Khóa luận đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong rau đắng biển (bacopa monnieri) thu hái tại việt nam bằng phương pháp HPLC

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây Rau đắng biển

Vị trí phân loại của loài Bacopa monnieri trong hệ thống phân loại thực vật học:

Họ: Hoa Mõm Chó (Scrophulariaceae);

Rau đắng biển, có tên khoa học là Bacopa monnieri (L.) Pennell, thuộc họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae) và chi Rau đắng biển (Bacopa), còn được biết đến với tên gọi đồng nghĩa Herpestis monnieri (L.) Rothm Tại Việt Nam, rau đắng biển thường được gọi là rau Sam trắng.

Cây thảo là loại cây sống lâu năm, cao từ 10-20 cm, với thân nhẵn và phần gốc bò sát đất, có khả năng bén rễ ở những mấu Phần trên của cây mọc đứng và có vị đắng Lá cây mọc đối, không có cuống, có hình trái xoan, mọng nước, với chiều dài từ 0,8-1,2 cm và chiều rộng từ 3-5 mm, gốc lá thuôn và đầu lá tù, cả hai mặt đều nhẵn.

Lá cây có màu xanh đậm ở mặt trên và xanh nhạt ở mặt dưới, với một gân chính và gân phụ không rõ Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở kẽ lá trên cuống dài từ 2,6-5,6 cm, không có lông Hoa có cấu trúc không đều, lưỡng tính với mẫu 5, bao gồm năm lá đài rời, không đều, trong đó lá đài sau lớn nhất hình trứng với năm gân chính, dài 0,8 cm và rộng 0,5 cm Hai lá đài trước hình trứng, mũi nhọn, có 3 gân chính, dài 0,7 cm và rộng 0,4 cm, trong khi hai lá đài bên nhỏ nhất hình dải, dài 0,6 cm và rộng 0,1 cm, có lông ở bìa Năm cánh hoa màu tím nhạt dính nhau ở thành ống, với chiều cao 5-6 mm Quả nang hình trứng, nhẵn, có đài còn lại, chứa nhiều hạt nhỏ, có góc cạnh Thời gian ra hoa từ tháng 4 đến tháng 9.

Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Rau đắng biển [42, 43]

Chi Bacopa có khoảng 70 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là Trung và Nam Mỹ, trong khi ở Việt Nam chỉ có 2 loài Rau đắng biển, một loài liên nhiệt đới, phổ biến ở Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào và các nước Đông Nam Á Tại Việt Nam, rau đắng biển phân bố rộng rãi ở các vùng đồng bằng và trung du miền Bắc và miền Nam, ưa sáng và thường mọc trên đất ẩm, pha cát, ở bờ ruộng, bãi sông, và kênh mương Cây có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt và mọc chồi khỏe từ kẽ lá, do đó, rau đắng biển cũng được coi là cỏ dại có thể ảnh hưởng đến cây trồng.

Dược liệu Rau đắng biển là phần trên mặt đất dùng tươi hoặc phơi khô của cây Rau đắng biển [8, 10]

The primary chemical components responsible for the pharmacological effects of Bacopa monnieri include triterpenoid glycosides, sterols, sterol glycosides, phenylethanoid glycosides, cucurbitacin, alkaloids, and flavonoids Notably, the key constituents are saponins, specifically the dammarane-type triterpenoid glycosides known as bacosides.

B.monnieri chứa các hợp chất triterpen glycosid, chủ yếu là bacosids, với cấu trúc nhân dammaran và aglycon là jujubogenin cùng pseudojujubogenin Các saponin này có cấu trúc khác nhau về phần đường, như được trình bày trong Bảng 1.1 và 1.2.

Những saponin quan trọng bao gồm: bacosid A1, bacosid A2, bacosid A3[24,

Trong số các saponin được phân lập, bacopasaponin A-D, E, F, G, I, II, III-V, VI-VIII cùng với bacopasid N1, N2 và X đều có mặt Đặc biệt, bacopasaponin A, E, F và bacopasid VIII thuộc nhóm jujubogenin bisdesmosid Ngoài ra, hai triterpen glycosid acyl hóa là bacomosaponin A và B cũng đã được xác định thông qua kỹ thuật quang phổ.

Trong những năm đầu nghiên cứu về B.monnieri, các nhà khoa học đã xác định thành phần hóa học đầu tiên là bacoside A, có cấu trúc 3-(α-L-arabinopyranosyl)-O-β-D-glucopyranosid-10,20-dihydroxy-16-keto-dammar-24-en, được biết đến với tác dụng tăng cường trí nhớ và hỗ trợ hệ thần kinh Đồng thời, bacosid B cũng được phát hiện, chỉ khác bacosid A ở góc quay quang học.

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng bacosid A và bacosid B không phải là những hợp chất hóa học đơn lẻ, mà là các hỗn hợp triterpen glycosid Cụ thể, bacosid A bao gồm bốn triglycosidic saponin: bacosid A3, bacosid II, 𝛼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-(β-D-glucopyranosyl-(1→3)-𝛼-L-arabinofuranosyl] jujubogenin (hay còn gọi là bacopasid X) và bacopasaponin C Trong khi đó, bacosid B là hỗn hợp của bacopasid N1, bacopasid N2, bacopasid IV và bacopasid V.

Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là jujubogenin trong rau đắng biển [41]

Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là pseudojujubogenin trong rau đắng biển [41]

Phần trên mặt đất của B.monnieri được chiết xuất bằng methanol 50%, sau đó cô đặc và để qua đêm Dịch chiết được lọc và phân đoạn liên tiếp bằng Ethyl Acetat (EtOAc) và n-Butanol (n-BuOH) Chiết xuất EtOAc đã được phân tích bằng sắc ký.

