Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm tối ưu các thông số để thực hiện phản ứng PCR như nồng độ MgCl2, nồng độ primer, nhiệt độ bắt cặp; xác định các thông số của phương pháp: LOD50, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác của phương pháp. Mời các bạn cùng tham khảo.
TỔNG QUAN
Giới thiệu cây trồng biến đổi gen (GMO)
1.1.1 Khái niệm về cây trồng biến đổi gen (GMO)
Sinh vật biến đổi gen (GMO) là những sinh vật có vật liệu di truyền được thay đổi theo ý muốn của con người thông qua công nghệ sinh học hiện đại Công nghệ này, còn được gọi là công nghệ gen hoặc kỹ thuật di truyền, cho phép chuyển các gen từ loài này sang loài khác, bao gồm cả các loài không có liên quan Ngoài ra, sinh vật biến đổi gen cũng có thể xuất hiện do quá trình lan truyền gen tự nhiên, chẳng hạn như lai xa giữa cỏ dại và cây trồng biến đổi gen Một ví dụ điển hình là các dòng lúa mỳ thương mại có gen bị biến đổi từ những năm 1950 nhờ vào tia điện từ hoặc tia phóng xạ.
GMO (Organisms Genetically Modified) thường đề cập đến các sinh vật được chuyển gen từ loài khác, tạo ra những dạng chưa từng tồn tại trong tự nhiên GMC (Cây trồng Biến đổi Gen) là loại cây được tạo ra thông qua các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại, như kỹ thuật di truyền và công nghệ DNA tái tổ hợp, nhằm chuyển một hoặc nhiều gene chọn lọc để phát triển các cây trồng với các tính trạng mong muốn.
Các giống lai truyền thống, hay còn gọi là giống lai, là kết quả của quá trình cải biến di truyền, trong khi giống chuyển gen khác biệt ở chỗ DNA được chọn lọc chính xác dựa trên công nghệ hiện đại để tạo ra các tính trạng mong muốn một cách có kiểm soát Công nghệ gen có thể áp dụng để phát triển khả năng chống chịu với các yếu tố stress phi sinh học như hạn hán, nhiệt độ cao, độ mặn, cũng như các yếu tố stress sinh học như côn trùng và mầm bệnh, nhằm bảo vệ sự phát triển và tồn tại của cây trồng.
Công nghệ này có khả năng cải thiện hàm lượng dinh dưỡng của cây trồng, đặc biệt hữu ích cho các nước đang phát triển.
1.1.2 Lịch sử hình thành cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen ra đời lần đầu tiên vào năm 1982, sử dụng cây thuốc lá kháng kháng sinh Các thử nghiệm trồng cây thuốc lá chống thuốc diệt cỏ đầu tiên diễn ra tại Pháp và Hoa Kỳ vào năm 1986.
Vào năm 1987, Plant Genetic Systems tại Ghent, Bỉ, đã phát triển thành công cây thuốc lá được thiết kế gen di truyền có khả năng chống chịu côn trùng, nhờ vào việc biểu hiện các gen mã hóa protein diệt côn trùng từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), do Marc Van Montagu và Jeff Schell sáng lập Trung Quốc là quốc gia đầu tiên chấp nhận cây công nghiệp chuyển đổi gen, với cây thuốc lá kháng virus được giới thiệu vào năm 1992, nhưng đã rút khỏi thị trường vào năm 1997.
Hình 1.1 Gạo vàng, một loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm
Cà chua FlavrSavr, cây trồng biến đổi gen đầu tiên được phê chuẩn bán tại Mỹ vào năm 1994, nổi bật với thời gian bảo quản lâu hơn so với các loại cà chua thông thường.
Năm 1994, Liên minh châu Âu đã phê chuẩn cây thuốc lá kháng thuốc diệt cỏ bromoxynil Đến năm 1995, khoai tây Bt được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ phê duyệt an toàn, đánh dấu sự ra đời của cây nông sản kháng sâu đầu tiên tại Mỹ.
Năm 1995, Mỹ đã chấp thuận giao dịch các loại cây trồng chuyển đổi gen, bao gồm cải dầu với thành phần chuyển đổi từ Calgene và ngô bắp có vi khuẩn.
Bacillus thuringiensis (Bt) (Ciba-Geigy), bông kháng thuốc diệt cỏ bromoxynil
Tính đến giữa năm 1996, đã có 35 phê chuẩn được cấp cho 8 loại cây công nghiệp biến đổi gen, bao gồm bông kháng côn trùng (Monsanto), đậu nành kháng thuốc diệt cỏ glyphosate (Monsanto), bí kháng virus (Asgrow) và cà chua chín chậm (DNAP, Zeneca/Peto và Monsanto), cùng với 1 loại hoa cẩm chướng.
8 điểm khác nhau tại 6 quốc gia cộng thêm EU
Vào năm 2000, các nhà khoa học lần đầu tiên đã phát triển giống gạo vàng thông qua công nghệ biến đổi gen nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng Giống lúa này, được sản xuất bởi Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), chứa hàm lượng vitamin A cao nhờ vào beta-caroten phong phú Mục tiêu của việc tạo ra gạo vàng là giúp phòng ngừa các bệnh về mắt và tình trạng thiếu hụt vitamin A.
Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam hiện nay
1.2.1 Xu hướng nghiên cứu cây trồng biến đổi gen trên thế giới
1.2.1.1 Cây trồng chống chịu thuốc diệt cỏ
Nhiều cây trồng đã được biến đổi gen để kháng thuốc diệt cỏ phổ biến, giúp chúng phân hủy các thành phần hoạt động trong thuốc, từ đó trở nên vô hại Điều này cho phép nông dân dễ dàng loại bỏ cỏ dại và linh hoạt trong việc phun thuốc Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ cũng giảm thiểu việc làm đất Tuy nhiên, những người phản đối lo ngại rằng việc sử dụng các cây trồng này có thể dẫn đến gia tăng sử dụng thuốc diệt cỏ, kích thích sự kháng thuốc ở cỏ dại và gây hại cho đa dạng sinh học trong nông nghiệp.
Gần đây, hai hệ thống cây trồng kháng thuốc diệt cỏ đã được phát triển cho đậu nành, ngô, củ cải dầu và bông, bao gồm Roundup Ready và Liberty Link Một số sản phẩm thương mại nổi bật trong nhóm này là Đồ án tốt nghiệp.
- GA21 (Giống khảo nghiệm: giống ngô lai NK66 mang gen kháng thuốc trừ cỏ)
Giống khảo nghiệm Bt11xGA21 là giống ngô lai NK66, được phát triển với tổ hợp 2 gen đặc biệt, bao gồm gen kháng sâu bộ cánh vảy và gen kháng thuốc trừ cỏ Giống này được tạo ra bằng phương pháp lai truyền thống.
Các cây trồng có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều loại bệnh do nấm, vi khuẩn, virus và giun tròn Hiện nay, nhiều phương pháp công nghệ cao được đề xuất để bảo vệ thực vật khỏi những tác nhân gây hại này Mặc dù sự chú ý chủ yếu tập trung vào cây trồng chuyển gen kháng virus, nhưng việc ứng dụng công nghệ sinh học để chống lại nấm, vi khuẩn và giun tròn cũng đang nhận được sự quan tâm đáng kể.
Một ví dụ tiêu biểu về cây trồng GM thương mại là cây kháng côn trùng mang gen Bt từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis và đu đủ GM có khả năng kháng virus.
1.2.1.3 Thực vật với thành phần thay đổi
Ngày càng nhiều giống cây trồng chuyển gen mới đang được nghiên cứu và thử nghiệm, với mục tiêu nâng cao giá trị và chất lượng sản phẩm để đáp ứng nhu cầu của ngành công nghiệp và người tiêu dùng.
Thực vật chuyển gen mới với thành phần biến đổi mang lại nhiều lợi ích cho cả ngành công nghiệp và người tiêu dùng Ví dụ, khoai tây với tinh bột biến đổi và các hạt dầu có thể thay thế sản phẩm dầu mỏ đang thu hút sự quan tâm của ngành công nghiệp Người tiêu dùng sẽ hưởng lợi từ thế hệ cây trồng biến đổi gen tiếp theo, như gạo được tăng cường hàm lượng sắt và vitamin A, cũng như dầu thực vật giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim.
1.2.1.4 Cây trồng chống chịu áp lực
Các nhà sinh học thực vật đang áp dụng công nghệ sinh học để cải thiện khả năng thích nghi của cây trồng đối với các thách thức môi trường như hạn hán, độ mặn và nhiệt độ không phù hợp.
Một phương pháp để tạo ra thực vật chịu hạn là chuyển gen từ các loài thực vật có khả năng chịu hạn vào cây trồng Ví dụ, Xerophyta viscosa, một loài thực vật có nguồn gốc từ vùng khô hạn phía nam châu Phi, chứa gen mã hóa một protein đặc biệt trong thành tế bào Các nghiên cứu cho thấy những cây nhận gen này có khả năng chịu đựng áp lực từ hạn hán và độ mặn cao.
Các nghiên cứu cho thấy rằng thực vật có khả năng chịu mặn cao chứa nồng độ glycinebetaine cao, trong khi thực vật chịu mặn trung bình có nồng độ trung bình và thực vật chịu mặn thấp chứa ít hoặc không có glycinebetaine Việc chuyển gen cho khoai tây để sản sinh nhiều glycinebetaine giúp tăng cường khả năng chịu mặn của cây trồng.
Thực vật và vi sinh vật có thể được cải biến để tăng khả năng hấp thu kim loại nặng và phân hủy các sản phẩm dầu
Các biện pháp công nghệ sinh học đang được áp dụng để loại bỏ ô nhiễm môi trường, trong đó thực vật biến đổi gen được cải tiến để tích lũy nồng độ cao các kim loại độc hại Một ví dụ điển hình là cây dương liễu, có khả năng hút cadimi từ đất ô nhiễm, giúp loại bỏ kim loại độc này một cách hiệu quả Rễ cây hấp thu cadimi nhanh chóng và lưu trữ trong gỗ và lá, góp phần làm sạch môi trường Nhiều loại thực vật khác cũng có khả năng hấp thụ một lượng nhỏ kim loại nặng, hỗ trợ quá trình xử lý ô nhiễm.
1.2.2 Tình hình thương mại hóa cây trồng chuyển gen
1.2.2.1 Tình hình thương mại hóa trên thế giới
Tỷ lệ canh tác cây trồng BĐG trong năm 2016 hồi phục lại mức cao với tổng diện tích 185,1 triệu ha trên toàn cầu
Năm 2016, 26 quốc gia đã trồng 185,1 triệu ha cây trồng BĐG, tăng 5,4 triệu ha (3%) so với năm 2015, đánh dấu lần tăng thứ 20 liên tiếp về tỷ lệ canh tác Ngoại trừ sự sụt giảm trong năm 2015, có 12 năm đạt mức tăng trưởng hai con số Cây trồng BĐG không chỉ mang lại lợi ích về sản lượng mà còn cung cấp sự lựa chọn đa dạng hơn cho người tiêu dùng.
