1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của một số Lactobacillus spp. và ứng dụng trong bảo quản hạt cà phê

80 43 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 80
Dung lượng 2,56 MB

Cấu trúc

  • TrangBia

  • NguyenPhuongUyen_13DSH01

    • DANH MỤC VIẾT TẮT

    • DANH MỤC HÌNH ẢNH

    • DANH MỤC BẢNG

    • MỞ ĐẦU

      • 1. Tính cấp thiết của đề tài

      • 2. Tình hình nghiên cứu

      • 3. Mục đích nghiên cứu

      • 4. Mục tiêu nghiên cứu

      • 5. Nội dung nghiên cứu

      • 6. Phương pháp nghiên cứu

        • 6.1 Phương pháp luận

        • 6.2 Phương pháp xử lý số liệu

      • 7. Kết quả đạt được

    • CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

      • 1.1 Tổng quan về nấm sợi

        • 1.1.1 Giới thiệu chung

        • 1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra

          • 1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố

    • Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố

      • 1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin

      • 1.1.2.3 Độc tố Patulin

      • 1.1.2.4 Độc tố Fumonisin

      • 1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố

        • 1.1.3.1 Phương pháp vật lý học

        • 1.1.3.2 Phương pháp hoá học

        • 1.1.3.3 Phương pháp sinh học

    • Bảng 1.1 Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn

      • 1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic

        • 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic

          • 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus

          • 1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

        • 1.2.2 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn

          • 1.2.2.1 Bacteriocins

    • Bảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M. P. Zacharof, 2012)

      • 1.2.2.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác

    • Bảng 1.3 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB. (Holzapfel và cộng sự, 1995)

      • 1.2.3 Khả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic

        • 1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic

    • Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998)

      • 1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

      • 1.3 Tác hại của nấm mốc lên hạt cà phê

      • 1.5 Chế biến và bảo quản hạt cà phê truyền thống

        • 1.5.1 Các phương pháp bảo quản cà phê thóc:

        • 1.5.2 Các phương pháp bảo quản cà phê nhân:

      • 1.6 Bảo quản hạt cà phê bằng vi sinh vật

    • CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

      • 2.1 Địa điểm nghiên cứu

      • 2.2 Thời gian thực hiện

      • 2.3 Vật liệu nghiên cứu

        • 2.3.1 Vật liệu

        • 2.3.2 Hóa chất và môi trường sử dụng

          • 2.3.2.1 Hóa chất

          • 2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy

      • 2.4. Thiết bị và dụng cụ

        • 2.4.1. Thiết bị

        • 2.4.2. Dụng cụ

      • 2.5 Phương pháp luận

        • 2.5.1 Mục tiêu đồ án

        • 2.5.2 Nội dung

      • 2.6 Phương pháp nghiên cứu

        • 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu

        • 2.6.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.

          • 2.6.2.1 Nhuộm gram:

          • 2.6.2.2 Thử nghiệm Catalase:

          • 2.6.2.3 Xác định hàm lượng acid tổng:

        • 2.6.3 Khảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2

        • 2.6.4 Xây dựng đường chuẩn tế bào của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2

        • 2.6.5 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp. với chủng nấm Aspergillus sp. HCP2

        • 2.6.6 Ứng dụng dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp. trong đối kháng nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 bảo quản hạt cà phê

    • CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

      • 3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic

        • 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc

    • Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc các chủng Lactobacillus spp.

    • trên môi trường MRS Agar

      • 3.1.2 Nhuộm Gram

    • Hình 3.2 Tế bào Bacillus spp bắt màu tím, Gram dương (A)

    • Tế bào E. coli bắt màu hồng, Gram âm (B)

    • Hình 3.3 Chủng Lactobacillus sp. L3 bắt màu tím, Gram dương

      • 3.1.3 Thử nghiệm catalase

    • Hình 3.4 Chủng vi khuẩn Bacillus spp. phản ứng dương tính với catalase, bên trái – Chủng Lactobacillus spp. âm tính với catalase, bên phải (A)

    • Đối chứng là nước cất phản ứng âm tính với catalase, bên trái - Chủng Lactobacillus spp. âm tính với catalase, bên phải (B)

      • 3.1.4 Xác định hàm lượng acid tổng

    • Hình 3.5 Acid lactic (%) của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L3 theo thời gian

    • Bảng 3.1 Acid lactic (%) và giá trị OD ở bước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp.

    • Hình 3.6 Acid lactic (%) và giá trị OD ở bước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp.

      • 3.2 Khảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2

    • Hình 3.7 Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2

    • trên môi trường MRS Agar cải tiến

      • 3.3 Xây dựng đường chuẩn tế bào của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2

    • Bảng 3.2 Số liệu dựng đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp. HCP2

    • Hình 3.8 Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp. HCP2

      • 3.4 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp. với chủng nấm Aspergillus sp. HCP2

    • Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 của các chủng Lactobacillus spp.

    • Hình 3.9 Khả năng đối kháng trực tiếp bằng phương pháp cấy hai đường của các chủng Lactobacillus spp. với chủng nấm Aspergillus sp. HCP2

      • 3.6 Ứng dụng dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp. trong đối kháng nấm Aspergillus sp. HCP2 bảo quản hạt cà phê

    • Bảng 3.4 Khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp. với chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 (nhiễm 102 bt/g hạt cà phê)

    • Hình 3.10 Khả năng đối kháng của các chủng Lactobacillus spp. với chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 khi sử dụng dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt

    • Hình 3.11 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14 (từ trái qua phải)

    • Các nghiệm thức: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 không gia nhiệt (từ trên xuống dưới)

    • Bảng 3.5 Khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp. gia nhiệt 80oC trong 15 phút với chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 (nhiễm 102 bt/g)

    • Hình 3.12 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14(từ trái qua phải)

    • Các nghiệm thức: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 gia nhiệt ở 80oC trong 15 phút (từ trên xuống dưới)

    • Hình 3.13 Khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy gia nhiệt và không gia nhiệt các chủng Lactobacillus spp. với chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 theo dõi qua từng ngày

    • CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

      • 1. Kết luận

      • 2. Kiến nghị

    • TÀI LIỆU THAM KHẢO

    • PHỤ LỤC

Nội dung

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng Lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống và thử ứng dụng chúng bảo quản hạt cà phê. Mời các bạn cùng tham khảo.

T ı́ nh c ấ p thi ế t c ủa đề t à i

Vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề xã hội cấp bách cần giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người Ở Việt Nam, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm và độ ẩm cao tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển, gây nhiễm độc thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gia súc, có thể dẫn đến tổn thương gan và ung thư gan Theo báo cáo của Bộ Nông Nghiệp Mỹ (2009), tình trạng phơi nhiễm nấm mốc ảnh hưởng đến 25% mùa màng toàn cầu, gây thiệt hại trung bình 418 triệu đô la và ảnh hưởng đến gia súc 472 triệu đô la mỗi năm Tại Việt Nam, mỗi năm có khoảng 13 – 16% lượng nông sản bị ảnh hưởng tùy loại.

Trước thực trạng nấm bệnh ngày càng gia tăng, con người đã và luôn tìm kiếm những hoạt chất sinh học có tác dụng kháng nấm mà không gây hại cho cơ thể Một trong những chủng vi khuẩn được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất là các chủng sinh acid lactic Vi khuẩn này không chỉ an toàn mà còn có khả năng tiêu diệt vi sinh vật gây hại, đồng thời là nguồn vi sinh vật hữu ích giúp duy trì hệ cân bằng vi khuẩn đường ruột.

