấp độ Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm Design-Expert 7.0.