6 silicagel để thu được các cucurbitacin: cucurbitacin A-D, cucurbitacin E và ba phenylethanoid glycosid gồm: monnierasid I, III và plantiosid B [28]

Bảng 1.3: Cấu trúc một số hợp chất cucurbitacin [28]

Nghiên cứu về rau đắng biển đã xác định các thành phần flavonoid quan trọng như luteolin và apigenin Một nghiên cứu của Anju Varshney và cộng sự đã định lượng hàm lượng luteolin trong các bộ phận trên mặt đất của rau đắng biển thu hái ở Ấn Độ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Kết quả cho thấy hàm lượng luteolin tại thân của B monnieri ở Chembur, Mumbai là 0,0940 ± 0,0047 mg/500g, trong khi hàm lượng luteolin trong lá B monnieri thu hái tại Bhayander, Maharashtra là 0,01691 ± 0,0024 mg/500g.

Một nghiên cứu đã định lượng hàm lượng Luteolin và Apigenin trong các phần trên mặt đất của B monnieri thông qua dịch chiết Methanol (MeOH) bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo, với kết quả lần lượt là 0,22% và 0,45%.

Hình 1.2 Cấu trúc của Luteolin và Apigenin

Rau đắng biển chứa nhiều thành phần hóa học, trong đó triterpen glycosid đã được phân lập và xác định cấu trúc Alkaloid brahmi là thành phần đầu tiên được phát hiện trong monnieri, tiếp theo là các alkaloid khác như nicotin và herpestin Ngoài ra, các glycosid như asiaticosid và thanakunicid cũng đã được phân lập trong rau đắng biển.

1.1.6 Một số tác dụng dược lý

Rau đắng biển là thảo dược lâu năm, nổi bật trong y học cổ truyền với công dụng bổ thần kinh, cải thiện trí thông minh và trí nhớ, đồng thời tăng cường chức năng não Theo y học Ayurveda, phát triển cách đây hơn 3000 năm tại Ấn Độ, rau đắng biển được ứng dụng để bảo vệ thần kinh và chống lại chứng mất trí nhớ.

Trong bốn thập kỷ qua, Rau đắng biển và các hợp chất từ nó đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu hóa sinh nhờ vào các tác dụng dược lý bảo vệ thần kinh nổi bật Các nghiên cứu cho thấy Rau đắng biển có khả năng chống lại chứng mất trí nhớ, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer, cũng như tác dụng chống trầm cảm, lo âu, co giật và chống oxy hóa Thêm vào đó, B.monnieri còn được biết đến với các tác dụng chống viêm và kháng khuẩn, đặc biệt là đối với vi khuẩn Helicobacter.

Pylori, thuốc chống giun, chống ung thư, an thần và làm ổn định hoạt động của các tế bào mast, [8, 15]

1.1.6.1 Tác dụng cải thiện trí nhớ và khả năng nhận thức, học hỏi

Những nghiên cứu trong dịch chiết cồn của các hợp chất được phân lập từ

B.monnieri đã chứng minh tác dụng giúp tăng cường nhận thức và trí nhớ của nó trên

Tổng quan về phương pháp HPLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật tách chất phân tích thông qua cột chứa hạt pha tĩnh, với tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố giữa hai pha Thứ tự rửa giải các chất phụ thuộc vào ái lực tương đối với pha tĩnh và pha động Sau khi ra khỏi cột, các chất được phát hiện bởi detector và chuyển đến bộ phận xử lý số liệu Thời gian lưu của chất phân tích, ghi lại bởi detector, phụ thuộc vào bản chất của chất và thành phần của pha động và pha tĩnh.

Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất gắn lên chất mang hình cầu có đường kính từ 1,5 đến 10 μm, đóng vai trò quan trọng trong việc tách hỗn hợp chất phân tích Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dẫn đến việc phân loại thành hai loại chính: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.

- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2, ), pha động không phân cực

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch cacbon dài C18, C8, ), pha động phân cực

Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi dùng để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi ít phân cực như hexan và isopropylether Ngược lại, trong sắc ký pha đảo, pha động bao gồm các dung môi phân cực như nước, methanol và acetonitril.

Nguyên tắc cấu tạo của một bộ máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau [2, 3, 4, 23]

- Hệ thống cấp pha động;

- Đầu dò detector (nhận tín hiệu);

- Bộ phận thu nhận và xử lý số liệu

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [15]

1.2.2.1 Hệ thống cấp pha động

Tất cả các dung môi sử dụng trong pha động cho HPLC cần phải là dung môi tinh khiết Hệ đệm cũng phải được làm từ hóa chất tinh khiết phân tích, với nhãn ghi rõ là dành cho HPLC, nhằm ngăn ngừa hỏng hóc sắc ký và nhiễu đường nền, cũng như tránh tạo ra píc tạp trong quá trình phân tích.

Pha động trước khi đưa vào bình chứa cần được lọc qua màng lọc 0,45μm và loại bỏ khí hòa tan như N2, O2 bằng cách rung siêu âm hoặc sục khí trơ Heli Nếu trong quá trình phân tích, dung môi pha động còn sót bọt khí, sẽ xảy ra một số hiện tượng không mong muốn.

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của píc thay đổi

Khi bọt trong hệ thống quá nhiều, bộ khử khí có thể không loại bỏ hết bọt, dẫn đến việc bơm không hút được dung môi Điều này khiến áp suất không tăng và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.

Trong bất kì trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

Hệ thống bơm sắc ký lỏng cần duy trì pha động chảy liên tục với lưu lượng ổn định Các ống dẫn và hệ thống nối phải chịu được áp suất mà bơm tạo ra, với máy sắc ký lỏng hiện đại có áp suất tối đa lên đến 412 bar (407 atm) và tốc độ dòng từ 0,1 đến 9,999 ml/phút Hệ thống này được điều khiển bởi bộ vi xử lý, cho phép hai chế độ vận hành của pha động.

- Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

Pha động trong sắc ký là sự kết hợp của nhiều dung môi, thường từ 2 đến 4 loại, được chứa trong các bình riêng biệt Tỷ lệ các dung môi này sẽ thay đổi trong quá trình chạy sắc ký theo một chương trình dung môi đã được thiết lập, nhờ vào bộ trộn Hơn nữa, tốc độ dòng của pha động có thể điều chỉnh theo áp suất của bơm.

Mẫu được tiêm trực tiếp vào pha động tại đầu cột với áp suất cao thông qua van tiêm có vòng chứa mẫu, cho phép thể tích tiêm từ 5 μL đến 100 μL Có hai phương pháp tiêm mẫu: tiêm bằng tay và tiêm tự động Tuy nhiên, việc tiêm bằng tay có thể dẫn đến sai số do thể tích tiêm không đủ trong vòng chứa mẫu.

Một máy HPLC bình thường có hai cột : cột phân tích và cột bảo vệ

Cột pha tĩnh hiện nay thường được chế tạo từ thép không gỉ, bên cạnh đó còn có các loại cột bằng thủy tinh hoặc chất dẻo Chiều dài của cột dao động từ 10-30 cm với đường kính trong từ 1-10 mm, và hạt nhồi cột có kích thước khoảng 5-10 μm Ngoài ra, còn tồn tại một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt Lò cột đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì nhiệt độ ổn định cho cột.

Chất nhồi cột: đường kính 1,8-5 μm có thể dùng cột ngắn 3-10 cm và nhỏ (đường kính trong 1 – 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao Chất nhồi cột tùy

Có 13 loại cột và kiểu sắc ký khác nhau, trong đó chất nhồi cột chủ yếu là silicagel (pha thường) hoặc silicagel đã được silan hóa, hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo) Ngoài ra, còn có các loại hạt khác như nhôm oxit, polyme xốp và chất trao đổi ion được sử dụng trong sắc ký.

Cột nhồi hạt có kích thước ngắn hơn và giá thành thấp hơn cột phân tích truyền thống, với chiều dài 7,5 mm và chi phí chỉ bằng 1/10 Cột này được đặt trước cột sắc ký nhằm loại bỏ tạp chất và gia tăng tuổi thọ cho cột phân tích.

Đầu dò là thiết bị quan trọng trong quá trình phân tích, có chức năng phát hiện chất phân tích khi chúng ra khỏi cột và ghi lại tín hiệu trên sắc ký đồ để phục vụ cho việc định tính và định lượng Việc lựa chọn loại đầu dò phù hợp phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích Hiện nay, có nhiều loại đầu dò khác nhau đang được sử dụng trong lĩnh vực này.

- Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm

Máy quang phổ UV/VIS có khả năng hoạt động trong dải bước sóng từ 190 đến 900 nm, chuyên dụng cho việc phân tích các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại và khả kiến.

Detector huỳnh quang được sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang, đảm bảo tính chọn lọc cao Đối với những chất không tự phát huỳnh quang, các dẫn xuất của chất phân tích có thể được tạo ra để kích thích hiện tượng phát huỳnh quang.

Những nghiên cứu về định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong

Triterpen glycosid là thành phần chính của Rau đắng biển, đã được nghiên cứu chứng minh có tác dụng tích cực lên hệ thần kinh Các hợp chất này thường được chọn làm chất đánh dấu hóa học trong tiêu chuẩn hóa dược liệu của Rau đắng biển Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng các bacosid trong Rau đắng biển, với nhiều chương trình chạy sắc ký được tổng kết trong tài liệu tham khảo.

Bảng 1.4 Một số phương pháp định lượng triterpen glycosid trong Rau đắng biển

Dung môi chiết Điều kiện sắc ký TLTK

Chiết hồi lưu cách thủy

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5àm

+ Pha động: ACN : TFA 0,1% (35:65, tt/tt) + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

+ Thể tớch tiờm mẫu: 20àL + Detector: PDA (205 nm)

2 HPLC-DAD Siêu âm Methanol

+ Cột: Luna RP-18 (150 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5àm + Cột bảo vệ: Phenomenex RP-18

+ Pha động: ACN : H3PO4 0.2% (35:65, tt/tt), điều chỉnh pH đến 3,0 bằng NaOH 5M

+ Thể tớch tiờm: 20àL + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: PDA (205 nm)

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5àm) + Pha động: ACN : Na2SO4 0,05M (pH= 2,3) (31,5 : 68,5, tt/tt) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

+ Nhiệt đô cột: 30 o C + Thể tớch tiờm: 20àL + Bước sóng phát hiện: 205 nm

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5àm)

+ Pha động đẳng dòng (isocratic): ACN : Na2SO4 (từ Na2SO4 khan 0,71%, kl/tt) (315 : 685, tt/tt), điều chỉnh về pH = 2,3 bằng acid sulfuric

+ Dung môi pha mẫu: MeOH 70%

+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Nhiệt độ cột: 30 o C

+ Thể tớch tiờm mẫu: 20àL + Bước sóng phát hiện: 205 nm

Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển, bao gồm Bacopasid I, Bacosid A3, Bacopasid X và Bacopasaponin C, so với Bacopasid II lần lượt là 1,4; 0,9; 1,2.

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5àm)

+ Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan và H3PO4, pH = 2,3) + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút + Nhiệt độ cột: 27 o C

+ Thể tớch tiờm mẫu: 20àL

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển, bao gồm bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C, so với bacosid A lần lượt là 0,73; 1,04.