Các cây trồng biến đổi gen (BĐG) đã được mở rộng ra ngoài 4 loại chính như ngô, đậu nành, bông và cải dầu, nhằm mang lại nhiều lựa chọn hơn cho người tiêu dùng toàn cầu Những loại cây BĐG mới bao gồm củ cải đường, đu đủ, bí, cà tím và khoai tây, trong đó khoai tây là cây trồng quan trọng thứ tư trên thế giới và cà tím là loại rau phổ biến nhất tại châu Á Giống táo và khoai tây không thâm nâu có thể giúp giảm lãng phí thực phẩm Hơn nữa, các nghiên cứu từ các tổ chức công cộng đã đưa gạo, chuối, khoai tây, lúa mì, đậu hồi, đậu triều, mù tạt và mía đường vào các giai đoạn đánh giá nâng cao, tạo ra nhiều lựa chọn cho người tiêu dùng, đặc biệt là ở các nước đang phát triển.
Các tính trạng và giống cây trồng biến đổi gen (BĐG) mới đang được nghiên cứu và thử nghiệm thực địa nhằm mang lại lợi ích cho nông dân và người tiêu dùng Những giống cây này bao gồm gạo vàng giàu beta-carotene tại Philippines và Bangladesh, chuối BĐG kháng virus tại Uganda, cùng với giống lúa mì BĐG kháng bệnh và chịu hạn tại Úc Ngoài ra, các giống khoai tây kháng bệnh mốc sương tại Uganda và châu Âu, đậu triều và đậu hồi kháng sâu bệnh tại Ấn Độ, cùng với giống mía đường chịu hạn tại Ấn Độ và Indonesia, cũng đang được thử nghiệm Những nghiên cứu này không chỉ góp phần nâng cao năng suất cây trồng mà còn giúp cải thiện chất lượng thực phẩm cho người tiêu dùng.
Diện tích canh tác cây trồng BĐG toàn cầu tăng gần 110 lần, từ 1,7 triệu ha năm
Từ năm 1996 đến 2016, diện tích cây trồng biến đổi gen (BĐG) đã tăng từ 1,7 triệu ha lên 185,1 triệu ha, trở thành công nghệ cây trồng phát triển nhanh nhất hiện nay Tổng diện tích canh tác cây BĐG đạt 2,1 tỷ ha sau 21 năm thương mại hóa, trong đó các quốc gia đang phát triển chiếm 54% tổng diện tích canh tác.
9 tác toàn cầu (99,6 triệu ha); trong khi diện tích này tại các nước công nghiệp chiếm 46% (85,5 triệu ha) [11]
Hình 1.2 Bản đồ diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới 2016 theo
Các phương pháp xác định cây trồng biến đổi gen
1.3.1 Phương pháp sử dụng protein như là đích phân tích
Protein có thể được phát hiện thông qua việc sử dụng các kháng thể đặc thù, thường được tạo ra để nhận diện một loại protein cụ thể Mức độ ái lực của kháng thể đối với protein phụ thuộc vào cấu hình của protein sau khi tách chiết Tính đặc trưng của kháng thể cần được xác minh để đảm bảo không có phản ứng chéo Việc phát hiện sinh vật biến đổi gen thông qua phân tích dòng đặc hiệu bằng định lượng protein sẽ không chính xác nếu có nhiều hơn một sinh vật biến đổi gen biểu hiện cùng một loại protein.
Các phương pháp sàng lọc giúp đánh giá sản phẩm có chứa hay không chứa vật liệu từ sinh vật biến đổi gen dựa trên sự hiện diện của các protein biểu hiện Một số ví dụ về phương pháp sàng lọc bao gồm que thử và ELISA định tính Để định lượng sinh vật biến đổi gen trong một chất nền cụ thể, có thể áp dụng các phương pháp dựa vào protein như ELISA, phù hợp với chất nền cần phân tích Các chất chuẩn có thể được sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn, từ đó xác định hàm lượng protein trong mẫu thử nghiệm.
1.3.2 Phương pháp sử dụng DNA đích Đặc trưng của các phương pháp phân tích sử dụng DNA đích là để xác định sự có mặt của các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, phụ thuộc vào các tính chất cụ thể của trình tự DNA đích Ứng dụng và phân loại khác của tính đặc hiệu như sau:
Phương pháp dựa vào taxon đích giúp xác định các trình tự DNA trong một taxon cụ thể, thường là một loài, nhưng cũng có thể áp dụng cho các cấp phân loại khác Các phương pháp này cho phép đánh giá sự hiện diện, chất lượng và số lượng DNA từ taxon, đồng thời có thể được sử dụng như một tiêu chuẩn để định lượng tương đối vật liệu biến đổi gen Để đảm bảo tính đặc hiệu, cần phải dựa vào các số liệu thực nghiệm.
Phương pháp sàng lọc DNA cho phép phát hiện các trình tự đích trong một số loài, nhưng không phải tất cả các dòng biến nạp Những trình tự này cũng có thể xuất hiện trong nguyên liệu không biến đổi gen, do sự hiện diện của virus và vi khuẩn tự nhiên Các phương pháp này hỗ trợ đánh giá sự hiện diện của sản phẩm chứa nguyên liệu biến đổi gen, ví dụ như sử dụng PCR định tính để phát hiện đoạn khởi động 35S-CaMV.
