Khóa luận tốt nghiệp đại học này được thực hiện với mục tiêu nhằm nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu của người; điện biến nạp hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, GLIS1 vào quần thể tế bào gốc tạo máu của người; kiểm tra biểu hiện gen của các yếu tố tái lập trình trong tế bào gốc tạo máu sau khi điện biến nạp. Mời các bạn cùng tham khảo.
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
Tế bào gốc tạo máu CD34 với độ tinh khiết 80% được trữ đông từ máu cuống rốn, do Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec cung cấp.
3.1.2 Địa điểm và thời gian Địa điểm: Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec Time City – Hà Nội
Nội dung nghiên cứu
- Nhận vector tái lập trình
- Nuôi cấy tế bào gốc tạo máu của người
- Biểu hiện hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, L-MYC, GLIS1 trên tế bào gốc tạo máu
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3.1.1 Hóa chất và sinh phẩm
Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
Tên hóa chất Hãng sản xuất Công dụng imMedia TM Amp Blue for lacZ + Amp R recombinant E coli strains
Môi trường nuôi cấy chọn lọc
E coli imMedia TM Amp Liquid for
Môi trường nuôi cấy tăng sinh
QiAprep R Spin Miniprep Kit QIAGEN Tinh sạch DNA
RedSafe TM Nucleic Acid iNtRON Thuốc nhuộm DNA
Tên hóa chất Hãng sản xuất Công dụng
10X FastDigest Green Buffer Themo Scientific DNA Loading dye
GeneRuler 1kb DNA Ladder Themo Scientific Thang DNA cho điện di
Agarose Invitrogen TM life technologies
Gel chạy điện di phân tích DNA
TBE 0,5X Việt Nam Đệm cho chạy điện di
Isopropanol Emsure Tủa DNA trong quá trình phân tách
Cồn 70 Việt Nam Khử trùng các dụng cụ thí nghiệm
Tripan blue solution Gigma Life Science Dung dịch nhuộm để đếm tế bào
Stem Kit Reagents Beckman coulter Xác định tỷ lệ tế bào CD34 + sau khi nuôi tăng sinh
7-AAD Beckman coulter Phân biệt tế bào sống chết trong chạy flow cytometry iPS Brew XF 50X
Stem MACS TM cung cấp các thành phần dinh dưỡng thiết yếu cho môi trường nuôi cấy iPS Brew XF, là môi trường cơ bản lý tưởng để nuôi cấy tế bào sau quá trình chuyển gene.
Nuclease Free Water Themo Scientific Nước cất không chứa nuclease sử dụng cho sinh học phân tử
QiAprep R Spin Maxiprep Kit QIAGEN Kit tinh sạch DNA plasmid từ vi khuẩn
Themo Scientific qRT-PCR kit sử dụng để xác định biểu hiện của các gene tái lập trình
Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Hãng sản xuất Công dụng
Tủ an toàn sinh học cấp 2 Esco, Mỹ Bảo vệ mẫu tế bào nuôi cấy khỏi các tác nhân gây nhiễm
Tủ nuôi cấy tế bào Thermo
Cung cấp nhiệt độ, nồng độ CO2 phù hợp cho tế bào tăng sinh
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss Quan sát tế bào trong quá trình nuôi cấy