Đối tượng nghiên cứu của các tài liệu tham khảo là Rau đắng biển, được rửa sạch, sấy khô và nghiền thành bột Các chương trình sắc ký sử dụng ACN làm thành phần pha động chính cùng với một dung dịch đệm có pH acid, chủ yếu chạy theo chế độ đẳng dòng Điều kiện sắc ký thường sử dụng cột pha đảo C18, thể tích mẫu 20 µL, tốc độ dòng 1,0 – 1,5 ml/phút và bước sóng phát hiện 205 nm Theo Dược điển Anh và USP 40 – NF35, hàm lượng bacosid tổng số được tính từ bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, và các đồng phân của bacopasaponin C Nghiên cứu này sẽ định lượng triterpen glycosid tổng số theo tiêu chuẩn USP 40 – NF35.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Mẫu dược liệu Rau đắng biển được thu hái từ một số tỉnh tại Việt Nam và đã được giám định tên khoa học bởi Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược Liệu Sau đó, mẫu được gửi đến Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu để xây dựng phương pháp và đánh giá chất lượng Dược liệu tươi được sấy khô ở nhiệt độ 55 o C và được bảo quản trong túi bóng kín ở nơi khô ráo, thoáng mát.

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập

TT Ký hiệu Tên Việt

Tên khoa học Họ thực vật Nơi lấy Ngày lấy

Nhật Lệ, Đồng Hới, Quảng Bình

Quảng Thành, TP Thanh Hóa

Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị

Các chất chuẩn bacopasid I (CAS: 382148-47-2, LOT: PRF9012222), bacosid A3 (CAS: 157408-08-7, LOT: PRF9212143), bacopasid II (CAS: 382146-66-9, LOT: PRF8062301), bacopasid X (CAS: 94443-88-6, LOT: PRF9162411) và bacopasaponin C (CAS: 178064-13-6, LOT: PRF8062302) được cung cấp bởi Biopurify Phytochemicals Ltd với độ tinh khiết trên 98%.

- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (methanol, acetonitril) của hãng Merck

- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu methanol, ethanol mua của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.)

- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của Shimadzu bao gồm các thành phần chính như hệ bơm binary LC-30AD, detector SPD-M20A DAD, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-30AC và bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS Tất cả được điều khiển thông qua phần mềm Labsolution, mang lại hiệu suất tối ưu cho các ứng dụng phân tích.

- Cột sắc ký Zobax Eclip XDB C18 (250 x 4,6mm, 5àm) của Agilent

- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO)

- Cân phân tích (Precisa XT 220A), độ chính xác 0,00001 g

- Cân kỹ thuật điện tử (Ohaus) độ chính xác 0,01 g

- Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45)

- Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc bacosid A3 được tạo ra bằng cách cân chính xác 10 mg bacosid A3, sau đó hòa tan và định mức trong bình định mức 5 mL bằng methanol, cho ra dung dịch có nồng độ khoảng 2 mg/ml.

Các dung dịch chuẩn bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C với nồng độ khoảng 0,5 mg/ml trong methanol được sử dụng để xác định vị trí các píc của chúng trong mẫu thử.

Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C, sử dụng ổn định trong 02 tháng

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển 2.3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát chương trình pha động là bước quan trọng trong quy trình phân tích, trong đó chương trình rửa giải gradient được thực hiện với pha động bao gồm acetonitril (kênh B) kết hợp với nước (kênh A) theo các tỉ lệ khác nhau Việc điều chỉnh tỉ lệ này giúp tối ưu hóa quá trình tách biệt và tăng cường độ chính xác của kết quả phân tích.

Các kết quả khảo sát được đánh giá và so sánh dựa trên thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), và hệ số đối xứng (AS) Để đạt tiêu chuẩn, RS cần ≥ 1,5 và AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, với giá trị tối ưu gần bằng 1 Thời gian lưu (tR) của các chất phân tích không nên quá dài, nhưng cần đảm bảo các chất được tách biệt rõ ràng.

Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn bacosid A3 bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC kết hợp với detector DAD (Shimadzu) nhằm khảo sát các điều kiện sắc ký.

Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký, chúng tôi đã tiến hành thẩm định phương pháp định lượng tổng số bacosid (tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển bằng HPLC theo hướng dẫn của AOAC Đặc biệt, độ thích hợp của hệ thống được kiểm tra kỹ lưỡng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Tính thích hợp hệ thống là phép thử quan trọng để đánh giá độ ổn định của toàn bộ hệ thống phân tích, bao gồm các yếu tố như máy móc và thiết bị.

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị, ghi lại các giá trị thời gian lưu và diện tích pic Tính tương thích hệ thống thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các đáp ứng phân tích, yêu cầu RSD của các giá trị thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2% Độ chọn lọc của phương pháp cũng cần được xem xét.

Tính chọn lọc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là khả năng xác định rõ ràng chất cần phân tích trong sự hiện diện của các tạp chất hoặc chất cản trở Điều này được thể hiện qua sắc ký đồ từ mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng, trong đó píc của chất cần phân tích phải tách biệt hoàn toàn với các píc tạp Đồng thời, trên sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện píc nào có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn.

Tiến hành chạy sắc ký cho dung dịch chuẩn bacosid A3, mẫu Rau đắng biển và mẫu trắng methanol theo chương trình đã chọn Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích pic để phân tích kết quả.

Thời gian lưu của píc bacosid A3 trong dung dịch chuẩn và dung dịch thử Rau đắng biển cần phải tương đương Píc trong mẫu thử phải tách biệt hoàn toàn với các píc khác trong nền mẫu Hệ số chồng phổ giữa mẫu thử và mẫu chuẩn phải đạt lớn hơn 0,99 để đảm bảo độ chính xác.