1.3.3 Một số trình tự DNA đích được áp dụng phương pháp sàng lọc
Trình tự DNA từ đoạn khởi động 35S của virus khảm súp lơ (CaMV) đã được phát hiện, vì promoter này có mặt trong nhiều thực vật biến đổi gen Đoạn DNA dài 195bp trong promoter 35S-CaMV đã được khuếch đại bằng phương pháp PCR và được xác định qua điện di trên gel agarose theo tiêu chuẩn TCVN 7605:2005.
Phát hiện trình tự kết thúc (terminator) trên gen nopalin synthaza (NOS) từ Agrobacterium tumefaciens có thể được áp dụng để sàng lọc sự hiện diện của các thành phần từ thực vật biến đổi gen, do nhiều thực vật biến đổi gen chứa trình tự NOS-terminator Đoạn DNA 118bp trong trình tự kết thúc của NOS đã được khuếch đại bằng phương pháp PCR và được xác định thông qua điện di trên gel agarose, theo tiêu chuẩn TCVN 7605:2005.
Trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động FMV 34S đã được phát hiện ở cây cải dầu GM RT73 Promoter 34S-FMV xuất hiện trong nhiều thực vật biến đổi gen, trong đó có cây cải dầu, đậu nành, khoai tây, bông, cà chua và củ cải Virus mosaic (FMV) là một virus RNA sợi đơn, được xác định là tác nhân gây bệnh rêu mồi trên cây cải dầu, gây ra các triệu chứng như lá úa, biến dạng và khảm hoa văn Promoter FMV có chiều dài 196bp thường được sử dụng để chuyển các gen trong cây cải dầu và đậu nành Một số sự kiện biến đổi gen như RT73 cải dầu, MON1445 và MON1698 đã được phát hiện có liên quan đến promoter 34S-FMV.
Các giống biến đổi gen như MON88913 ở vải, MON89788 ở đậu nành và H7-1 ở củ cải đường đã được phát hiện Tuy nhiên, một số giống khác như đậu nành 40-3-3, MON810, MON863, TC1507, giống ngô Bt11, GA21, NK603 và Bt176 lại không được phát hiện (theo Phụ lục B, ISO 21569:2005/2013).
1.3.4 Giới thiệu chung về phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) được phát minh bởi Kary Mullis và các cộng sự vào năm 1985, đã có ảnh hưởng sâu rộng đến các nghiên cứu sinh học toàn cầu.
Phương pháp PCR là một kỹ thuật invitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt, dựa trên hoạt động của enzyme DNA polymerase Quá trình này diễn ra khi DNA polymerase tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn, với sự hỗ trợ của các mồi - những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn Sau đó, đoạn mồi sẽ được nối dài nhờ hoạt động của DNA polymerase, tạo thành một mạch DNA mới hoàn chỉnh.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành dạng mạch đơn
Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung
Giai đoạn kéo dài chuỗi trong phương pháp PCR là quá trình tổng hợp chuỗi DNA mới tương tự như chuỗi DNA gốc Phương pháp này sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và áp dụng máy giải trình tự tự động để đảm bảo độ chính xác cao trong việc phân tích DNA.
Phương pháp này, được phát triển song song với công nghệ giải trình tự nucleotide, cho phép phát hiện sản phẩm PCR thông qua chất nhuộm huỳnh quang Với hiệu quả cao, phương pháp này hiện đang được áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới.
Hiện nay có nhiều phương pháp PCR cải tiến như nested PCR, PCR đẳng nhiệt, Realtime PCR Đồ án tốt nghiệp
Kỹ thuật Realtime PCR là phương pháp khuếch đại gene và đọc kết quả đồng thời trong cùng một ống mẫu, yêu cầu máy luân nhiệt đặc biệt có khả năng đo cường độ phát huỳnh quang và xử lý dữ liệu Hệ thống Realtime PCR bao gồm máy luân nhiệt kết nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính, cho phép theo dõi lượng DNA hình thành trong suốt quá trình phản ứng Phương pháp này thực hiện đồng thời hai quá trình: nhân bản DNA qua phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành.
Multiplex PCR là kỹ thuật sử dụng nhiều cặp mồi trong một hỗn hợp PCR duy nhất, cho phép khuếch đại nhiều gen đích cùng lúc và tạo ra các bản sao DNA có kích thước khác nhau Phương pháp này giúp thu thập nhiều thông tin từ một lần chạy mà không cần nhiều hóa chất và thời gian Để đạt hiệu quả tối ưu, nhiệt độ gắn mồi cần được điều chỉnh cho từng cặp mồi, nhằm đảm bảo chúng hoạt động chính xác và tạo ra các băng DNA có thể phân biệt bằng mắt thường khi thực hiện điện di.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1 Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại phòng Kiểm nghiệm Sinh học, Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 Địa chỉ: 30 Hàm Nghi, Quận 1, TP Hồ Chí Minh
Thời gian nghiên cứu từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017.