Bể ổ nhiệt Memmert là thiết bị lý tưởng để rã đông hoặc làm ấm mẫu và môi trường nuôi cấy Pipet man Eppendorf giúp hút và xả chất lỏng với thể tích xác định một cách chính xác Máy li tâm lạnh loại nhỏ Eppendorf có khả năng tách hỗn hợp hai pha rắn - lỏng hoặc lỏng - lỏng thành các phần riêng biệt Vortex Eppendorf được sử dụng để trộn đều mẫu và hóa chất thí nghiệm, trong khi máy lắc nhiệt hỗ trợ trong việc nuôi vi khuẩn hiệu quả.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn
BD FACS Canto II: Flow
BD Xác định kích thước, độ hạt và các kháng nguyên biểu hiện trên bề mặt tế bào
Xác định nồng độ và độ tinh sạch của nucleic acid
Lonza Chuyển plasmid mang gen tái lập trình vào tế bào đích Máy li tâm lạnh loại nhỏ Beckman
Sử dụng trong quá trình phân tách và tinh sạch DNA, RNA
Máy điện di ngang Optima Kiểm tra plasmid sau khi tinh sạch
Lò vi sóng Sharp Pha gel chứa agar sử dụng cho nuôi cấy vi khuẩn Nồi hấp khử trùng
Daihan Khử trùng, tiệt trùng dụng cụ thí nghiệm
Tủ sấy dụng cụ Memmert Sấy dụng cụ làm thí nghiệm sau khi khử trùng hơi nước
Tủ lạnh 4 0 và -20 0 Toshiba Bảo quản hóa chất, mẫu thí nghiệm
Tủ -80 0 Sanyo Bảo quản hóa chất, mẫu thí nghiệm Cân điện tử HR200 A&D Cân hóa chất có độ chính xác 0,001g trở lên
Máy soi gel Bio rad Phát hiện DNA dưới tia UV
Xác định các biểu hiện của các gen tái lập trình
Tổng hợp cDNA cho phản ứng Realtime PCR
3.3.1.3.Dụng cụ vật tư tiêu hao
Bảng 3.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm
Tên Hãng sản xuất Công dụng
Sử dụng ống ly tâm 50 ml Corning để hút và trộn đều dung dịch chứa tế bào, môi trường nuôi cấy và hóa chất trong các thí nghiệm Ngoài ra, ống ly tâm 15 ml Corning và ống Eppendorf 2 ml Corning cũng là những dụng cụ quan trọng trong quá trình thí nghiệm.
Buồng đếm tế bào Incyto Đếm số lượng tế bào
Serological pipette 5 ml Thermo Fisher
Hút dung dịch Serological pipette 10 ml Thermo Fisher
Serological pipette 25 ml Thermo Fisher
Gạc sạch và giấy sạch Bảo Thạch được sử dụng để vệ sinh dụng cụ và khu vực thí nghiệm bằng cồn 70% Ống 5 ml phục vụ cho việc chạy flow cytometry BD Science, giúp đựng tế bào để thực hiện phân tích Que cấy trải vô trùng Sarstedt được sử dụng để cấy E coli lên đĩa thạch, trong khi đĩa peptri Biologix và đĩa 6 giếng An Nhiên là các loại đĩa nuôi cấy tế bào Ống PCR 0.2 ml Bimetech được dùng để đựng phản ứng tổng hợp cDNA, và dãy ống realtime PCR 0.2 ml Bimetech phục vụ cho các phản ứng realtime.
3.3.2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài 3.3.2.2 Các phương pháp sử dụng trong đề tài
3.3.2.2.1 Tế bào gốc tạo máu CD34 + trữ đông thu từ máu cuống rốn của người (CD34 + 80%)
Tế bào CD34 được bảo quản đông lạnh từ máu cuống rốn của người, với 80% tế bào dương tính với marker tế bào gốc tạo máu CD34+ sau khi tinh sạch bằng cột Những tế bào này được cung cấp bởi Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec.
3.3.2.2.2 Rã đông và nuôi tăng sinh tế bào CD34 + a Chuẩn bị:
Môi trường nuôi cấy StemSpan-ACF được sử dụng để làm ấm và tăng sinh tế bào gốc tạo máu, trong khi đó, ống chứa hỗn hợp cytokine bổ sung StemSpan CC110 cần được rã đông để đảm bảo hiệu quả trong quá trình nuôi cấy.