Lợi ích của vi khuẩn lactic trong việc kháng nấm aflatoxin và vấn đề ngộ độc thực phẩm do nấm mốc gây ra hàng năm đã thúc đẩy chúng tôi thực hiện đề tài "Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của một số Lactobacillus spp và ứng dụng trong bảo quản hạt cà phê."

Tình hình nghiên c ứ u

Trên thế giới, có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm do vi khuẩn sinh acid lactic tạo thành, chẳng hạn như:

- Năm 2005, Johan Schnürer và Jesper Magnusson đã thực hiê ̣n nghiên cứu “Sự kháng nấm ở vi khuẩn lactic là chất bảo quản sinh ho ̣c”

- “Tiềm năng kháng nấm ở thực phẩm của vi khuẩn lactic” vào năm 2007 của S Rouse cùng cô ̣ng sự

Vào năm 2008, Rosalia Trias cùng các cộng sự đã công bố nghiên cứu quan trọng về vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ trái cây và rau củ, chứng minh rằng chúng có khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh nấm và vi khuẩn trên cây trồng Nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng vi khuẩn lactic trong nông nghiệp, giúp bảo vệ cây trồng một cách tự nhiên và hiệu quả.

Nghiên cứu của Nevena Blagojev và cộng sự (2011) đã chỉ ra khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc và sản sinh độc tố mycotoxin bằng hợp chất của vi khuẩn lactic Tại Việt Nam, có nhiều công trình nghiên cứu liên quan, như chế phẩm EM được sử dụng để bảo vệ cây trồng và ứng dụng trong thuỷ sản, cùng với chế phẩm Sadi Bio 1, một sản phẩm vi sinh Biomix.

Sagi Bio-1, một sản phẩm của Viện Công nghệ Môi trường Việt Nam, được sản xuất từ vi sinh vật Streptomyces ưa ấm, nổi bật với khả năng tổng hợp enzym ngoại bào và sinh kháng sinh để ức chế nấm mốc cùng vi khuẩn Gram âm Bên cạnh đó, sản phẩm còn chứa vi khuẩn Lactobacillus, giúp ngăn chặn các vi khuẩn gây bệnh hiệu quả Chế phẩm sinh học này không chỉ xử lý mùi hôi trong chuồng trại chăn nuôi mà còn hiệu quả trong việc xử lý bãi chôn lấp chất thải.

M ục đích nghiên cứ u

Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt từ vi khuẩn lên men lactic.

M ụ c tiêu nghiên c ứ u

Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng Lactobacillus spp được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống cho thấy tiềm năng ứng dụng của chúng trong việc bảo quản hạt cà phê Nghiên cứu này không chỉ làm nổi bật vai trò của Lactobacillus spp trong việc chống lại nấm mà còn mở ra hướng đi mới cho việc bảo quản nông sản Việc sử dụng các vi khuẩn này có thể giúp nâng cao chất lượng và thời gian bảo quản hạt cà phê, đồng thời giảm thiểu sự phụ thuộc vào hóa chất bảo quản.

N ộ i dung nghiên c ứ u

Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp Khảo sát sự phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp HCP2

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm

3 Ứng dụng dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp trong bảo quản ha ̣t cà phê.

Phương pháp nghiên cứ u

Phương pháp luận

Nghiên cứu về khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic đối với nấm gây hư hỏng thực phẩm và sinh độc tố đã dẫn đến việc tìm hiểu các tác nhân ức chế nấm nhiễm thực phẩm Sau khi xác định rằng các tác nhân này là hợp chất thứ cấp, quá trình trích ly hoạt chất sẽ được thực hiện để ứng dụng trong việc bảo quản đậu phộng đã bị nhiễm nấm mốc.

Phương pháp xử lý số liệu

Phần mềm Excel để vẽ đồ thị

Phần mềm thống kê SAS 9.4.

K ế t qu ả đạt đượ c

Xác định khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp đối với chủng nấm mốc Aspergillus spp HCP2 phân lập từ hạt cà phê

Xác định được thời gian sinh hợp chất thứ cấp tốt nhất của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus spp được nuôi cấy trên môi trường MRS Agar cải tiến đã cho thấy hiệu quả trong việc ứng dụng các sản phẩm khác nhau của vi khuẩn này Việc sử dụng Lactobacillus spp trong bảo quản hạt cà phê không chỉ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn kéo dài thời gian bảo quản, mang lại lợi ích cho ngành công nghiệp cà phê.

TỔ NG QUAN

Tổng quan về nấm sợi

Nấm, hay còn gọi là Fungi, là một giới trong năm giới phân loại theo R.H Whittaker (1996) và thuộc ngành nấm (Euphycophyta), được nghiên cứu trong lĩnh vực nấm học (Mycology) Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, bao gồm đất, nước, không khí và chuồng nuôi, và đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì vòng tuần hoàn vật chất, nhờ khả năng phân giải các hợp chất như cellulose, protein, lipid và chitin.

Vi nấm (Micro fungi) là các loại nấm không có mũ nấm và có thể quan sát bằng mắt thường Chúng được phân loại thành hai nhóm chính dựa trên hình thái: nấm men (Yeast) và nấm sợi (Filamentous fungi), còn được biết đến với tên gọi nấm mốc.

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra

1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người Điểm mấu chốt ở độc tố nấm mốc là chúng có thể gây hại ở nồng độ thấp

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiền (2009), trong số 300 loại độc tố vi nấm đã được xác định, chỉ có 20 loại ảnh hưởng đến sức khỏe con người, trong đó 15 loại có khả năng gây ung thư Trong nhiều năm, chúng ta đã không chú ý đến nguy cơ bệnh tật từ thực phẩm bị nhiễm nấm mốc Đến những năm 1960, các nhà khoa học đã khẳng định rằng con người có thể bị bệnh chỉ từ việc tiêu thụ một lượng nhỏ thực phẩm nhiễm mốc, với các độc tố chủ yếu được tiết ra từ nấm mốc.

5 chi nấm là: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, bao gồm:

 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), Ochratoxin A,

 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin, Penitrem A và Acid cyclopianzoic toxin, Fumonisin, Moniliformin, Diacetocyscirpenon

 Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon, T-2 toxin

 Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, Alternarion, Methyl ether alternarion

 Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà

Mycotoxin gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng, chủ yếu ảnh hưởng đến gan và thận, dẫn đến tổn thương như u gan, thoái hóa tế bào gan và xơ hóa Chúng phá hủy tế bào gan và thận, làm suy yếu hệ miễn dịch và gây ăn mòn niêm mạc ruột và dạ dày Ngoài ra, người bệnh có thể gặp các triệu chứng như tăng ure huyết, albumin niệu và viêm cầu thận.

Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết

Một số độc tố như aflatoxin, ochratoxin và funomisin gây ra hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu và hiện tượng tiêu máu, rất nguy hiểm cho cả động vật và con người Những độc tố này không chỉ làm suy yếu hệ thống miễn dịch mà còn có khả năng gây biến dị, ung thư và quái thai.

Độc tố nấm mốc có thể gây mất cân bằng trong chuyển hóa thức ăn và giảm tỷ lệ sinh sản Ngoài ra, các dẫn xuất của chúng thường độc hại cho hệ thần kinh, gây tổn hại cho hệ cơ và dẫn đến nhiều hội chứng khác nhau, bao gồm bệnh ngoài da, chứng tăng sừng hóa và sảy thai.