Vật liệu nghiên cứu
Mẫu đối chứng dương do phòng Kiểm nghiệm Sinh học cung cấp được thực hiện để đánh giá phương pháp
Mẫu được thu bên ngoài với 10 nguồn mẫu ngẫu nhiên để phân tích thực nghiệm bằng phương pháp
Kích thước sản phẩm khuếch đại là 196bp
Mồi xuôi FMV-F: 5-AAG CCT CAA CAA GGT CAG-3
Mồi ngược FMV-R: 5-CTG CTC GAT GTT GAC AAG-3
Bảng 2.1 Trình tự mồi có sẵn sử dụng trong nghiên cứu [13]
Gen Bank Trình tự oligonucleotide T m cặp mồi
Kích thước khuếch đại (bp)
FMV AR016589 5-AAG CCT CAA CAA GGT CAG-3
5-CTG CTC GAT GTT GAC AAG-3 52 - 65 196bp
2.2.1.3 Thang DNA Để ước lượng kích thước các đoạn DNA được khuếch đại, trong nghiên cứu này sử dụng loại thang 100bp Ladder Plus (Promega) bao gồm 11 vạch với kích thước như: Đồ án tốt nghiệp
Hình 2.1 Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus
2.2.1.4 Mẫu chuẩn GMO, chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
Mẫu chuẩn dương GMO là mẫu chính được sử dụng trong nghiên cứu và làm đối chứng dương Ngoài ra, các vi sinh vật gây bệnh lây truyền qua thực phẩm cũng được áp dụng để đánh giá hiệu lực sơ cấp của phương pháp, nhằm khẳng định độ đặc hiệu và tính chọn lọc của cặp mồi đã được chọn.
Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật
STT Tính thuần của chủng Tên chủng Nguồn gốc Số lượng Ký hiệu
Chứng dương GMO MON89788 01 GMO
4 Virus gây bệnh đốm trắng Kit IQ2000 01 WSSV
5 Virus gây bệnh đầu vàng Kit IQ2000 01 YHV
7 Vibrio parahaemotilycus ATCC 17802 01 V.para Đồ án tốt nghiệp
*ATCC là chủng vi sinh vật chuẩn
Kit IQ2000, do hãng GeneReach Biotechnology Corp (Đài Loan) cung cấp, là bộ kit phát hiện virus gây bệnh trên tôm và cá, bao gồm virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) và virus gây bệnh đầu vàng (YHV).
2.2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
- Buffer phản ứng (5X Colorless GoTaq Flexi Buffer)
- dNTP thành phần (PCR Nucleotide Mix)
- Đệm TAE 1X (4,48g Tris; 2ml Na 2 EDTA 0,5M pH 8; 1,14ml glacial acetic acid; nước cất đủ 1000ml)
- Agarose phân tích sản phẩm sau phản ứng PCR
- Dung dịch nạp mẫu Blue/Orange Loading Dye 6X, thuốc nhuộm Dynamid Nucleotid Dye 6X Đồ án tốt nghiệp
- Bộ Kit TaKaRa EX Taq
2.2.2.2 Dụng cụ và thiết bị
- Tủ bảo quản hóa chất 2 - 8ºC
- Tủ bảo quản chủng -30ºC
- Tủ an toàn sinh học Nuve MN120
- Máy PCR (Applied Biosystems ABI 2720 Thermal Cycler)
- Bộ điện di DNA liền nguồn Mupid-eXU
- Bộ chụp ảnh điện di (ATTO) và Video Graphic Printer
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu được thu và cắt đủ lượng tách chiết và đựng trong các ống falcon, lưu trữ trong tủ lạnh -30ºC
2.3.2 Phương pháp bảo quản mẫu
Mẫu dư sau khi phân tích được bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4ºC hoặc bảo quản trong cồn
2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA
The SureFood PREP Basic Kit (Art No S1052) is designed for efficient DNA extraction, utilizing key components such as Proteinase K, lysis buffer, and binding buffer to ensure optimal results.
22 rửa 1 (Pre-Wash buffer), đệm rửa 2 (Wash buffer), đệm ly giải DNA (Elution buffer)
Bảng 2.3 Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA
Hóa chất Tác dụng Đệm ly giải
(Lysis buffer) Dung dịch đệm phá vỡ cấu trúc tế bào
Proteinase K Thủy phân protein, đặc biệt là protein liên kết với DNA Đệm gắn kết
(Binding buffer) Thu acid nucleic Đệm rửa 1
(Pre-Wash buffer) Rửa sản phẩm không mong muốn Đệm rửa 2
(Wash buffer) Rửa sạch sản phẩm tạp còn lại Đệm ly giải DNA
Tủa protein, đẩy lipit lên bề mặt dung dịch, tạo thuận lợi cho việc thu nhận DNA
2.3.3.2 Cách thực hiện tách chiết
Bước 1: Chuẩn bị 50mg mẫu sau đó thêm vào 400l đệm ly giải và 20l Proteinase K
Bước 2: Đem mẫu đi ủ ở nhiệt độ 65ºC trong thời gian 30 phút, ly tâm 12000 vòng/phút
Bước 3: Bỏ cặn thu dịch DNA, sử dụng cột lọc Receiver Tube tiếp tục ly tâm
Bước 4: Bổ sung 200l đệm gắn kết ly tâm 12000 vòng/phút bỏ dịch thu lại cột lọc
Bước 5: Thờm 550àl đệm rửa 1 rửa lần một, ly tõm 12000 vũng/phỳt
Bước 6: Thêm 550l đệm rửa 2 rửa lần hai, ly tâm 12000 vòng/phút loại bỏ nước Đồ án tốt nghiệp
Bước 7: Ủ 100l đệm ly giải DNA ở 65ºC, giữ ở nhiệt độ này Cho vào cột lọc ly tâm 10000 vòng/phút thu dịch DNA
2.3.3.3 Quy trình chung tách và tinh sạch DNA bằng Kit SureFood PREP Basic
Hình 2.2 Quy trình tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic
- Cần ủ 100àl đệm ly giải DNA ở nhiệt độ 65ºC trước khi tỏch chiết DNA
- Bật máy heat nhiệt (gia nhiệt) trước khi tách chiết
- Lấy Proteinase K trong tủ đông khi sử dụng, tránh để môi trường ngoài Đồ án tốt nghiệp
2.3.3.4 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích
Mẫu DNA ly trích được điện di trên gel Agarose 1% trong dung dịch đệm TBE1X ở hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 400mA trong 30 phút
Sau khi hoàn thành quá trình điện di, gel sẽ được đưa vào máy chụp ảnh DNA, nơi Diamond Dye gắn kết với DNA phát quang dưới tia UV, tạo ra các vạch trên gel Để đánh giá độ tinh khiết của mẫu ly trích, tỷ lệ OD260nm/OD280nm được tính toán Mẫu được coi là sạch khi tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 - 2,0; nếu tỷ lệ thấp hơn 1,8, mẫu có thể bị nhiễm protein nhiều, trong khi tỷ lệ trên 2,0 cho thấy cần pha loãng mẫu và đo lại giá trị OD.