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ trong đó có sự liên hệ tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ của chất phân tích.

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau để khảo sát mối quan hệ giữa tín hiệu đo được và nồng độ Vẽ đồ thị thể hiện sự liên hệ này và theo dõi sự phụ thuộc cho đến khi không còn tính tuyến tính Khoảng tuyến tính được xác định bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc tại giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất).

Đường chuẩn là biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích, được đánh giá qua giá trị R² và độ chệch của các điểm nồng độ sử dụng để xây dựng đường chuẩn (Δ) Để đảm bảo độ chính xác, yêu cầu giá trị R² phải nằm trong khoảng từ 0,99 đến 1.

Độ lặp lại của phương pháp phân tích phản ánh mức độ chính xác khi thực hiện quy trình trong cùng một điều kiện thí nghiệm và trong khoảng thời gian ngắn.

25 hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ, xác định độ lệch tương đối RSD (%) của hàm lượng

KẾT QUẢ

Thẩm định phương pháp phân tích

3.2.1 Tính thích hợp hệ thống

Hệ thống được đánh giá tính thích hợp thông qua phương pháp đã nêu, với kết quả được xác định dựa trên giá trị RSD (%) của diện tích píc và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại mẫu chuẩn bacosid A3 có nồng độ 0,42 mg/ml Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2%, cho thấy các điều kiện sắc ký và hệ thống HPLC được lựa chọn là phù hợp, đảm bảo độ ổn định trong phép phân tích định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển.

3.2.2 Tính chọn lọc của phương pháp

Tiến hành phân tích ba mẫu gồm dung dịch bacosid A3 chuẩn, dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu trắng methanol theo điều kiện phân tích HPLC đã nêu, thu được kết quả đánh giá thông qua các sắc ký đồ tương ứng.

Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp

Hình 3.4 So sánh phổ UV của bacosid A3 trong mẫu thử và mẫu chuẩn

Thời gian lưu của píc bacosid A3 trên sắc ký đồ mẫu Rau đắng biển tương đồng với thời gian lưu của các píc chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử, các píc bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, jujubogenin isomer của bacopasaponin C và bacopasaponin được tách biệt hoàn toàn Hệ số chồng phổ của bacosid A3 trong mẫu thử so với mẫu chuẩn lớn hơn 0,99, cho thấy phương pháp này đủ đặc hiệu để định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển.

3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn bacosid A3 với nồng độ tăng dần từ 0,21 mg/ml đến 1,68 mg/ml Tiến hành phân tích HPLC theo các điều kiện đã nêu Kết quả cho thấy khoảng tuyến tính được xác định từ 0,21 mg/ml đến 1,68 mg/ml.

32 mg/ml và phương trình hồi quy tuyến tính y = 2369732,91x + 30580,47 với hệ số tương quan R 2 = 0,9998

Bảng 3.4 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của píc bacosid A3

Cân chính xác 2,5 g dược liệu và xử lý mẫu theo quy trình đã mô tả để thu được dung dịch tiêm sắc ký Thực hiện lặp lại quy trình này 6 lần trên cùng một mẫu dược liệu, và kết quả được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại

TT m dược liệu (g) Hàm lượng (%)bacosid tổng (tính theo bacosid A3)

Hàm lượng bacosid A3 trong Rau đắng biển đạt trung bình 3,30% (theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối), với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,44%, cho thấy phương pháp phân tích có độ lặp lại cao và ổn định.

Mẫu thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 2,5 bột dược liệu và thêm một lượng bacosid A3 chuẩn, quá trình thêm chuẩn được tiến chuẩn bị ở 3 mức: 5 mg, 10 mg và

15 mg Sau đó, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã trình bày ở trên

Để định lượng bacosid trong mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn, cần cân chính xác khoảng 2,5 g bột dược liệu và xử lý mẫu theo quy trình đã nêu Phân tích được thực hiện bằng phương pháp HPLC, với mỗi mức thêm chuẩn được lặp lại 3 lần để lấy kết quả trung bình, được trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp

Nồng độ thực (mg/ml)

Nồng độ thêm chuẩn (mg/ml)

Nồng độ mẫu thêm chuẩn (mg/ml)

Nồng độ thêm chuẩn tìm lại (mg/ml) Độ thu hồi (%)

Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng bacosid tổng số trong dược liệu Rau đắng biển bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đạt từ 95-102%, cho thấy phương pháp này có độ chính xác cao.

Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính

Áp dụng phương pháp đã xây dựng, nghiên cứu đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển thu hái tại một số tỉnh ở Việt Nam Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần độc lập để đảm bảo độ chính xác của kết quả Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng triterpen glycosid có sự khác biệt giữa các mẫu Rau đắng biển từ các tỉnh khác nhau.

Bảng 3.7 Hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong dược liệu Rau đắng biển thu hái tại Việt Nam

TT Ký hiệu Nơi lấy Ngày lấy

Hàm lượng (%)bacosid tổng số (tính theo bacosid

1 RĐB1 Thái Thụy, Thái Bình 10-6-2019 3,22 ± 0,01

2 RĐB2 Tiền Hải, Thái Bình 07-07-2019 3,25 ± 0,01

3 RĐB3a Giao Thủy, Nam Định 07-09-2019 2,53 ± 0,01

4 RĐB3b Giao Thủy, Nam Định 07-09-2019 3,04 ± 0,03

7 RĐB5a Cửa Tùng, Quảng Trị 07-11-2019 3,16 ± 0,02

8 RĐB5b Cửa Tùng, Quảng Trị 07-11-2019 3,15 ± 0,02

9 RĐB6a Nhật Lệ, Đồng Hới,

10 RĐB6b Nhật Lệ, Đồng Hới,

11 RĐB7a Bố Trạch, Quảng Bình 13-07-2019 2,04 ± 0,04

12 RĐB8a Quỳnh Lưu, Nghệ An 13-07-2019 2,47 ± 0,06

13 RĐB8b Hoàng Mai, Nghệ An 13-07-2019 1,89 ± 0,01

16 RDB10a Nga Sơn, Thanh Hóa 7-2019 3,17 ± 0,01

18 RDB10c Tĩnh Gia, Thanh Hóa 7-2019 3,53 ± 0,05

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu Rau đắng biển dao động từ 1,89 – 5,74% Đặc biệt, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh Hóa đạt hàm lượng cao nhất là 5,74 ± 0,03 Những kết quả này đóng góp quan trọng vào việc đánh giá chất lượng dược liệu Rau đắng biển tại Việt Nam.