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố

Các chủng nấm mốc sản sinh aflatoxin chủ yếu thuộc loài Aspergillus, đặc biệt là ba chủng A.flavus, A.parasiticus và A.nomius Aflatoxin có bốn dẫn xuất quan trọng, bao gồm AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2, trong đó aflatoxin B1 là loại phổ biến nhất trong nông sản, gây tác hại nghiêm trọng và ngộ độc nhanh chóng.

Aflatoxin ở người gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống với triệu chứng như xuất huyết, huỷ hoại gan cấp tính và tử vong Khi hấp thu ở liều lượng thấp đến trung bình trong thời gian dài, triệu chứng khó nhận biết nhưng dẫn đến ngộ độc mãn tính và ung thư gan Ở động vật, triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu qua các vụ ngộ độc tự nhiên và thí nghiệm, với ngộ độc mãn tính có tính di truyền gây ung thư, quái thai và đột biến Hậu quả của nhiễm aflatoxin phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng và mức độ tiếp xúc, với động vật non có khả năng mẫn cảm cao hơn.

Aflatoxin B1 là độc tố chủ yếu và là chất gây ung thư nguy hiểm nhất trong nhóm aflatoxin, có khả năng gây ra các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần kinh.

Patulin, hay còn gọi là Clavaxin, được biết đến như một loại thuốc chữa cảm lạnh, nhưng sau đó đã phát hiện ra độc tính của nó Đây là một hợp chất không màu, kết tinh và dễ tan trong nước cũng như các dung môi phân cực Patulin thường được tách ra từ ngũ cốc, sản phẩm dạng hạt và trái cây.

Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do các nấm mốc Penicillinum, Aspergillus và

Bysschchlamys tạo ra Các chủng tổng hợp chủ yếu là các loài như A clavatus, A giganteus, P exppansum, P urticae, P griceofulvum

Patulin là một độc tố có khả năng gây ung thư cho cả người và động vật, đồng thời gây suy giảm miễn dịch và các triệu chứng xung huyết Nó gây loét niêm mạc, đặc biệt là ở ruột, và nghiên cứu đã chỉ ra rằng patulin có thể làm tổn thương DNA và nhiễm sắc thể ở con người.

Fumonisin, một loại độc tố mới được phát hiện từ nấm Fumonisin moniliorme, đang thu hút sự chú ý ngày càng cao do tính độc hại của nó đối với cả động vật và con người.

Fumonisin B1 là độc tố mạnh nhất trong nhóm fumonisin, gây ra nhiều triệu chứng nghiêm trọng như nhũng não, suy gan, mù ở ngựa, ung thư gan ở chuột, và bệnh gan ở gà Cơ quan Nghiên Cứu Quốc Tế về ung thư đã xếp fumonisin B1 vào nhóm 2B, tức là các hợp chất có khả năng gây ung thư cho con người Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra mối liên hệ giữa việc tiêu thụ lương thực nhiễm fumonisin và bệnh ung thư thực quản Độc tính của fumonisin B1 liên quan chặt chẽ đến sự tác động lên quá trình trao đổi chất của sphingolipid, bao gồm tổng hợp mới, tích lũy sphingolipid tự do và tăng hàm lượng lipid và sphingosin Đặc biệt, tế bào gan nhạy cảm hơn với hoạt động của fumonisin so với tế bào thận.

1.1.3 Các cách kh ử nhiễm độc tố

1.1.3.1 Phương pháp vật lý học

T ổ ng quan v ề vi khu ẩ n lactic

1.2.1 Gi ới thiệu vi khuẩn lactic

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus

Vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 25 - 35°C và có khả năng chịu đựng điều kiện khô hạn Chúng bền vững với CO2 và ethanol, nhiều loài có thể sống trong môi trường có nồng độ cồn từ 10-15% hoặc cao hơn Một số loài vi khuẩn lactic còn có khả năng sống trong môi trường có nồng độ NaCl từ 7 - 10% Đặc biệt, vi khuẩn lactic có hoạt tính protease giúp phân hủy protein thành peptide và acid amin, với mức độ hoạt động khác nhau giữa các loài, thường cao hơn ở các trực khuẩn.

Vi khuẩn lactic được phân loại dựa trên hình dạng tế bào thành hai loại chính: hình cầu và hình que Các tế bào hình cầu có đường kính từ 0,5 đến 1,5μm, thường xếp thành cặp hoặc chuỗi với chiều dài khác nhau Trong khi đó, tế bào hình que có kích thước từ 1 đến 8μm, có thể đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi, và kích thước của chúng thay đổi tùy thuộc vào từng loài.

Bảng phân loại khoa học giống Lactobacillus:

Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L acidophilus, L brevis, L casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus,

Các loài Lactobacillus xuất hiện trong nhiều sản phẩm lên men từ cả động vật và thực vật, đặc biệt là trong sản phẩm sữa Chúng cũng tồn tại trong ruột, hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục của con người Ngoài ra, các thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng chứa các vi khuẩn Lactobacillus này.

Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum

Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm:

Nhóm I, được gọi là Thermobacterium, là nhóm vi khuẩn lên men đồng hình bắt buộc, sở hữu enzyme fructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase Chúng có khả năng lên men hexose để tạo ra acid lactic, nhưng không thể lên men pentose, và phát triển tối ưu ở nhiệt độ 45°C.

Nhóm II bao gồm các vi khuẩn lên men dị hình tùy ý, được gọi là Streptobacterium, có FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase Trong quá trình lên men, hexose thực hiện lên men đồng hình, trong khi pentose được chuyển hóa thành acid lactic và ethanol hoặc acetic.

Nhóm III bao gồm các vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc, được gọi là Betabacterium Những vi khuẩn này có enzym phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase, cho phép chúng thực hiện quá trình trao đổi chất thông qua việc lên men cả hexose và pentose.

1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau

Vi khuẩn lactic có khả năng sử dụng đa dạng các loại carbohydrate, bao gồm monosaccharide như glucose và fructose, disaccharide như saccharose, lactose, maltose, cùng với polysaccharide như tinh bột và dextrin Nguồn cacbon này không chỉ cung cấp năng lượng mà còn hỗ trợ xây dựng cấu trúc tế bào và là nguyên liệu cho quá trình lên men sản xuất các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric và acetic.

Nhu cầu dinh dưỡng nitơ của vi khuẩn lactic rất đa dạng, với mỗi loài có yêu cầu riêng về nguồn nitơ Hầu hết vi khuẩn lactic không thể tổng hợp các hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ, do đó, chúng cần sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển Các nguồn nitơ mà vi khuẩn lactic có thể sử dụng bao gồm cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa và peptone.

Vitamin là các coenzyme quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào, góp phần thiết yếu cho hoạt động sống Tuy nhiên, hầu hết các loài vi khuẩn lactic không thể tự tổng hợp vitamin, do đó cần bổ sung vitamin vào môi trường để hỗ trợ sự phát triển của chúng.

Vi khuẩn lactic không chỉ cần acid amin và vitamin mà còn yêu cầu các hợp chất hữu cơ khác như base nitơ và acid hữu cơ để phát triển Một số acid hữu cơ như acid citric và acid oleic có tác động tích cực đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic Do đó, hiện nay, các muối citrate và dẫn xuất của acid oleic được sử dụng phổ biến trong môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.

Vi khuẩn lactic cần các muối vô cơ để đảm bảo sinh trưởng và phát triển đầy đủ, cung cấp các nguyên tố khoáng thiết yếu như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie và mangan Trong đó, magie và mangan đóng vai trò đặc biệt quan trọng.