Tế bào gốc tạo máu trữ đông Đĩa 6 giếng b Quy trình nuôi tăng sinh
- Pha môi trường nuôi cấy tế bào bằng cách trộn đều StemSpan-ACF với StemSpan CC110 với tỉ lệ phù hợp
- Cho 2 ml vào đĩa 6 giếng Để vào tủ ấm
- Lấy ống tế bào trữ đông ra khỏi tủ -80 0 C, làm ấm nhanh để dịch chứa tế bào tan ra
- Hút hết dịch tế bào cho vào ống falcon 15ml chứa môi trường đã ủ ấm
- Ly tâm falcon tế bào 400G/4 phút và đổ bỏ dịch nổi
- Hòa lại cặn tế bào trong 1ml môi trường và hút vào giếng có chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn
- Hút môi trường ở đĩa 6 giếng vào ống eppendorf 2 ml Trộn nhẹ
- Cho vào đĩa 6 giếng/ lắc nhẹ sau đó để vào tủ ấm 37 0 , nồng độ CO2 5% c Phương pháp thay môi trường tế bào
Trong quá trình nuôi cấy tế bào, khi mật độ tế bào đạt 70-80% trên đĩa sau 24-48 giờ, cần thay môi trường cũ bằng môi trường mới để cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển của tế bào.
Quy trình bổ sung môi trường trong quá trình nuôi cấy:
- Hút bỏ môi trường cũ
- Huyền phù và nuôi tiếp d Phương pháp cấy chuyển tế bào
Khi tế bào đạt mật độ 70-80% bề mặt diện tích bình nuôi, tế bào được cấy chuyển để tạo không gian cho tế bào phát triển và tăng sinh
- Hút hết môi trường cũ
- Ly tâm 3000 vòng/ 5 phút loại môi trường
- Huyền phù lại cặn tế bào trong môi trường mới và nuôi tiếp e Phương pháp xác định tế bào sống chết bằng thuốc nhuộm Trypan Blue
- Hỳt 10 àl dung dịch tế bào, thờm vào 10 àl dung dịch Trypan Blue, trộn đều bằng micropipette
- Hút dịch đã trộn nạp vào buồng đếm hồng cầu
- Đếm tế bào ở 4 vùng 16 ô ở 4 góc của buồng đếm, tính mật độ tế bào theo công thức:
3.3.2.2.3 Phân tích tỷ lệ tế bào CD34 + trong quần thể tế bào tăng sinh bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry)
"Cytometer" là thuật ngữ có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là "cơ thể" và "đo đạc" Phân tích tế bào theo dòng chảy là một kỹ thuật phổ biến trong tế bào học, được sử dụng để đánh giá các đặc điểm của tế bào như số lượng, kích thước, độ phức tạp bên trong và phát hiện kháng nguyên bề mặt qua nhuộm huỳnh quang Khi dòng chảy đơn bào đi qua chùm laser, máy sẽ thu được hai loại ánh sáng: tán xạ trước (FC) để xác định kích thước tế bào và tán xạ ngang (SC) để đánh giá độ phức tạp bên trong và phát hiện kháng nguyên bề mặt qua ánh sáng huỳnh quang.
Quy trình chuẩn bị ống và kháng thể chạy trong Flow cytometry:
- Tế bào được ly tâm 3000 G/5 phút thu cặn
- Huyền phù lại cặn tế bào trong 150 ul PBS
- Bật máy phân tích dòng chảy tế bào
- Rửa lại máy bằng nước sạch
- Vontex ống trước khi đặt vào máy phân tích dòng chảy tế bào
- Chạy mẫu cần phân tích
Thiết kế thí nghiệm được trình bày bảng 3.4:
Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm trong Flow cytometry
Sau đó, kết quả được phân tích bằng phần mềm FlowJo
3.3.2.2.4 Chuyển các vector chứa các nhân tố phiên mã cảm ứng tái lập trình vào tế bào CD34 + bằng phương pháp Nucleofector
Nhận vector từ Yamanaka (Nhật Bản)
Hai vector pCEB-hUL-G và pECB-hSK-O đã được thử nghiệm lâm sàng cho bệnh thoái hóa điểm vàng do tuổi tác Do đó, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã liên hệ với Yamanaka để mua hai vector này.
Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình Ống 1 (ống đối chứng) Ống 2 (CD45/CD34) Ống 3 (CD45/IsoClonic Control - PE)
CD45-FITC/CD34-PE X 10 ul X
10 5 tế bào/ống 50 ul 50 ul 50 ul
Các thành phần của vector pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O, vai trò và chức năng của chúng được thể hiện ở bảng 3.5
Bảng 3.5: Thành phần của vector tái lập trình pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O
OriP Điểm khởi đầu sao chép
CAG Promoter thúc đẩy mức độ biểu hiện gen cao trong các vector biểu hiện
WPRE Vector WPRE làm tăng biểu hiện gen từ vector retroviral
CoIE1 ori Điểm khởi đầu sao chép có nguồn gốc từ vi khuẩn
Gen kháng kháng sinh Amp r được kích hoạt và điều chỉnh thông qua cặp loxP, cho phép trao đổi và ức chế các gen khác Đuôi polyA (pA) đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ mRNA khỏi tác động của nuclease trong tế bào chất.
Protein EBNA-1 liên kết trực tiếp với DNA, trong khi hGLIS1, một protein ngón tay kẽm, hoạt động như chất kích hoạt và ức chế phiên mã hLin28 thúc đẩy tính đa năng, còn hL-MYC giúp tạo ra các vị trí cho các protein khác gắn vào hSOX2 phục hồi chức năng của tế bào, khuyến khích sự biểu hiện của các protein quan trọng cho tính gốc, bao gồm SOX2 và OCT3/4 Cuối cùng, hKLF4 có vai trò kìm hãm sự chết có chương trình.
Có hai phương pháp chính để biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào khả biến, bao gồm xung điện và sốc nhiệt Phương pháp xung điện có ưu điểm về hiệu suất biến nạp cao hơn, nhưng lại có nhược điểm là làm chết nhiều tế bào Trong nghiên cứu này, tôi thực hiện quá trình biến nạp plasmid để tái lập trình tế bào khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt.
- Tế bào khả biến (Competent cell) ( 3 ống) ở tủ -8 0 cho vào khay đá
- Plasmid : PGEF (1 àg) vào ống tế bào khả biến (đối chứng)
SK- O (3 àg) vào ống tế bào khả biến
UL- G (5 àg) vào ống tế bào khả biến
- Hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 42 0 /45 giây
- Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá
- Bổ sung 400 àg mụi trường LB (khụng cú khỏng sinh) Hỗn hợp được nuụi ở 37 0 / lắc 170 vòng/phút trong vòng 1 giờ
Use a sterile inoculation loop to transfer 200 µl of bacterial culture onto LB agar plates (imMedia TM Amp Liquid for Amp R recombinant E coli strains) Incubate the plates at 37°C overnight.
Sau khi nuôi cấy qua đêm ở 37 độ C, tiến hành thu được các khuẩn lạc Lựa chọn khuẩn lạc phát triển nhanh nhất để nuôi cấy tăng sinh trong môi trường LB lỏng nhằm mục đích tách chiết plasmid.
Quá trình tách chiết plasmid dựa trên nguyên lý biến tính bằng kiềm đối với DNA plasmid và DNA nhân, cho phép hồi tính chọn lọc DNA plasmid sau khi trung hòa dung dịch.