Kỹ thuật PCR, được phát minh bởi nhà khoa học Mỹ Kary Mullis cùng cộng sự vào năm 1985, đã mang lại cho ông giải Nobel Hóa học năm 1993.
PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử dùng để khuếch đại một đoạn DNA cụ thể trong ống nghiệm, nhờ enzyme Taq polymerase, từ một lượng DNA mẫu rất nhỏ Phương pháp này cho phép tạo ra hàng triệu đoạn DNA đồng nhất và đặc hiệu, mang lại hiệu quả cao trong nghiên cứu và ứng dụng.
2.3.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR
Mẫu DNA có thể được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu thông qua các phương pháp đa dạng Cụ thể, DNA thực vật thường được chiết xuất từ mô lá, trong khi DNA động vật thường được lấy từ máu, lông hoặc mô.
Trong kỹ thuật PCR, mặc dù yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không quá cao, nhưng để đạt được kết quả tối ưu, việc sử dụng DNA mẫu thật sự tinh khiết là rất quan trọng.
Để thực hiện một phản ứng PCR, cần khoảng 5 - 10 ng DNA Nồng độ DNA có thể được xác định bằng cách đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo một công thức cụ thể.
- 1 OD 260nm = 50 ng/àl (đối với DNA sợi kộp) Đồ án tốt nghiệp
- 1 OD 280nm = 40 ng/àl (đối với DNA sợi đơn)
PCR là một phương pháp khuếch đại DNA sử dụng một cặp primer đặc hiệu, bao gồm F-primer (mồi xuôi) và R-primer (mồi ngược), để liên kết với đoạn nucleotide có trình tự cụ thể.
Cặp primer sẽ quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR, nếu primer được thiết kế đúng thì đoạn DNA đích mới được khuếch đại chính xác
dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP):
Nồng độ dNTPs thường được sử dụng trong phản ứng PCR là từ 20 đến 200 µM Nồng độ cao hơn có thể gây ức chế phản ứng, trong khi sự cân bằng giữa các thành phần dNTPs cũng rất quan trọng Thông thường, nồng độ của các dNTPs được duy trì đồng đều Sự mất cân bằng trong thành phần này có thể dẫn đến việc tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.
Nồng độ dNTPs thích hợp cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ
Nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số chu kỳ phản ứng và chiều dài sản phẩm khuếch đại đều ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng Do đó, nồng độ dNTPs tối ưu cho từng phản ứng cần được xác định thông qua thực nghiệm.
Tạo môi trường tối ưu nhất cho Taq polymerase hoạt động
Trước khi phát hiện Taq polymerase, DNA polymerase phải được thêm vào từng chu kỳ nhân bản vì nó không chịu được nhiệt độ trên 90ºC trong giai đoạn biến tính của DNA Năm 1988, Taq polymerase, một loại DNA polymerase bền nhiệt được chiết xuất từ vi khuẩn Thermus aquaticus, đã được phát hiện Enzyme này cho phép chỉ cần bổ sung một lần duy nhất trong quá trình nhân bản DNA.
Nồng độ Taq polymerase thường được sử dụng trong khoảng 0,1 - 0,5 đơn vị/100µl dung dịch phản ứng Sử dụng nồng độ quá cao có thể dẫn đến sự hình thành các sản phẩm không mong muốn.
26 thể xuất hiện làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn
Trong phản ứng PCR, Taq polymerase có xu hướng thêm nucleotide loại A vào đầu 3’ của sản phẩm, điều này rất quan trọng cho quá trình tạo dòng (TA-cloning) và sẽ bị loại bỏ nếu gắn kết xảy ra ở đầu bằng (blunt end ligation) Hơn nữa, hoạt tính của Taq polymerase có thể được cải thiện khi kết hợp với các enzyme khác như Tli hoặc Pfu.
Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động
2.3.4.3 Nguyên tắc của phản ứng PCR
Phản ứng PCR thường trải qua 35 - 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ bao gồm ba bước chính: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi) và extension (kéo dài) Trong giai đoạn denature, nhiệt độ được duy trì từ 94 - 98ºC trong khoảng 40 - 60 giây, tùy thuộc vào độ dài của DNA mẫu Bước này giúp biến tính DNA từ dạng sợi kép thành sợi đơn bằng cách phá vỡ các liên kết hydro dưới tác dụng của nhiệt độ.
Giai đoạn annealing, diễn ra ở nhiệt độ 50 - 60ºC trong 30 giây, là bước quan trọng để gắn mồi đặc hiệu vào sợi DNA đích ở dạng sợi đơn Nhiệt độ gắn mồi sẽ thay đổi tùy thuộc vào độ dài của từng cặp primer.
Xác nhận hiệu lực phương pháp phân tích GMO bằng kỹ thuật PCR
Mục tiêu của khảo sát là đánh giá và xác định đầy đủ các thông số kỹ thuật của phương pháp định tính được phát triển trong nghiên cứu này.