17 tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

Vi khuẩn lactic có khả năng sinh sống trong cả môi trường có oxy và không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, tốc độ phát triển của sinh khối vi khuẩn này nhanh hơn so với trong môi trường kị khí.

1.2.2 Kh ả năng sinh các chất kháng khuẩn

1.2.2.1 Bacteriocins Đa số các bacteriocin của vi khuẩn LAB có trọng lượng nhỏ ( 30 kDa), có tính thấm nước, không ổn định nhiệt và không được nghiên cứu rộng rãi

 Lớp 4: Là các đại phân tử, kị nước, thường là những phức vì còn có thêm chất khác

Bảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012)

Nisin Vi khuẩn gram dương

Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Staphylococcus dysgalaciae Enterococcus feacalis Propionibacterium acne

L acidphilus spp Acidophin CH5 Vi khuẩn gram dương

L plantarum spp Plantaricin EF, Plantaricin W,

L casei spp Lactocin 705 Listeria monocytogenes

1.2.2.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác

Các vi khuẩn sinh acid lactic còn có khả năng ức chế sự phát triển gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng ngoài bacteriocins

Bảng 1.3 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB

Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng

Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm

Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rửa

Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn giàu protein

Hệ thống lactoperoxidase với H 2 O2 Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm làm từ sữa)

Lysozyme Vi khuẩn gram dương

Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men

Diacetyl Vi khuẩn gram âm

Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau

1.2.3 Kh ả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic

1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic

Khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic chủ yếu liên quan đến việc ức chế các vi sinh vật khác thông qua cạnh tranh dinh dưỡng và sản xuất kháng sinh (Holzapfel, 1995) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự hiện diện và công nhận của các thành phần kháng nấm Đặc biệt, hoạt động kháng nấm của L coryniformis cho thấy sự ổn định đáng kể khi ở nhiệt độ cao và pH trong khoảng 3-4,5 (Magnusson và Schnurer).

Nghiên cứu về khả năng kháng nấm của LAB chủ yếu tập trung vào việc sản xuất protein kháng nấm hoặc các hợp chất proteinaceous Một số loài LAB như L plantarum và L sanfrancisco đặc biệt nổi bật trong việc sản xuất acid hữu cơ với đặc tính kháng nấm.

Hợp chất bảo quản sinh học Nisin, được phát hiện vào năm 1998, hiện đang là lựa chọn duy nhất có thể được thêm vào thực phẩm từ vi khuẩn acid lactic.

Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men

Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất

3 -hydroxydecanoicacid 3 - hydroxydodecanoicacid 3- hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis – d d i id

MILAB14 Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin mevalonolactone

Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, formic- and n- valeric acid.

T á c h a ̣ i c ủ a n ấ m m ố c lên h a ̣ t c à phê

Giống như các loại hạt khác, trái cà phê và hạt cà phê rất dễ bị nhiễm vi sinh vật trong suốt quá trình phát triển, thu hoạch, bảo quản và vận chuyển.

Vi sinh vật có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng và độ an toàn của sản phẩm, và mức độ này phụ thuộc vào điều kiện môi trường cũng như phương pháp bảo quản hạt và sản phẩm (L R Batista và cộng sự, 2003).

Nghiên cứu về vi sinh vật trên trái và hạt cà phê cho thấy rằng các loại nấm mốc chủ yếu như Aspergillus, Penicillium và Fusarium là những yếu tố gây ô nhiễm tự nhiên trên cà phê (L R Batista và cộng sự, 2003).

Sự xuất hiện của nấm mốc trên cà phê đồng nghĩa với việc phải loại bỏ một lượng lớn cà phê để cách ly hoàn toàn phần bị nhiễm nấm và phần không nhiễm, nhằm tránh lây lan Đồng thời, nấm mốc sản sinh ra độc tố aflatoxin tích tụ trong hạt cà phê, gây nguy hiểm cho người sử dụng nếu không được xử lý đúng cách.

Ch ế bi ế n v à b ả o qu ả n h a ̣ t c à phê truy ề n th ố ng

Có ba phương pháp chế biến cà phê: chế biến khô, chế biến ướt và chế biến bán ướt Tùy thuộc vào phương pháp chế biến, cà phê sẽ có hương vị và mùi khác nhau Cà phê sau khi chế biến nhưng chưa được rang gọi là cà phê nhân, trong khi nếu còn phần vỏ trấu thì được gọi là cà phê thóc.

Sau khi chế biến, cà phê sẽ được rang ngay hoặc bảo quản tùy theo yêu cầu Môi trường bên ngoài có nhiều tác nhân ảnh hưởng đến quá trình bảo quản cà phê, bao gồm nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng.

- Đô ̣ ẩm của ha ̣t cà phê vàmôi trường xung quanh

- Nhiê ̣t đô ̣ của khối ha ̣t cà phê vàmôi trường xung quanh

- Đô ̣ thông thoáng khı́ bên trong khối cà phê

1.5.1 C ác phương pháp bảo quản cà phê thóc:

- Sấy bằng không khı́ khô

- Sấy bằng không khı́ nóng

- Sử du ̣ng các hóa chất hút nước

Bảo quản ở tra ̣ng thái thoáng gió tı́ch cực

Phương pháp bảo quản thoáng gió tích cực dựa trên việc sử dụng quạt để thổi không khí khô và mát vào khối hạt cà phê, nhằm giảm nhiệt độ và độ ẩm của hạt.

Không khí thổi vào khối hạt cần đáp ứng các điều kiện sau:

- Không khí phải được quạt đều trong toàn bộ khối hạt

- Cần đảm bảo đủ lượng không khí khô và mát để thực hiện được mục đích làm giảm nhiệt độ và độ ẩm của khối hạt

- Chỉ quạt khi độ ẩm của không khí ngoài trời thấp, nghĩa là sau khi quạt độ ẩm của khối hạt phải giảm xuống

- Nhiệt độ không khí ngoài trời phải thấp hơn nhiệt độ của khối hạt

Bảo quản hạt cà phê ở nhiệt độ thấp giúp hạn chế hoạt động sống của hạt, vi sinh vật và côn trùng, từ đó kéo dài thời gian bảo quản Phương pháp này sử dụng quạt để đưa không khí lạnh và khô vào khối hạt cà phê Nhờ vào độ dẫn nhiệt kém của hạt cà phê, không khí lạnh được giữ lại lâu, hiệu quả trong việc bảo quản chất lượng hạt.

Với điều kiện thời tiết ở nước ta, phương pháp này thường không khả thi, tuy nhiên, chúng ta có thể tận dụng những ngày lạnh và khô của mùa đông để áp dụng.

Bảo quản kín, hay còn gọi là bảo quản thiếu hoặc không có mặt O2, giúp ngăn chặn quá trình hô hấp của các cấu tử sống trong hạt cà phê Khi thiếu O2, hoạt động sống của vi sinh vật hiếu khí bị ngừng trệ, dẫn đến việc tiêu diệt trùng bọ và bảo vệ chất lượng hạt cà phê Để giảm thiểu O2, có thể bổ sung CO2 vào khối hạt, từ đó ngăn chặn hô hấp và giữ cho hạt cà phê luôn tươi ngon.

1.5.2 C ác phương pháp bảo quản cà phê nhân:

Cà phê nhân có đặc tính lý học và sinh lý khác biệt so với cà phê thóc, dẫn đến quá trình bảo quản cà phê nhân gặp nhiều khó khăn hơn, với độ bền bảo quản kém hơn do lớp vỏ trấu và vỏ lụa bảo vệ đã bị loại bỏ Hạt cà phê tiếp xúc trực tiếp với môi trường, yêu cầu chế độ bảo quản và kiểm tra chất lượng nghiêm ngặt hơn Hiện nay, phương pháp bảo quản cà phê nhân phổ biến nhất là bảo quản trong bao, và cần chú ý đến một số điểm quan trọng trong quá trình này.