BÀN LUẬN

Về thu thập mẫu dược liệu

Rau đắng biển (Bacopa monnieri) là thảo dược có vị đắng và tính mát, được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực và y học cổ truyền Ấn Độ suốt 3000 năm qua Loại cây này có tác dụng bảo vệ trí nhớ, bổ thần kinh, nâng cao nhận thức và chống oxy hóa, góp phần cải thiện sức khỏe tâm thần.

Rau đắng biển phân bố rộng rãi ở Việt Nam, chủ yếu tại các tỉnh như Thái Bình, Nam Định, Hải Phòng, và nhiều tỉnh miền Trung và miền Nam khác, ở độ cao lên đến 500m so với mực nước biển Mặc dù rau đắng biển có tiềm năng dược liệu, nhưng hiện tại Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận về loại rau này Phương pháp định lượng triterpen glycosid tổng số, dựa trên bacosid A3, đã được áp dụng trong các dược điển của Mỹ và Anh, nhưng chưa có nghiên cứu nào thực hiện trên rau đắng biển tại Việt Nam Nghiên cứu này sẽ đóng góp vào việc tiêu chuẩn hóa dược liệu rau đắng biển tại nước ta.

Nhóm nghiên cứu đã thu thập mẫu Rau đắng biển từ các tỉnh Bắc, Trung, Nam như Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng Trị, Quảng Bình và Kiền Giang, và đang tiếp tục mở rộng thu thập để đánh giá chất lượng dược liệu này tại Việt Nam.

4.2 Về xây dựng phương pháp định lượng

Dược điển Mỹ và Dược điển Anh đã công nhận chuyên luận về dược liệu Rau đắng biển, trong đó đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (theo bacosid A3) bằng phương pháp HPLC Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp này gặp khó khăn do thời gian lưu của các bacosid bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi cột sắc ký Để khắc phục, chúng tôi đã chạy chuẩn đơn của các hợp chất như bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, isomer jujubogenin của bacopasaponin C (bacopasid X) và bacopasaponin C nhằm xác định thời gian lưu và thời gian lưu tương đối của các bacosid so với bacosid A3 Sau khi xác định các thông số này, chúng tôi đã thẩm định phương pháp theo tiêu chí của AOAC và kết quả cho thấy phương pháp đạt yêu cầu của AOAC.

4.3 Về kết quả định lượng triterpen glycosid tổng số trong các mẫu Rau đắng biển

Nghiên cứu này đã định lượng hàm lượng triterpen glycosid trong 23 mẫu Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC Kết quả cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu dao động từ 1,89% đến 5,74% Đặc biệt, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh Hóa có hàm lượng triterpen glycosid tổng cao nhất, đạt 5,74 ± 0,03%.

Nghiên cứu của tác giả Trần Trung Nghĩa và cộng sự (2017) cho thấy hàm lượng triterpen glycosid trong Rau đắng biển dao động từ 1,71 – 4,45%, với mẫu cao nhất được trồng tại Thanh Hóa Kết quả hàm lượng triterpen glycosid tổng trong nghiên cứu này tương tự như nghiên cứu của chúng tôi Hơn nữa, các mẫu Rau đắng biển thu từ các địa phương khác nhau cho thấy sự khác biệt về hàm lượng triterpen glycosid, trong đó vùng Thanh Hóa có hàm lượng cao nhất.

Tiêu chuẩn nguyên liệu Rau đắng biển theo Dược điển Mỹ yêu cầu hàm lượng bacosid tối thiểu là 2,5% Kết quả nghiên cứu cho thấy nguồn nguyên liệu Rau đắng biển tại Việt Nam có chất lượng cao với hàm lượng triterpen glycosid vượt trội, mở ra cơ hội lớn cho việc cung cấp nguyên liệu phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận

Qua quá trình thực hiện đề tài, các mục tiêu đặt ra đã hoàn thành, cụ thể như sau:

1 Đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong dược liệu Rau đắng biển với điều kiện như sau: Điều kiện sắc ký:

+ Cột: Zobax Eclip XDB C18 (250 x 4,6mm, 5àm)

+ Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan và H3PO4, pH = 2,3)

+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

+ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL

Thời gian (phút) % Kênh A % Kênh B

Cân chính xác 2,5 g dược liệu đã xay nhỏ vào bình cầu 100 ml, sau đó thêm 25 ml dung dịch methanol Tiến hành chiết hồi lưu cách thủy trong 10 phút, sau đó để nguội về nhiệt độ phòng và gạn lấy lớp dịch Tiếp tục chiết cho đến khi dịch chiết mất màu, gộp các dịch chiết lại, cô dưới áp suất giảm và định mức đến 100 ml bằng methanol Cuối cùng, lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 để thu được dịch sắc ký.

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn bacosid A3, cân chính xác 10,0 mg bacosid A3 vào bình định mức 5 ml Thêm 3 ml dung dịch methanol và lắc đều, sau đó bổ sung bằng dung dịch trên đến vạch Kết quả thu được là dung dịch chuẩn bacosid A3 có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml.

