Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định nồng độ NAA và BA tối ưu lên sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi lan kim tuyến; xác định nguồn mẫu (các mô hay cơ quan của lan kim tuyến) phù hợp cho hiệu suất chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Mời các bạn cùng tham khảo.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Đề tài thực hiện từ tháng 2/2017 đến cuối tháng 6/2017
Phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, tọa lạc tại số 2374, Quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh, là địa điểm lý tưởng cho các nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực nông nghiệp.
Vật liệu nghiên cứu
Cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)
Hình 2.1 Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên
Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) của Trunng tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM
2.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Trang thiết bị - dụng cụ
- Ống đong 100mL, ống đong 100mL, pipet 10mL
- Đèn cồn, đĩa cấy, bông thấm
- Máy đo pH, cân điện tử
- Môi trường MS cơ bản
- Các chất kích thích sinh trưởng: NAA, BA
Các thí nghiệm sử dụng môi trường MS với sự bổ sung đường sucrose, agar, và các chất điều hòa sinh trưởng, bao gồm auxine và cytokine, được thực hiện tùy theo từng loại thí nghiệm.
- Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 121 0 C
- pH của môi trường là: 5.6 – 5.8
- Cường độ ánh sáng: 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày
Phương pháp
Chuẩn bị dung dịch mẹ
Môi trường nuôi cấy mô thực vật là một hệ thống phức tạp với nhiều thành phần hóa học ở nồng độ rất nhỏ Để đơn giản hóa quá trình pha chế, người ta thường chuẩn bị các dung dịch mẹ (dung dịch Stock) có độ đậm đặc từ X10 đến X200 Khi cần sử dụng, chỉ cần pha dung dịch Stock với nước cất hai lần hoặc nước vô khoáng theo tỷ lệ phù hợp Dung dịch Stock có thể được bảo quản lâu dài trong tủ lạnh.
Pha môi trường nuôi cấy
- Cho nước cất vào ống đong, sau đó từ các chai dung dịch mẹ đã pha sẵn lần lượt lấy ra đúng số lượng qui định, khuấy đều
- Bổ sung NAA và BA (khảo sát sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi)
- Chỉnh pH 5,6 – 5,8 với NaOH 1N hoặc HCl 1N
- Thêm nước cất vào ống đong đúng với thể tích cần pha và bổ sung 8 g agar
- Khuấy đều và phân phối vào bình thủy tinh với thể tích cần thiết cho mỗi thí nghiệm
- Ghi rõ ngày tháng và tên (ký hiệu) môi trường để tránh nhầm lẫn
- Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy ở 121 o C trong 20 phút, áp suất 1 atm
- Sau khi hấp xong lấy môi trường ra, chuyển môi trường đã hấp khử trùng vào phòng bảo quản môi trường
Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường ở dạng thạch để thuận tiện cho quá trình phát triển Tuy nhiên, việc tạo đông môi trường dễ bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như pH, nồng độ chất tạo đông và nhiệt độ Do đó, cần điều chỉnh các thông số môi trường nuôi cấy cho phù hợp với từng loại cây, đồng thời lựa chọn chất tạo đông thích hợp để hạn chế hư hỏng môi trường nuôi cấy.
2.3.2 Các thao tác trong phòng cấy
- Rửa tay kỹ bằng xà phòng, mặc áo blouse, đeo khẩu trang trước khi vào phòng cấy
- Dùng khăn lau tủ cấy bằng cồn 70 o
- Bật đèn UV để khử trùng tủ cấy trong 30phút Sau khi bật UV xong bật quạt khoảng 15 phút và lau tủ cấy lại bằng cồn 70 o
Dụng cụ như ống nghiệm, đĩa cấy, bình môi trường và bình mẫu cấy cần được xử lý bằng cồn 70° trước khi đưa vào tủ Đồng thời, cồn 96° cũng được phân phối vào ống nghiệm và đèn cồn để đảm bảo vệ sinh và an toàn trong quá trình thí nghiệm.
- Hơ miệng chai cấy thật kỹ trên ngọn lửa đèn cồn trước và sau khi cấy
- Dụng cụ sau mỗi lần cấy phải được đốt lại bằng cồn 96 o
Sử dụng giấy ghi chú để ghi rõ tên môi trường, tên mẫu cấy, ngày cấy chuyền và người thực hiện cấy Bổ sung thêm một lớp thông tin ở miệng chai để dễ dàng theo dõi kết quả và giảm thiểu khả năng nhầm lẫn.
- Đem vào nuôi trong phòng tăng trưởng với những điều kiện thích hợp giúp mẫu cấy phát triển
Sau khi hoàn thành quá trình cấy, hãy lau sạch tủ cấy bằng cồn và dọn dẹp gọn gàng khu vực làm việc Đảm bảo giữ nguyên vị trí của các dụng cụ có trong tủ cấy trước đó Cuối cùng, tắt đèn và quạt trong tủ cấy để duy trì môi trường làm việc an toàn.
Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến
- Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến
- Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
Bố trí thí nghiệm
2.5.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến
Mẫu cấy: Đốt thân cây lan kim tuyến in vitro
- Chọn những mẫu lan kim tuyến in vitro sinh trưởng khỏe mạnh
Sử dụng dao và kẹp đã khử trùng, tiến hành cắt từng đốt thân của hai cây lan kim tuyến, mỗi bình thí nghiệm chứa 5 đốt ở các vị trí khác nhau: đốt phía dưới, đốt giữa thân và đốt gần phần ngọn Đồng thời, loại bỏ các lá, rễ và những phần bị dập nát trước khi cấy mẫu sang môi trường nuôi cấy.