- Độ ẩm cà phê nhân đưa vào bảo quản phải nhỏ hơn 13 %

- Tạp chất trong cà phê càng ít càng tốt, đối với cà phê cấp I , II phần trăm tạp chất <

- Chọn kho ẩm có cách nhiệt, ẩm tốt

- Phải sát trùng và vệ sinh kho sạch sẽ trước khi xếp bao

- Không xếp trực tiếp xuống nền và sát tường: cách nền 0,3 m, cách tường 0,5m

Để ngăn chặn hiện tượng nén chặt các bao do sức nén từ tải trọng của các bao bên trên, cần phải đảo thứ tự xếp bao sau mỗi 3 tuần Việc này giúp duy trì chất lượng và tính toàn vẹn của hàng hóa Hơn nữa, nên đổ thành đống rời để giảm thiểu áp lực lên các bao.

Bảo quản cà phê nhân trong các silo là phương pháp hiệu quả giúp tiết kiệm bao bì và kéo dài thời gian bảo quản Silo có thể được làm từ tôn, bê tông hoặc gỗ tốt, giúp tối ưu hóa không gian kho Phương pháp này không chỉ giảm thiểu hiện tượng nén chặt, mà còn duy trì độ rời của hạt cà phê, đồng thời cho phép hương và dòng khí N2 thoát ra, đảm bảo chất lượng sản phẩm.

B ả o qu ả n h a ̣ t c à phê b ằ ng vi sinh v â ̣ t

Ngũ cốc và thực phẩm chế biến từ ngũ cốc đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của loài người, ảnh hưởng sâu sắc đến nền nông nghiệp toàn cầu, kinh tế và giá trị dinh dưỡng.

Hạt ngũ cốc không chỉ là nguồn dinh dưỡng ưa chuộng của con người mà còn là mục tiêu của nấm mốc và vi sinh vật gây hại Chất lượng và an toàn thực phẩm từ các loại ngũ cốc và sản phẩm có nguồn gốc từ chúng bị ảnh hưởng bởi nấm và vi khuẩn, dẫn đến thiệt hại kinh tế và nguy cơ sức khỏe cho người tiêu dùng Bảo quản sinh học, định nghĩa là kéo dài thời hạn sử dụng sản phẩm thông qua hệ thống sinh học hoặc chất kháng khuẩn, là một công cụ hữu ích để tránh ảnh hưởng từ các tác nhân gây hại, có thể sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với các phương pháp bảo quản truyền thống, vật lý hay hóa học khác.

V Ậ T LI Ệ U V À PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊN C Ứ U

Đi ̣a điể m nghiên c ứ u

Thı́ nghiê ̣m được tiến hành ta ̣i phòng thı́ nghiê ̣m vi sinh Khoa Công Nghê ̣ Sinh Ho ̣c –

Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đa ̣i Ho ̣c Công Nghê ̣ Thành Phố Hồ Chı́ Minh.

Th ờ i gian th ự c hi ê ̣ n

Đề tài được thực hiê ̣n từ 02/2017 đến 07/2017.

V â ̣ t li ê ̣ u nghiên c ứ u

Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus spp được sử dụng từ bộ sưu tập giống Lưu Đại Kim Phượng 12DSH phân lập, bao gồm các chủng Lactobacillus sp C1 – 1 và Lactobacillus sp C7 – 7 phân lập từ cơm mẻ, cùng với Lactobacillus sp L6.

L4 và Lactobacillus sp L3 phân lâ ̣p từ nem chua Riêng chủng Lactobacillus sp L5 do

Lê Thị Hồng Thủy, sinh viên lớp 09DSH, đã tiến hành phân lập chủng nấm Aspergillus spp từ mẫu cà phê (HCP2) Công việc này được thực hiện bởi Đỗ Tuyết Mai và Nguyễn Thị Vân Hương, sinh viên lớp 11DSH.

Carbendazim từ Công ty Cổ phần Bảo vê ̣ Thực vâ ̣t Sài Gòn,

Ha ̣t cà phê mua ở cửa hàng Phương Vy 432A Xô Viết Nghê ̣ Tı̃nh, Phường 25, Quâ ̣n

Bı̀nh Tha ̣nh, thành phố Hồ Chı́ Minh

2.3.2 H óa chất và môi trường sử dụng

Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS – broth, MRS cải tiến và PDA

Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc thử: Thuốc thử Lugol, thuốc thử Phenolphthalein

Các hóa chất để pha các loa ̣i thuốc nhuô ̣m: thuốc nhuô ̣m Malachite green, thuốc nhuô ̣m Safranin, thuốc nhuô ̣m Crystal violet

Môi trường MRS broth, MRS agar, MRS agar cải tiến để nuôi cấy vi khuẩn lactic Môi trường PDA để nuôi cấy nấm mốc.

Thi ế t b ị và d ụ ng c ụ

Tủ cấy vi sinh (Brlad France)

Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)

Cân phân tích (Orbital Germany)

Máy nước cất (Branstead USA)

2.4.2 D ụng cụ Ống nghiệm, đĩa petri nhựa và thuỷ tinh, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ tinh

Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, micropipette 10 - 100μl, micropipette 100 - 1000μl Que cấy, que trang, kẹp gắp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, eppendorf 1,5 ml, ống falcon 50 ml

Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống.

Phương pháp luậ n

Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy và sản phẩm trao đổi chất từ vi khuẩn Lactobacillus spp trong việc bảo quản hạt cà phê cho thấy tiềm năng lớn trong việc kéo dài thời gian bảo quản và cải thiện chất lượng hạt Việc sử dụng các hợp chất thứ cấp từ Lactobacillus spp không chỉ giúp ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gây hại mà còn tăng cường hương vị và giá trị dinh dưỡng của cà phê Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào ngành cà phê, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm và đáp ứng nhu cầu thị trường.

Hoa ̣t hóa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp và chủng nấm mốc Aspergillus sp

Khảo sát đă ̣c điểm hı̀nh thái, sinh hóa của các chủng Lactobacillus spp

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm

Aspergillus sp HCP2 Ứng du ̣ng di ̣ch nuôi cấy, hợp chất thứ cấp của các chủng Lactobacillus spp trong bảo quản ha ̣t cà phê.

Phương phá p nghiên c ứ u

Quy trı̀nh được thực hiê ̣n theo sơ đồ sau:

2.6.2 Kh ảo sát đặc điểm hı̀nh thái, sinh hóa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp

Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loại vi khuẩn khác trong quá trình bảo quản Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện để xác định chủng vi khuẩn lactic và kiểm tra tính thuần khiết của chúng.

Các chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS Broth ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Tiếp theo, mẫu được cấy chuyển lên MRS Agar và ủ trong 1 ngày ở 37°C để quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy.

Mục đích: Xác định vi khuẩn thuộc Gram dương hay Gram âm

Theo phương pháp Hucker cải tiến, tiến hành sử dụng dịch nuôi cấy sau 24 giờ Kết quả cho thấy vi khuẩn Gram dương có màu tím, trong khi vi khuẩn Gram âm có màu hồng.