2 Phương pháp được đánh giá thẩm định theo các tiêu chí của AOAC về: độ thích hợp hệ thống (các giá trị RSD đề nhỏ hơn 2%); độ lặp lại (RSD (%) nhỏ hơn 1,5 %); độ thu hồi (đều nằm trong khoảng 92 – 105%); đường chuẩn và khoảng tuyến tính (các giá trị R 2 đều lớn hơn 0,99)

3 Áp dụng phương pháp trên 23 mẫu Rau đắng biển cho thấy cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu Rau đắng biển nằm trong khoảng từ 1,89 – 5,74% Trong đó, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh hóa cho hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) cao nhất (5,74 ± 0,03) Đề xuất

- Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) tại các thời điểm thu hái khác nhau và các vùng khác nhau

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt

1 Nguyễn Tiến Bân (Chủ Biên) (2003&2006), Danh lục các loài thực vật Việt

Nam, 3, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Hà Nội

2 Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học

3 Bộ Y Tế (2012), Hóa phân tích, 2, Nhà xuất bản Y học Hà Nội

4 Hoàng Minh Châu (2002), Cơ sở hóa học phân tích, Nhà xuất bản Khoa học

5 Quách Thị Lê Hà (2011), Triển khai mô hình đánh giá tác dụng của thuốc chống trầm cảm trên tế bào thần kinh vỏ não phôi thai chuột cống nuôi cấy và dòng tế bào NG 108-15 tại Viện Dược liệu, Đại học Dược Hà Nội

6 Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ

7 Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Tác dụng chống oxy hóa in vitro của rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst, Scrophulariaceae)", Tạp chí dược liệu

8 Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học

9 Trần Trung Nghĩa, Nguyễn Văn Tài,Lê Hùng Tiến (2017), "Xây dựng phương pháp định lượng Bacoside trong rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst bằng HPLC và tuyển chọn mẫu giống rau đắng biển có hàm lượng Bacoside cao", Tạp chí Khoa học & Công nghệ 4(9), tr 86-92

10 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, 2, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật

11 Aiyalu Rajasekaran, Nagulsamy Sarathikumar (2014), "Simultaneous

Estimation of Luteolin and Apigenin in Methanol Leaf Extract of Bacopa monnieri Linn by HPLC", British Journal of Pharmaceutical Research 4(13), pp 1629-1637

12 Anju Varshney, Sunita Shailajan,Naresh Chandra (2011), "Estimation of flavonoid-luteolin in different plant parts of Bacopa monnieri (L.) Wettst by using HPTLC method", Analytical Chemistry: An Indian Journal 11(1)

13 Bhattacharya SK,Ghosal S (1998), "Anxiolytic activity of a standardized extract of Bacopa monniera: an experimental study", Phytomedicine, 5(2), pp 77-82

14 Bailey Kr,Crawley Jn (2001), "Methods of behavior analysis in neuroscience

", Chemical Rubber Company press, 2nd edition

15 Bhandari Pamita, Sendri Nitisha,Devidas Shinde Bhagatsing (2020),

"Dammarane triterpenoid glycosides in Bacopa monnieri: A review on chemical diversity and bioactivity", Phytochemistry, 172, pp 112276

16 Bose KC, Bose NK (1931), "Observations on the actions and uses of Herpestis monniera", Journal of the Indian Medical Association, 1, pp 60

17 Chakravarty AK, Garai S, Masuda K, Nakane T,Kawahara N (2003),

"Bacopasides III-V: three new triterpenoid glycosides from Bacopa monniera", Chem Pharm Bull (Tokyo), 51(2), pp 215-7

18 Chakravarty AK, Sarkar T, Masuda K, Shiojima K, Nakane T,Kawahara N

(2001), "Bacopaside I and II: two pseudojujubogenin glycosides from Bacopa monniera", Phytochemistry, 58(4), pp 553-6

19 Chen Yun-Bo,Lai Shi-Long (2005), "Effects of drug serum in broken bushen yizhi formulas on cell model of Alzheimer disease", Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, pp 250-253

20 Chia-Chung Hou, Shwu-Jiuan Lin,Juei-Tang Cheng (2002), "Bacopaside III,

Bacopasaponin G, and Bacopasides A, B, and C from Bacopa monniera", journal of Natural Products, 65(12), pp 1759-1763

21 Chillara Sivaramakrishna, Chillara Vrao,Golakoti Trimurtulu (2005),

"Triterpenoid glycosides from Bacopa monnieri", Phytochemistry, 66(23), pp 2719-2728

22 Chopra RN, Nayar SL,Chopra IC (1956), Glossary of Indian Medicinal

23 Harvey D (2000), Modern analytical chemistry, McGraw-Hill New York

24 Jain P, Kulshreshtha DK (1993), "Bacoside A1, A minor saponin from Bacopa monniera", Phytochemistry, 33(2), pp 449-451

25 Kumar N, Abichandani LG, Thawani V,Gharpure KJ (2016), "Efficacy of

Standardized Extract of Bacopa monnieri (Bacognize(R)) on Cognitive

Functions of Medical Students: A Six-Week, Randomized Placebo-Controlled Trial", Evid Based Complement Alternat Med, 2016, pp 4103423

26 Nanteetip Limpeanchob, Somkiet Jaipan (2008), "Neuroprotective effect of

Bacopa monnieri on beta-amyloid-induced cell death in primary cortical culture", Journal of Ethnopharmacology, 120(1), pp 112-117

27 Nimisha Pulikkal Sukumaran,Augustine Amalraj (2019),

"Neuropharmacological and cognitive effects of Bacopa monnieri (L.) Wettst – A review on its mechanistic aspects", Complementary Therapies in Medicine, 44, pp 68-82