Giới hạn phát hiện (LOD 50 )
Tỷ lệ âm tính giả
Tỷ lệ dương tính giả
Các thông số kỹ thuật được xác định theo hướng dẫn xác nhận hiệu lực phương pháp định tính vi sinh vật tại ISO/TS 16140:2003 và sổ tay hướng dẫn tính toán các thông số xác nhận giá trị sử dụng phương pháp sinh học phân tử do Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm Thủy sản thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam ban hành.
LOD (lượng tối thiểu) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được trong mẫu thử mà không cần định lượng, được xác nhận qua các thử nghiệm hợp lệ LOD50 là lượng tối thiểu mà phương pháp có khả năng phát hiện 50% chất cần phân tích Độ chính xác phản ánh mức độ gần nhau giữa kết quả thử nghiệm và giá trị quy chiếu được chấp nhận Độ nhạy (sensitivity) thể hiện sự thay đổi kết quả tương ứng với sự thay đổi nồng độ trong đồ thị chuẩn Độ đặc hiệu (specificity) hay tỷ lệ âm tính thật được tính bằng thương số giữa số trường hợp âm tính và tổng số trường hợp âm tính.
Giá trị tiên đoán dương (PPV) là tỷ lệ giữa số trường hợp dương tính thực sự (d) và tổng số trường hợp dương tính trên kết quả xét nghiệm (b + d) PPV giúp đánh giá độ chính xác của một xét nghiệm trong việc phát hiện các trường hợp dương tính.
Giá trị tiên đoán âm (NPV) được tính bằng cách chia số trường hợp âm tính thực sự (a) cho tổng số trường hợp có kết quả âm tính (a+c) NPV cho biết độ chính xác của một xét nghiệm khi cho kết quả âm tính, giúp đánh giá hiệu quả của phương pháp chẩn đoán.
Bố trí thí nghiệm
Sử dụng mẫu bột thô làm đối chứng dương cho sự kiện FMV, tiến hành tách chiết theo quy trình của SureFood PREP Basic DNA sau khi tách chiết được bảo quản ở nhiệt độ -30ºC.
Mẫu DNA được ly trích và điện di trên gel agarose 2% bằng bộ điện di BIO-RAD trong dung dịch đệm TBE 1X với hiệu điện thế 100V và cường độ dòng điện 400mA trong 35 phút Sau khi điện di, gel được chụp ảnh để kiểm tra sản phẩm Nếu nồng độ DNA quá cao, mẫu sẽ được pha loãng bằng TE và tiến hành kiểm tra lại bằng điện di.
2.5.2 Khảo sát tối ưu hóa phản ứng PCR
2.5.2.1 Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi
Khảo sát này nhằm khẳng định tính chuyên biệt của cặp mồi bằng cách thực hiện phản ứng với 9 mẫu tách chiết DNA từ các chủng vi sinh vật khác nhau, cùng với 1 mẫu dương GMO của FMV và 1 mẫu đối chứng trắng không chứa khuôn DNA.
2.5.2.2 Tối ưu hóa nồng độ MgCl 2 và nồng độ mồi
Với thí nghiệm này, sử dụng bộ Kit thành phần của TaKaRa EX Taq cho phép khảo sát nồng độ MgCl 2 tại các mức 1,0 - 1,2 - 1,5 - 1,8 - 2,0
Để tối ưu hóa đồng thời nồng độ MgCl2 và mồi trong phản ứng PCR, cần tiến hành pha mastermix cho 20 ống phản ứng, mỗi ống chứa một nồng độ khác nhau của MgCl2 và mồi.
Kết quả thí nghiệm được phân tích thông qua hình ảnh từ bảng gel điện di, dựa vào sự hiện diện, độ sáng và vạch đặc trưng của sản phẩm có kích thước 196bp Từ đó, xác định được các thông số liên quan đến MgCl2 và mồi trong Đồ án tốt nghiệp.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tối ưu hóa 33 điều kiện cho phản ứng PCR, với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Kết quả cho thấy sự ảnh hưởng của nồng độ mồi và nồng độ MgCl2, được tổng hợp chi tiết trong Bảng 2.6.
Bảng 2.6 Khảo sát đồng thời nồng độ MgCl 2 và nồng độ mồi tối ưu trong thành phần phản ứng PCR
Khảo sát tối ưu 2 mục tiêu
Chương trỡnh phản ứng Bảng 2.4 và thành phần cho một phản ứng PCR 25àl ở bảng 2.4
Nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 55ºC, giúp tăng cường khả năng bắt cặp giữa primer và mạch khuôn DNA Tuy nhiên, nhiệt độ này cũng dẫn đến độ chuyên biệt thấp, dễ gây ra sự xuất hiện của các vạch không mong muốn.