Mục đích: Xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase

Tiến hành: Dùng H2O2 nhỏ trực tiếp lên khuẩn lạc 18-24 giờ Quan sát kết quả

Kết quả: Vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủi bọt mạnh và nhanh, âm tính khi không có hiện tượng xảy ra

2.6.2.3 Xác định hàm lượng acid tổng:

Mục đích của nghiên cứu là xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp quy về acid lactic, từ đó xác định hàm lượng acid lactic do chủng vi khuẩn lactic sinh ra Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể được định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn thông qua sự đổi màu của thuốc thử Phenolphthalein.

Để thực hiện thí nghiệm, cho 10ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào bình tam giác, thêm 2-3 giọt Phenolphtalein và tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt Sử dụng máy đo pH để điều chỉnh đến khi pH đạt 8,0 và ghi lại kết quả.

Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic như sau:

V1 – Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml)

K - Hệ số đổi ra acid tương ứng, với acid lactic là 0,009

V2 – Thể tích dịch nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml)

2.6.3 Kh ảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp HCP2

Chủng nấm Aspergillus sp HCP2 được phân lập từ hạt cà phê tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường đại học Công Nghệ Hồ Chí Minh Nghiên cứu này nhằm kiểm tra sự phát triển của các chủng nấm, với mục tiêu đảm bảo rằng chủng nấm mốc có đủ sức khỏe để phục vụ cho đề tài nghiên cứu.

Chủng nấm mốc được cấy vào đĩa môi trường PDA đã được khử trùng và ủ ở 37°C trong 72 giờ để tiến hành tăng sinh trong môi trường PDB Sau đó, nấm được chuyển sang môi trường MRS Agar cải tiến bằng cách sử dụng que đục để tạo lỗ thạch, tiếp tục ủ ở 37°C trong 72 giờ.

Tiến hành đo đường kính vòng phát triển của nấm

2.6.4 Xây d ựng đường chuẩn tế bào của chủng nấm Aspergillus sp HCP2

Chủng nấm mốc Aspergillus sp HCP2 được tăng sinh trong môi trường Potato D- Glucose Broth, ủở 37oC trong 72 giờ

Dùng que cấy vòng lấy bào tử cấy điểm lên đı̃a môi trường Potato D-Glucose Agar, ủở 37oC trong 72 giờ

Tiến hành thu bào tử:

• Sau khi ủở 37 o C trong 72 giờ, người thực hiê ̣n quan sát các đı̃a PDA đã cấy và cho ̣n đı̃a PDA có bào tử xuất hiê ̣n kı́n đı̃a

Sử dụng dung dịch nước muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 để từ từ nhỏ vào đĩa PDA đã chọn và cạo nhẹ trên bề mặt nhằm thu thập bào tử Lặp lại quá trình này nhiều lần cho đến khi bề mặt đĩa không còn bào tử.

• Dùng nước muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 đi ̣nh mức lên 100ml Nồng đô ̣ pha loãng là 10 -2

Xây dựng đường chuẩn tế bào:

Sử dụng lượng bào tử vừa thu được bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 620nm, kết hợp với nước muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 pha loãng 2 lần đến giá trị mong muốn Quá trình này được lặp lại 3 lần để thu nhận giá trị trung bình.

• Dùng buồng đếm hồng cầu đếm số lượng bào tử trong mô ̣t ô, giá tri ̣ cho phép là

25 – 250 bào tử trong mô ̣t ô Lă ̣p la ̣i 3 lần và thu nhâ ̣n giá tri ̣ trung bı̀nh

Sử dụng đồ thị đường thẳng trong Excel giúp bạn dễ dàng vẽ và ghi nhận phương trình đường thẳng thông qua các giao điểm từ các giá trị đã chọn.

2.6.5 Kh ảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với ch ủng nấm Aspergillus sp HCP2

Các chủng Lactobacillus spp được tăng sinh trong môi trường MRS broth, ủ ở 37oC trong 24 giờ

Tiến hành khảo sát khảnăng kháng nấm

• Môi trường sử dụng là môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút Phối môi trường vào các đı̃a petri

Sử dụng cây đục thạch để chuyển khối thạch nấm mốc từ đĩa nấm vào đĩa môi trường MRS, cải tiến và đặt vào tâm đĩa Sau đó, ủ ở 37 độ C trong 24 giờ.

Sau 24 giờ, tiến hành sử dụng que cấy để vạch 2 đường vi khuẩn cách mép đĩa 1,5 cm Hai vạch chủng vi khuẩn cần phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một mặt.

37 đường kính) cần thử đối kháng vào Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm dĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng

• Quan sát, đọc kết quả dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày

• Tiến hành đo tı̉ lê ̣ức chế theo hı̀nh và công thức phần trăm:

Dđc: đường kı́nh (mm) đı̃a nấm đối chứng

Dtn: đường kı́nh (mm) đı̃a thı́ nghiê ̣m

Số liê ̣u được xử lý bằng phần mềm SAS 9.4

2.6.6 Ứng dụng di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp trong đối kháng nấm m ốc Aspergillus sp HCP2 bảo quản hạt cà phê

Hạt cà phê được sàng lọc kỹ lưỡng để loại bỏ các hạt nứt, vỡ, bị côn trùng hay đen Sau đó, chúng được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt và rửa sạch bằng nước cất vô trùng ba lần trước khi để ráo.

Cứ mỗi 12g ha ̣t cà phê, sẽ được ngâm trong 100ml dịch nuôi cấy được chuẩn bị như sau:

• Thı́ nghiê ̣m 1: Di ̣ch nuôi cấy nhiê ̣t đô ̣ phòng Đối chứng dương 100ml Cardabenzim 0,4% Đối chứng âm 100ml nước cất

Nghiê ̣m thức 100ml di ̣ch nuôi cấy

Thí nghiệm 2 bao gồm việc nuôi cấy ở nhiệt độ 80°C trong 15 phút với 100ml dung dịch Cardabenzim 0,4% cho đối chứng dương và 100ml nước cất cho đối chứng âm Mẫu thử nghiệm sử dụng 100ml dung dịch nuôi cấy gia nhiệt.

Hạt cà phê sau khi ngâm được để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó được phối vào các chai 100ml vô trùng Mỗi chai sẽ được cảm nhiễm 0,1ml huyền phù nấm mốc mật độ 10^2 bt/g Quá trình theo dõi diễn ra hàng ngày ở nhiệt độ thường và mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

K Ế T QU Ả V À BI Ệ N LU Ậ N

Kh ả o s á t sinh l ý – sinh h ó a c ủ a c á c ch ủ ng vi khuẩn lactic

Sáu chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L3, L4, L5, L6, C1 và C7-7 đã được nghiên cứu về hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram và thử nghiệm catalase nhằm đánh giá tính thuần khiết và khả năng lên men lactic của các chủng này.

Khuẩn la ̣c lactic trên môi trường MRS Agar thường cóđường kı́nh 2 – 5 mm, bờ đều, láng và lồi, tròn, mờđu ̣c

Kết quả: khuẩn la ̣c các chủng Lactobacillus spp mờ đu ̣c, tròn đều và lồi

Hı̀nh 3.1 Hı̀nh thái khuẩn la ̣c các chủng Lactobacillus spp trên môi trường MRS Agar

Hı̀nh 3.2 Tế bào Bacillus spp bắt màu tı́m, Gram dương (A)

Tế bào E coli bắt màu hồng, Gram âm (B)

Hı̀nh 3.3 Chủng Lactobacillus sp L3 bắt màu tı́m, Gram dương

3.1.3 Th ử nghiê ̣m catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa

H2O2 thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi

Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus sb làm đối chứng dương cho thấy, theo phân loại của Bergey, vi khuẩn lactic có đặc điểm thử nghiệm catalase âm tính Kết quả thí nghiệm cho thấy khi cho H2O2 vào sinh khối của từng chủng vi khuẩn, các chủng Lactobacillus spp không tạo ra bọt khí, xác nhận rằng chúng không có hệ enzyme catalase.