Thực hiện theo quy trình tách plasmid bằng bộ kit QiAprep R Spin Miniprep của QIAGEN
- Ly tâm 6000 vòng/5 phút thu cặn tế bào
- Bổ sung 250 àl Buffer P1 (Pesuspension buffer : bổ sung RNA A solution và LyseBlue, lắc đều hỗ hợp), vontex đến khi hết cặn khuẩn, chuyển sang ống eppendorf mới
- Bổ sung 300 àl vào mỗi ống eppendorf
- Bổ sung 250 àl Buffer P2 vào mỗi ống, đảo ống 4-5 lần
- Bổ sung 350 àl Buffer N3/ lắc nhẹ
- Thu dịch nổi cho vào cột
- Ly tâm 15.000 vòng/1 phút/ loại dịch đi qua cột
- Lấy 2 ống epppendorf còn lại thu dịch nổi, bỏ tiếp lên 2 cột tương ứng
- Ly tâm 15.000 vòng/1 phút sau đó loại bỏ dịch đi qua cột
- Bổ sung 750 àl Buffer PB Ly tõm 15.000 vũng/1 phỳt Đổ dịch qua cột
- Chuyển 2 cột sang 2 eppendorf sạch
- Cho 50 àl Elusion Buffer, để nhiệt độ phũng 5 phỳt
- Bỏ cột, bổ sung 50 àl Elusion Buffer bảo quản 2 eppendorf chứa mẫu
Thực hiện theo quy trình tách plasmid bằng bộ kit QiAprep R Spin Maxiprep của hãng QIAGEN
- Ly tâm 6000 G/15 phút thu cặn tế bào
- Bổ sung 10 ml Buffer P1 (Pesuspension buffer : bổ sung RNA A solution và LyseBlue, lắc đều hỗ hợp), vontex đến khi hết cặn khuẩn, chuyển sang ống eppendorf mới
- Bổ sung 10 ml Buffer P2, đảo ống 4-5 lần
- Bổ sung 350 àl Buffer P3/ lắc nhẹ Để ở tủ 4 o /20 phỳt
- Ly tâm 11.000G/30 phút/ 4 o Hút dịch trong
- Ly tâm 11.000G/30 phút/4 o Thu dịch nổi
- Cho 10 ml Buffer QBT vào cột để rửa cột
- Thu dịch nổi cho vào cột Bỏ dịch, giữ lại cột
- Bổ sung 60 ml Buffer QC Giữ cột, thay ống mới
- Bổ sung 15 ml Buffer QF
- Bổ sung 10,5 ml isopropanol Trộn nhẹ
- Ly tâm 11.000 G/30 phút/ loại dịch đi qua cột
- Rửa bằng 5 ml cồn 70 o Ly tâm 11.000G/10 phút
- Bổ sung 500 àl Nuclease Free Water và bảo quản mẫu
Phương pháp định tính, định lượng DNA
Phương pháp định lượng DNA bằng máy quang phổ
Sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop 2000 để kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA sau khi tách chiết ở 2 bước sóng 260 nm và 280 nm
Nguyên lý: Máy kiểm tra độ tinh sạch NanoDrop 2000 hoạt động dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các bazơ purine và
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 1
Để thực hiện chuyển vector tái lập trình, cần có 10^6 tế bào CD34+ (tế bào gốc tạo máu) Những tế bào này được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec và được nuôi cấy trong 6 ngày để phục hồi sau khi rã đông, nhằm đạt được số lượng tế bào cần thiết cho quá trình chuyển gen.
Sau khi rã đông, vào ngày 0, tất cả tế bào CD34+ đều có hình dạng tròn, sáng, thể hiện đặc điểm điển hình của tế bào gốc tạo máu trong điều kiện nuôi cấy huyền phù Mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy đạt từ 5-10%, cho thấy sự phát triển khả quan của tế bào.
Hình 4.4: Tế bào CD34 + sau 6 ngày nuôi tăng sinh
Sau 6 ngày nuôi cấy (hình 4.4) và 1 lần thay môi trường ở ngày thứ 3, mật độ tế bào đạt được thuộc khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi cấy Tổng số tế bào đạt được là 1,78 x 10 6 tế bào Trong tổng số lượng tế bào khoảng 1 triệu tế bào được đông lạnh trong dung dịch đông lạnh chứa 10% DMSO (dimethylsulfoxide) và BSA (Bovine serum albumin) 5 x 10 5 tế bào trong tất cả số tế bào còn lại được sử dụng để nuôi cấy tiếp trong đĩa 6 giếng, nuôi cấy trong 3 ngày để đạt số lượng tế bào để điện biến nạp
Khoảng 3 x 10 5 tế bào còn lại cuối cùng được sử dụng để xác định phần trăm tế bào gốc tạo máu biểu hiện CD34 trên bề mặt, sử dụng kỹ thuật phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry) Tuy nhiên do làm thiếu bước phần bù tín hiệu trên máy Flow cytometry nên đã không có kết quả cho đợt kiểm lượng tế bào CD34 + trên bề mặt quần thể tế bào gốc tạo máu
Chúng tôi tiến hành nuôi tăng sinh tế bào CD34+ lần thứ hai nhằm kiểm tra chất lượng tế bào và phân tích tỷ lệ tế bào đạt yêu cầu.