Thang điểm đánh giá trong bảng khảo sát tối ưu cho nồng độ mồi và nồng độ MgCl 2 lên phản ứng PCR như sau:
- Không có vạch sản phẩm mục tiêu: (-)
- Độ sáng rõ của vạch sản phẩm mục tiêu:
- Có vạch sản phẩm mục tiêu và có vạch tạp: (*)
2.5.2.3 Tối ưu hóa nhiệt độ phản ứng
Với thí nghiệm này thì chúng tôi sẽ thử nghiệm nhiều mức nhiệt độ khác nhau trên cùng một cặp mồi với nồng độ MgCl 2 đã tối ưu
Tiến hành pha Master mix để khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu Thực hiện khảo sát các mức nhiệt độ 55ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC, 65ºC
Bảng 2.7 Chương trình chu kỳ nhiệt của phản ứng Đồ án tốt nghiệp
Bước Số chu kì Nhiệt độ (ºC) Thời gian (giây)
Trong thí nghiệm này, nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi sẽ được giữ cố định dựa trên kết quả của thí nghiệm trước đó Mỗi nhiệt độ sẽ được khảo sát lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
2.5.3 Đánh giá các thông số kĩ thuật phương pháp
2.5.3.1 Xác định giới hạn phát hiện (LOD50)
Dịch chuẩn mẫu trong ống chứa ban đầu có khoảng 5% GMO về khối lượng Tiến hành chuẩn bị dãy nồng độ pha loãng nhị phân từ ống chứa dịch chuẩn ban đầu Mẫu nền cho thí nghiệm được sử dụng là mẫu âm tính với GMO, với 10 lần lặp lại cho mỗi độ pha loãng nhằm xác định tỷ lệ phát hiện mật độ cho kết quả dương tính của phương pháp đã xây dựng Kết quả sẽ được tính theo công thức Spearman-Karber: log(LOD50) = L - d(∑Pi – 0,5) = m.
LOD50 = 10m Với độ tin cậy 95%, LOD50 nằm trong khoảng:
LOD50: Giới hạn phát hiện của phương pháp
L: Log của nồng độ GMO thấp nhất mà tại đó 100% số lần lặp lại cho kết quả dương tính d: Hệ số của nồng độ pha loãng (d = 2)
Pi: Tỉ lệ mẫu cho kết quả phát hiện dương tính trong khoảng (50% ≤ Pi ≤ 100%) tương ứng với nồng độ pha loãng thứ i Đồ án tốt nghiệp
Um : ước lượng sai số của m, với Um = d 2 ∑(Pi(1- Pi)/(n-1)) n: Số lần lặp lại đối với nồng độ pha loãng thứ i (n = 10)
2.5.3.2 Độ chính xác Độ chính xác là mức độ tương đồng giữa 2 kết quả thử nghiệm thu được bằng phương pháp cần thẩm duyệt và phương pháp tham chiếu trên cùng một mẫu đã được đồng nhất
Để đảm bảo tính chính xác trong phân tích, số mẫu tối thiểu cần sử dụng là 60, trong đó phải có ít nhất 20 kết quả dương tính và 20 kết quả âm tính được phân tích bằng phương pháp tham chiếu Mỗi mẫu cần được phân tích bằng cả hai phương pháp: phương pháp tham chiếu và phương pháp cần thẩm duyệt.
Nguyên tắc chung trong nghiên cứu vi sinh vật bao gồm việc sử dụng hai dòng vi sinh vật: dòng mục tiêu và dòng không phải mục tiêu, với ba nồng độ cấy khác nhau Cụ thể, L0 là mẫu chứng âm, L1 là mẫu chứa dòng mục tiêu, và L2 là mẫu chứa dòng không phải mục tiêu với nồng độ gấp 10 đến 100 lần dòng mục tiêu Độ chính xác được tính bằng công thức: Độ chính xác (%) = (d c b a d a).
2.5.3.3 Độ nhạy Độ nhạy là khả năng phát hiện ra vi sinh vật đích của phương pháp cần thẩm duyệt so với phương pháp tiêu chuẩn hoặc so mẫu dương tính biết trước
Việc tính toán được thực hiện bằng cách dùng các dữ liệu thu được khi đo độ chính xác sau khi khẳng định Độ nhạy (%) SE = a a c
Giá trị chấp nhận được là > 95%
Bảng 2.8 So sánh kết quả thử khẳng định
Kết quả chuẩn bị mẫu
Kết quả âm tính (-/ ) Đồ án tốt nghiệp
36 thẩm duyệt Kết quả dương tính ( /+) +/+ (a) -/+ (b)
Khả năng không phát hiện vi sinh vật đích bằng phương pháp cần thẩm duyệt xảy ra khi chúng không được xác định qua phương pháp tham chiếu hoặc so với mẫu âm tính đã biết.
Giá trị chấp nhận được là > 95% Độ đặc hiệu (%) ) (
2.5.3.5 Tỷ lệ Âm tính giả (False negative) và Dương tính giả (False positive) Âm tính giả (FN) là kết quả khi phân tích một mẫu chắc chắn chứa vi sinh vật mục tiêu của phương pháp nhưng kết quả của phương pháp đó cho âm tính
Cải tiến phương pháp
Sau khi hoàn thành các bước khảo sát và tối ưu cho phản ứng ứng PCR Chúng tôi thử nghiệm cải tiến phương pháp bằng phản ứng Realtime – PCR
Chỳng tụi sử dụng bộ kit GoTaqđ qPCR Master Mix, mỗi phản ứng cú 25àl và thành phần phản ứng như bảng 2.8
Bảng 2.9 Thành phần hóa chất phản ứng Realtime - PCR Đồ án tốt nghiệp
Tờn húa chất Thể tớch hỳt (à)
Bảng 2.10 Chương trình phản ứng Realtime - PCR
Bước Nhiệt độ Thời gian
3 60 1 phút Đo phát quang sau mỗi lần kéo dài (bước 3), chạy với 45 chu kì ở bước 2, 3
Khảo sát mẫu thị trường
Sau khi hoàn thiện và đánh giá phương pháp, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra 10 mẫu thực phẩm từ các cây trồng biến đổi gen trên toàn cầu, bao gồm cà chua, khoai tây, cám gia cầm, ngô, gạo, đậu nành, bột bắp và bột khô Các mẫu này được thu thập từ Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 và các chợ tại thành phố Hồ Chí Minh.