Chủng vi khuẩn Bacillus spp cho phản ứng dương tính với catalase, trong khi chủng Lactobacillus spp lại âm tính với catalase Đối chứng là nước cất, phản ứng âm tính với catalase.

Lactobacillus spp âm tı́nh với catalase, bên phải (B)

3.1.4 X ác đi ̣nh hàm lượng acid tổng

Khả năng lên men lactic được đánh giá qua nồng độ acid tổng trong dịch nuôi cấy MRS sau 24 giờ, với sự phát triển của vi khuẩn được thể hiện qua giá trị OD600nm Hình 3.5 cho thấy giá trị OD tăng theo thời gian nuôi cấy, chứng tỏ sinh khối vi khuẩn phát triển mạnh mẽ, dẫn đến sự gia tăng nồng độ acid lactic tương ứng Sau 24 giờ nuôi cấy, giá trị OD đạt cao nhất cũng là thời điểm sản xuất acid lactic mạnh nhất.

Hı̀nh 3.5 Acid lactic (%) của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L3 theo thời gian

Bảng 3.1 Acid lactic (%) và giá tri ̣ OD ởbước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp

Chủng Acid lactic (%) OD600nm

Hı̀nh 3.6 Acid lactic (%) và giá tri ̣ OD ởbước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp

Với các chủng phân lâ ̣p từ nem chua, chủng Lactobacillus sp L6 và

Chủng Lactobacillus sp L3 có khả năng lên men lactic cao nhất, trong khi các chủng Lactobacillus sp L5 và L4 có khả năng lên men yếu hơn Hai chủng Lactobacillus sp LC1-1 và LC7-7 được phân lập từ cơm mẻ cũng cho thấy khả năng lên men lactic khá cao Trong số 6 chủng được nghiên cứu, khả năng lên men lactic của các chủng Lactobacillus sp L6 cũng đáng chú ý.

Các chủng Lactobacillus sp L3 và Lactobacillus sp LC1-1 cho thấy khả năng phát triển tốt nhất, trong khi các chủng Lactobacillus sp L5, L4 và LC7-7 có khả năng lên men nhưng không hiệu quả bằng hai chủng đầu Sau 24 giờ nuôi cấy, chủng Lactobacillus sp L4 đạt giá trị OD cao nhất so với các chủng còn lại.

Sau 24 giờ nuôi cấy, các chủng Lactobacillus sp L6, L5, LC7-7 và LC1-1 phát triển mạnh mẽ, trong khi chủng Lactobacillus sp L3 có sự phát triển kém hơn so với các chủng còn lại.

Kh ả o s á t s ự ph á t tri ể n c ủ a ch ủ ng n ấ m Aspergillus sp HCP2

Chủng nấm Aspergillus sp HCP2 được phân lập từ hạt cà phê trong bộ sưu tập giống của phòng Vi sinh khoa Công Nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, thuộc trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Chủng nấm mốc này cần được kiểm tra khả năng phát triển để xác định tính phù hợp của chúng trong việc sử dụng làm nấm mốc chỉ thị cho các thí nghiệm.

Môi trường thử nghiệm sử dụng là MRS agar cải tiến, không bỏ Ammonium Citrate, được lựa chọn bởi nhóm nghiên cứu trước đó Môi trường này đáp ứng tốt yêu cầu cho việc thử nghiệm hoạt tính kháng nấm vi khuẩn, đồng thời không ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc Điều này làm cho nó trở thành lựa chọn lý tưởng để khảo sát hoạt tính kháng nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.

Hı̀nh 3.7 Khảnăng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp HCP2 trên môi trường MRS Agar cải tiến

Kết quả trên hı̀nh 3.7 cho thấy, sau 3 ngày trên môi trường MRS Agar cải tiến

(không bỏ Ammonium citrate), chủng nấm mốc Aspergillus sp HCP2 phát triển bı̀nh thường với đường kı́nh trung bı̀nh là (44,75 ± 5,79) mm

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng nấm Aspergillus sp HCP2 hoàn toàn khỏe mạnh và không bị nhiễm các chủng nấm khác, cho thấy tính khả thi để tiến hành các thí nghiệm khảo sát.

Xây d ựng đườ ng chu ẩ n t ế b à o c ủ a ch ủ ng n ấ m Aspergillus sp HCP2

Mu ̣c đı́ch: xác đi ̣nh mâ ̣t đô ̣ bào tử nấm để cảm nhiễm ha ̣t cà phê để khảo sát sự đối kháng

Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu cho phép định lượng số lượng tế bào nấm mốc thu được một cách chính xác Kết quả này giúp đánh giá mức độ ô nhiễm nấm mốc trong môi trường và hỗ trợ trong các nghiên cứu liên quan đến an toàn thực phẩm và sức khỏe.

3 = 546,667(tb) Khi đó: Số TB ( 𝑡𝑡𝑡𝑡

1 × 0,1 × 4 = 2,2 × 10 7 (tb/ml) Tổng hợp cùng số liê ̣u OD

Bảng 3.2 Số liê ̣u dựng đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp HCP2 n x logx OD

Hı̀nh 3.8 Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp HCP2

Kh ả o s á t kh ả năng đố i kh á ng tr ự c ti ế p c ủ a c á c ch ủ ng Lactobacillus spp v ớ i

chủng nấm Aspergillus sp HCP2

Sau khi đã đi ̣nh danh sơ bô ̣ và xác đi ̣nh độ thuần của các chủng vi khuẩn lactic

Lactobacillus spp là các chủng vi khuẩn có khả năng kháng lại nấm mốc Aspergillus sp Nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp đối với nấm Aspergillus, góp phần tìm hiểu vai trò của chúng trong việc kiểm soát sự phát triển của nấm mốc.

Phương pháp HCP2 sử dụng kỹ thuật cấy hai đường để xác định khả năng kháng nấm của vi khuẩn Đối chứng âm được thực hiện bằng cách sử dụng đĩa môi trường MRS Agar cải tiến, nơi chỉ đặt thạch nấm mà không cấy vi khuẩn.

Bảng 3.3 Tı̉ lê ̣ ức chế chủng nấm mốc Aspergillus sp HCP2 của các chủng

Vi khuẩn Tỉ lệức chế (%)

Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy các chủng Lactobacillus spp L3, L4, L5 đều có khả năng ức chế chủng nấm mốc Aspergillus sp HCP2 với tỷ lệ đối kháng cao hơn.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng Lactobacillus sp L3 có khả năng ức chế Aspergillus sp cao nhất với tỷ lệ 29,24%, trong khi các chủng Lactobacillus sp L6, C1 và C7-7 chỉ cho thấy khả năng đối kháng yếu khi thử nghiệm trên môi trường MRS cải tiến.

Hình 3.9 trình bày khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp khi được cấy hai đường với chủng nấm Aspergillus sp HCP2.

Ứ ng d u ̣ ng d i ̣ ch nuôi c ấ y c á c ch ủ ng Lactobacillus spp trong đố i kh á ng n ấ m

Nghiên cứu khả năng chống lại nấm sinh aflatoxin trên hạt cà phê của Aspergillus sp HCP2 được thực hiện trong điều kiện in vivo bằng cách sử dụng dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn lactic để xử lý hạt cà phê trong 1 giờ Sau đó, hạt cà phê được nhiễm bào tử nấm mốc với mật độ 10^2 bt/g Hai trường hợp được khảo sát là dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt và dịch nuôi cấy đã được xử lý nhiệt ở 80°C trong 15 phút.