Môi trường: Môi trường MS + 30 g/l Saccharose + 8,0 g/l Agar, nồng độ BA và NAA được bổ sung tùy theo nghiệm thức thí nghiệm, pH = 5.6 - 5.8
Bố trí thí nghiệm được thực hiện với 3 nghiệm thức, áp dụng phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên và có 3 lần lặp lại Mỗi ô thí nghiệm bao gồm 3 bình thủy tinh, mỗi bình chứa 50 ml môi trường.
34 trường và cấy 5 đốt thân lan kim tuyến vào Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện nhiệt độ phòng 22 – 24 0 C, cường độ ánh sáng 2200 – 2500 lux
Bảng 2.1 Khảo sát nồng độ BA và NAA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l)
- Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = Ʃ Số mẫu tạo chồi Ʃ Số mẫu cấy ban đầu x 100
Theo dõi thí nghiệm và thu thập số liệu sau 8 tuần nuôi cấy
2.5.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến
Mẫu cấy: Các chồi in vitro được tạo ra từ thí nghiệm 1
- Sử dụng dao đã khử trùng tách chồi đã tái sinh để tiến hành nhân nhanh sang môi trường cụm
Để nhân giống cây, cần sử dụng chồi sạch bệnh và có sinh trưởng tốt Sử dụng kẹp đã được khử trùng bằng lửa đèn cồn, sau đó để nguội trước khi gắp chồi cho vào môi trường nhân nhanh đã chuẩn bị sẵn.
- Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi
Môi trường: Môi trường MS + 30 g/l Saccharose + 8,0 g/l Agar, nồng độ BA và NAA được bổ sung tùy theo nghiệm thức thí nghiệm, pH = 5.6 – 5.8
Bố trí thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức, được thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Mỗi ô thí nghiệm sử dụng 3 bình thủy tinh, mỗi bình chứa 50 ml môi trường và cấy 3 chồi lan kim tuyến Mẫu cấy được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng 22 độ C.
24 0 C, cường độ ánh sáng 2200 – 2500 lux
Bảng 2.2 Khảo sát nồng độ BA và NAA dùng để nhân nhanh chồi lan kim tuyến
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l)
Theo dõi thí nghiệm và thu thập số liệu sau 8 tuần nuôi cấy
2.5.3 Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Mẫu cấy: Thử nghiệm ở các cơ quan của lan kim tuyến: lá, trên thân, đoạn thân
Vi khuẩn được nuôi cấy từ tủ lạnh sâu ở nhiệt độ -8 °C và được cấy trên môi trường YMB thạch rắn hai lần trong vòng 4 ngày Sau đó, dịch vi khuẩn Agobacterium rhizogenes được sử dụng để lây nhiễm Hai chủng vi khuẩn A rhizogenes, gồm chủng Tr7 và chủng 15834, được mua từ một đại học Mỹ và không mang đoạn gen chuyển gen, mà tấn công trực tiếp vào cơ quan lan kim tuyến để hình thành rễ tóc.
- Sử dụng dao và kẹp đã khử trùng cắt các cơ quan của lan kim tuyến riêng biệt để tiến hành chuyển gen
Sử dụng ống kim tiêm 18G để tạo vết thương trên các cơ quan đã cắt, sau đó tiếp tục dùng đầu kim tiêm để chấm lấy dịch vi khuẩn từ các vết thương đó.
Agobacterium rhizogenes rồi chấm lên bề mặt vết thương của cơ quan
- Cấy các cơ quan của lan kim tuyến vừa mới chuyển gen trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, nuôi trong 7 ngày điều kiện tối
Sau khi kết thúc giai đoạn đồng nuôi cấy, mẫu cấy sẽ được chuyển sang môi trường diệt khuẩn và tái sinh, bao gồm môi trường MS với 30 g/l sucrose và 400 mg/l cefotaxim, được thực hiện trong điều kiện tối.
Mẫu đối chứng là các cơ quan của lan kim tuyến được nuôi cấy trong môi trường không bị nhiễm khuẩn, đồng thời cũng được phát triển trên các môi trường tương tự để đảm bảo tính chính xác trong nghiên cứu.
Môi trường: Môi trường MS + 30 g/l Saccharose + 8,0 g/l Agar, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, pH = 5.6 – 5.8
Bố trí thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức được sắp xếp hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 lần lặp lại Mỗi ô thí nghiệm sử dụng 5 bình thủy tinh, mỗi bình chứa 25 ml môi trường và cấy riêng biệt các cơ quan lan kim tuyến Mẫu cấy được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng từ 22 đến 24 độ C.
Bảng 2.3 Các cơ quan của lan kim tuyến được chuyển gen
Nghiệm thức Cơ quan chuyển gen
NT1 (ĐC) Lá, đoạn thân và thân cây không lây nhiễm vi khuẩn
NT2 Lá lây nhiễm với vi khuẩn
NT3 Đoạn thân lây nhiễm với vi khuẩn
NT4 Thân cây lây nhiễm với vi khuẩn
- Tỷ lệ mẫu tạo rễ tóc (%) = Ʃ Số mẫu tạo rễ tóc Ʃ Số mẫu cấy ban đầu x 100
- Chiều dài của rễ tóc
- Số rễ tóc/cơ quan
Theo dõi khả năng ra rễ sau 4 tuần lây nhiễm
Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm SAS và Microsoft Excel 2010