28 Pamita Bhandari, Neeraj Kumar,Bikram Singh (2007), "Cucurbitacins from

29 Ramawat Kg, Mérillon Jm (2008), Bioactive Molecules and Medicinal Plants,

30 Saraswati Garai, Shashi B Mahato (1996), "Bacopasaponin D-A pseudojujubogenin glycoside from Bacopa monniera", Phytochemistry, 43(2), pp 447-449

31 Shashi B Mahato,Saraswati Garai (2000), "Bacopasaponins E and F: two jujubogenin bisdesmosides from Bacopa monniera", Phytochemistry, 53(6), pp 711-714

32 Stough C, Lloyd J, Clarke J, Downey L, Hutchison C,Rodgers (2001), "The chronic effects of an extract of Bacopa monniera (Brahmi) on cognitive function in healthy human subjects", Psychopharmacology, 156, pp 481-484

33 Steven Roodenrys,Dianne Booth Msc (2002), "Chronic Effects of Brahmi

(Bacopa monnieri) on Human Memory", Neuropsychopharmacology, 27, pp

34 Subha Rastogi, Dinesh K Kulshreshtha (1998), "Bacoside A2-A triterpenoid saponin from Bacopa monnieri", Indian Journal of Chemistry, 38B, pp 353-

35 Subha Rastogi, Raghwendra Pal, Dinesh K (1994), "Bacoside A3, A triterpenoid saponin from Bacopa monniera", Phytochemistry, 36(1), pp 133-

36 The British Pharmacopoeia Commission Secretariat of the Medicines and

Healthcare Products Regulatory Agency (Mhra) (2016), British Pharmacopoeia, The Stationery Office

37 The United States Pharmacopeial Concention (2015), The United State

Pharmacopeia 38 NF 33 Second Supplement, Rockville, Maryland: United

38 The United States Pharmacopeial Convention (2018), The United State

Pharmacopeia 40 NF 35 Second Supplement, Rockville, Maryland : United

39 Tripathi YB, Chaurasia S, Tripathi E, Upadhyay A, Dubey GP (1996),

"Bacopa monniera Linn as an antioxidant: mechanism of action", Indian J Exp Biol, 34(6), pp 523-6

40 Watoo Phrompittayarat, Sakchai Wittaya-Areekul, Kanchalee Jetiyanon

(2007), "Determinationof Saponin Glycosides in Bacopa monnieri by

Reversed Phase High PerformanceLiquid Chromatography ", Thai Pharmaceutical and Health Science Journal, 2(1), pp 26-32

41 Yun Zhou, Yun-Heng Shen, Chuan Zhang, Juan Su (2007), "Triterpene

Saponins from Bacopa monnieri and Their Antidepressant Effects in Two

Mice Models", Journal of Natural Products, 70(4), pp 652-655

42 https://doctors24h.vn/cay-rau-dang.html

43 https://www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc-goc-2718/rau-dang-bien.aspx

44 https://duocthu.com/hplc-dung-de-lam-gi/hplc-2/#prettyPhoto

45 https://plants.usda.gov/core/profile?symbol=XAST.

Về kết quả định lượng triterpen glycosid tổng số trong các mẫu Rau đắng biển

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định hàm lượng triterpen glycosid trong 23 mẫu dược liệu Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC Kết quả cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) trong các mẫu Rau đắng biển dao động từ 1,89% đến 5,74% Đặc biệt, mẫu Rau đắng biển thu tại Thanh Hóa có hàm lượng triterpen glycosid cao nhất, đạt 5,74 ± 0,03%.

Nghiên cứu của Trần Trung Nghĩa và cộng sự (2017) cho thấy hàm lượng triterpen glycosid trong Rau đắng biển dao động từ 1,71 – 4,45%, với mẫu cao nhất được trồng tại Thanh Hóa Kết quả hàm lượng triterpen glycosid tổng trong nghiên cứu này tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi Đặc biệt, hàm lượng triterpen glycosid của Rau đắng biển thu từ các địa phương khác nhau có sự khác biệt, trong đó Thanh Hóa là vùng có hàm lượng cao nhất.

Tiêu chuẩn nguyên liệu Rau đắng biển theo Dược điển Mỹ yêu cầu 2,5% bacosid Kết quả cho thấy nguồn nguyên liệu Rau đắng biển tại Việt Nam có chất lượng cao với hàm lượng triterpen glycosid dồi dào, hứa hẹn đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận

Qua quá trình thực hiện đề tài, các mục tiêu đặt ra đã hoàn thành, cụ thể như sau:

1 Đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong dược liệu Rau đắng biển với điều kiện như sau: Điều kiện sắc ký:

+ Cột: Zobax Eclip XDB C18 (250 x 4,6mm, 5àm)

+ Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan và H3PO4, pH = 2,3)

+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

+ Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL

Thời gian (phút) % Kênh A % Kênh B

Cân 2,5 g dược liệu đã xay nhỏ vào bình cầu 100 ml, thêm 25 ml methanol và chiết hồi lưu cách thủy trong 10 phút Để nguội, gạn lấy lớp dịch và tiếp tục chiết cho đến khi dịch chiết mất màu Gộp các dịch chiết, cô dưới áp suất giảm và định mức đến 100 ml bằng methanol Cuối cùng, lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 để thu được dịch sắc ký.

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn bacosid A3, cân chính xác khoảng 10,0 mg bacosid A3 vào bình định mức 5 ml Thêm 3 ml dung dịch methanol và lắc đều Sau đó, bổ sung bằng dung dịch cho đến vạch định mức, thu được dung dịch chuẩn với nồng độ khoảng 0,5 mg/ml.