* Thı́ nghiê ̣m 1: Di ̣ch nuôi cấy không xử lý nhiê ̣t

Kết quả trình bày trên bảng 3.4 và hình 3.10

Bảng 3.4 Khả năng đối kháng của di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus sp HCP2 (nhiễm 10 2 bt/g hạt cà phê)

Ngày 1 3 5 7 10 14 Ngày đầu tiên mọc nấm ĐC (-) - ++ ++ ++ ++ ++ 3 ĐC (+) - + + + + + 3

(-: không mọc, +: mọc ít, ++: mọc trung bình, +++: mọc nhiều)

Nhận xét: Đối chứng âm (Nước cất): bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3 Đối chứng dương (Carbenzim): bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3

Di ̣ch nuôi cấy L6: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 5

Di ̣ch nuôi cấy L5: bắt đầu mo ̣c nấm từ ngày thứ 14

Di ̣ch nuôi cấy L4: chưa mo ̣c nấm đến ngày thứ 15

Di ̣ch nuôi cấy L3: chưa mo ̣c nấm đến ngày thứ 15

Di ̣ch nuôi cấy C7 – 7: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 14

Di ̣ch nuôi cấy C1: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 18

Khả năng đối kháng in vivo được số hóa từ ngày đầu tiên xuất hiện của tơ nấm, cùng với khả năng đối kháng in vitro, được thể hiện rõ ràng trong hình 3.9.

Hı̀nh 3.10 Khả năng đối kháng của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm

Aspergillus sp HCP2 khi sử dụng dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt

Khi xử lý hạt cà phê bằng dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không qua xử lý nhiệt, các chủng Lactobacillus sp L5, L4 và L3 cho thấy mối tương quan giữa thời gian xuất hiện nấm trên hạt cà phê và tỉ lệ kháng nấm in vitro.

Lactobacillus sp C1 cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong khả năng bảo vệ hạt khỏi nấm mốc Dịch nuôi cấy Lactobacillus sp C1 có khả năng bảo vệ hạt trong thời gian dài, mặc dù tỷ lệ đối kháng in vitro lại không cao.

52 thấp Điều này có thể do điều kiện dinh dưỡng vi sinh vật in vitro không hoàn toàn trùng với điều kiện ngoài tự nhiên

Hı̀nh 3.11 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14 (từ trái qua phải)

Các nghiê ̣m thức: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 không gia nhiê ̣t (từ trên xuống dưới)

* Thı́ nghiê ̣m 2: Di ̣ch nuôi cấy gia nhiê ̣t 80 C trong 15 phút

Bảng 3.5 Khả năng đối kháng của di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp gia nhiê ̣t

80 o C trong 15 phút với chủng nấm Aspergillus sp HCP2 (nhiễm 10 2 bt/g)

Ngày 1 3 5 7 10 14 Ngày đầu tiên mọc nấm ĐC (-) - ++ ++ ++ ++ ++ 3 ĐC (+) - + + + + + 3

(-: không mọc, +: mọc ít, ++: mọc trung bình, +++: mọc nhiều)

Nhận xét: Đối chứng âm (Nước cất): bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3 Đối chứng dương (Carbenzim): bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3

Di ̣ch nuôi cấy L6 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 5

Di ̣ch nuôi cấy L5 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm từ ngày thứ 7

Di ̣ch nuôi cấy L4 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm từ ngày thứ 5

Di ̣ch nuôi cấy L3 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm từ ngày thứ 3

Di ̣ch nuôi cấy C7 – 7 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 5

Di ̣ch nuôi cấy C1 gia nhiê ̣t 80oC: bắt đầu mo ̣c nấm vào ngày thứ 3

Kết quả từ bảng 3.5 và hình 3.12 cho thấy, việc nuôi cấy ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút làm giảm khả năng bảo quản Chủng L5 có khả năng kháng nấm tốt hơn so với các chủng khác, trong khi chủng L3 và C1 thể hiện khả năng bảo quản yếu nhất.

Hı̀nh 3.12 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14(từ trái qua phải)

Nghiên cứu so sánh khả năng bảo quản của các dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp không gia nhiệt và gia nhiệt ở 80oC trong 15 phút cho thấy khả năng đối kháng nấm giảm mạnh sau khi gia nhiệt Các chủng L3, L4 và C1 có khả năng ngăn nấm mọc lâu (>2 tuần) khi không gia nhiệt, nhưng sau khi xử lý nhiệt, nấm mọc ngay sau 3 ngày giống đối chứng âm Điều này chỉ ra rằng hoạt chất ức chế nấm mốc trong các chủng khác nhau là khác nhau, cần được nghiên cứu thêm để phát triển chế phẩm hiệu quả.

Khả năng đối kháng của các chủng Lactobacillus spp trong điều kiện nuôi cấy gia nhiệt và không gia nhiệt được theo dõi hàng ngày với chủng nấm Aspergillus sp HCP2.

K Ế T LU Ậ N V À KI Ế N NGH I ̣

Ngày đăng: 18/07/2021, 08:32

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
1. Trần Lê B ı́ ch Trâm (2016) “Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic và ứng dụng trong bảo quản hạt đậu phộng.” Trường Đa ̣ i H o ̣ c Công Ngh ê ̣ TP.HCM Sách, tạp chí
Tiêu đề: Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic và ứng dụng trong bảo quản hạt đậu phộng
2. Lê Ngô V ũ Phượ ng (2016) “Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin” Trường Đa ̣ i H o ̣ c Công Ngh ê ̣ TP. HCM.T à i li ê ̣ u ti ế ng Anh Sách, tạp chí
Tiêu đề: Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin
3. Gilberto V. de M Pereira, A. B. P. M., Vanete Thomaz-Soccol, Adenise L Woiciechowski, Ensei Neto, Carlos R. Soccol, D ã o Pedro de Carvalho Neto (May 2016). "Potential of lactic acid bacteria to improve the fermentation and quality of coffee during on farm processing." International Journal of Food Science &amp;Technology: 1689 - 1695 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Potential of lactic acid bacteria to improve the fermentation and quality of coffee during on farm processing
5. Johan Schnurer, J. M. (2005). "Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives." Trends in Food Science &amp; Technology Sách, tạp chí
Tiêu đề: Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives
Tác giả: Johan Schnurer, J. M
Năm: 2005
6. L. R. Batista, S. M. C., Guilherme Prado, R. F. Schwan, Alan E. Wheals (2003). "Toxigenic fungi associated with processed (green) coffee beans (Coffea arabica L.)."International Journal of Food Microbiology: 293 - 300 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Toxigenic fungi associated with processed (green) coffee beans (Coffea arabica L.)
Tác giả: L. R. Batista, S. M. C., Guilherme Prado, R. F. Schwan, Alan E. Wheals
Năm: 2003
7. Nevena Blagojev, M. Š., Slavica Vesković- M0oračanin, Vladislava Šošo (2011). "Control of mould growth and mycotoxin production by lactic acid bacteria metabolites." Romanian Biotechnological Letters Vol. 17 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Control of mould growth and mycotoxin production by lactic acid bacteria metabolites
Tác giả: Nevena Blagojev, M. Š., Slavica Vesković- M0oračanin, Vladislava Šošo
Năm: 2011
4. Graciela Roll á n, G. m. V., Carla Luciana Gerez (November 2010). "Microbial applications in the biopreservation of cereals products.&#34 Khác

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w