CD34 + trong quần thể tế bào tăng sinh bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry).
Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 2
Sau 2 ngày nuôi cấy, tế bào CD34+ thể hiện sự tăng sinh rõ rệt, với hình dạng tròn và sáng, đặc trưng cho tế bào gốc tạo máu Trong môi trường nuôi cấy huyền phù, mật độ tế bào đạt khoảng 10-20% bề mặt đĩa nuôi cấy, cho thấy hiệu quả của quá trình rã đông và nuôi dưỡng tế bào.
Hình 4.6: Tế bào CD34 + sau 5 ngày nuôi tăng sinh
Sau 5 ngày nuôi cấy (hình 4.6) và 1 lần thay môi trường ở ngày thứ 3, mật độ tế bào bao phủ khoảng 80% bề mặt đĩa nuôi cấy Kết quả đếm số lượng tế bào cho thấy tổng số lượng tế bào đạt được là 1,57 x 10 6 tế bào Trong đó, khoảng 1 triệu tế bào được trữ đông trong dung dịch đông lạnh chứa 10% DMSO (dimethylsulfoxide) và 7,5 % BSA (Bovine serum albumin) 2,7 x 10 5 tế bào được sử dụng để nuôi cấy tiếp trong đĩa 6 giếng với thời gian 3 ngày với mục đích đạt số lượng tế bào để điện biến nạp Khoảng 3 x 10 5 tế bào cuối cùng được sử dụng để xác định phần trăm tế bào gốc tạo máu biểu hiện CD34 trên bề mặt, sử dụng kỹ thuật phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry) để kiểm tra Tác dụng của các kháng thể như sau
Kháng nguyên CD34 là một glycoprotein chuỗi đơn xuyên màng, được biểu hiện chủ yếu trên các tế bào tiền thân tạo máu, bao gồm cả tế bào gốc đa năng.
Kháng thể CD45 nhận diện các kháng nguyên CD45 trên bề mặt tế bào bạch cầu với trọng lượng phân tử 180, 190, 210 và 220 KD Đây là kháng nguyên bạch cầu chung (leukocyte common antigen - LCA), được biểu hiện trên tất cả các loại tế bào tạo máu ngoại trừ hồng cầu trưởng thành và các tế bào tiền thân của chúng.
Thuốc nhuộm 7AAD, một đồng phân của Actinomycin D với nhóm amino thay thế ở vị trí 7 của chromophore, được sử dụng để phân biệt tế bào chết trong phân tích tế bào dòng chảy Các tế bào chết sẽ hấp thụ thuốc nhuộm 7AAD, trong khi các tế bào sống không bị ảnh hưởng, giúp cải thiện độ chính xác trong quá trình phân tích.
Kết quả chạy Flow cytometry được biểu hiện trên hình 4.7
Hình 4.7 Sự biểu hiện tế bào CD34 trên bề mặt của quần thể tế bào nuôi tăng sinh
Trong hình 4.7, trục tung biểu thị mức độ phức tạp của tế bào, trong khi trục hoành thể hiện tín hiệu huỳnh quang thu được Màu sắc trong biểu đồ phản ánh mật độ tế bào, với màu đỏ, xanh lá cây và xanh dương lần lượt đại diện cho mật độ cao, trung bình và thấp.
Hàng đầu tiên là đối chứng với tế bào CD34, cho thấy tỉ lệ tế bào sống đạt 99,9% Hàng thứ hai, sau khi bổ sung kháng thể CD45, tỉ lệ tế bào sống giảm còn 97,7%, nhưng tín hiệu huỳnh quang đạt 99,7%, chứng tỏ thí nghiệm hoạt động hiệu quả Hàng thứ ba cho thấy mức độ dương tính với CD34 đạt 56,6%, cho phép sử dụng lượng CD34 + còn lại cho tái lập trình, mặc dù Fukuda và cộng sự đã sử dụng 78% tế bào CD34 + để tái lập trình.
Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 1
Chúng tôi sử dụng phương pháp điện biến nạp để chuyển gen từ episomal vector, nhờ vào các chương trình đã được lập trình sẵn trong kit của hãng Lonza, nhằm mục đích chuyển gen cho tế bào gốc tạo máu.
Tế bào CD34 + sau khi nuôi tăng sinh 3 ngày đạt được tổng số tế bào là 0,46 x
Một triệu tế bào đã được chuyển plasmid (500 ng plasmid ULG và 500 ng plasmid SKO) bằng phương pháp điện biến nạp sử dụng chương trình Dz-100 của máy 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) Sau khi chuyển gen, các tế bào được nuôi trên đĩa 6 giếng được phủ bởi chất nền ngoại bào CELLstart và được duy trì trong điều kiện 37 độ C với 5% CO2.
Tế bào 1 ngày sau chuyển gen được biểu hiện ở hình 4.8 Có 2 dạng tế bào điển hình xuất hiện:
Sau 1 ngày xung điện, quan sát thấy hai dạng tế bào chính trong đĩa Đầu tiên, có những tế bào tròn, sáng (mũi tên vàng) chiếm phần lớn, có thể là quần thể tế bào gốc tạo máu Thứ hai, xuất hiện các tế bào có hình dạng giống nguyên bào sợi, thuôn dài (mũi tên đen), có thể là quần thể tế bào gốc trung mô, lẫn trong quần thể tế bào ban đầu do độ tinh sạch chưa đạt 100% trước khi chuyển gen.
Tế bào ngày thứ 2, thứ 3 và thứ 7 sau chuyển gen được thể hiện trên hình 4.9
Hình 4.9: Quần thể tế bào sau 2 ngày chuyển gen (A), sau sau 3 ngày chuyển gen (B) và sau 7 ngày chuyển gen (C)
Vào ngày thứ 7, số lượng tế bào tròn, sáng tăng lên và hình thành các cụm rõ rệt, trong khi tế bào hình thoi dài xuất hiện nhiều từ ngày thứ 2 sau khi chuyển gen và phân bố đều trên bề mặt giếng nuôi cấy Điều này cho thấy các tế bào hình thoi đã tồn tại trong quần thể tế bào chuyển gen, và chất nền sử dụng để phủ đĩa đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng bám và tăng sinh Chúng tôi dự đoán rằng những tế bào này không phải là tế bào mong muốn, vì trong hình thái tế bào gốc tạo máu chỉ có quần thể tế bào tròn, sáng Tuy nhiên, chúng tôi vẫn tiến hành tách RNA để kiểm tra biểu hiện gene.
Chúng tôi đã tiến hành chuyển gen lần thứ hai với lượng DNA plasmid và tế bào cao hơn, nhằm mục đích nâng cao chất lượng tế bào.
Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 2
Mười sáu tế bào đã được chuyển gen lần thứ hai bằng hai plasmid: một plasmid chứa các yếu tố phiên mã ULG và một plasmid chứa các yếu tố phiên mã SKO Quá trình này được thực hiện thông qua phương pháp điện biến nạp sử dụng chương trình Dz-100 của máy 4D-Nucleofector.
Tế bào sau khi chuyển gen được nuôi trong 3 giếng của đĩa 6 giếng, với mật độ 3,3 x 10^5 tế bào mỗi giếng, trên chất nền ngoại bào CELLstart Quá trình nuôi được thực hiện trong điều kiện 37℃ và 5% CO2.
Hình 4.10: Tế bào sau 1 ngày xung điện
Hình ảnh tế bào chụp bằng kính hiển vi quang học sau 1 ngày chuyển gen cho thấy phần lớn tế bào vẫn là tế bào gốc tạo máu tròn, sáng Bên cạnh đó, có một số tế bào chết có hình tròn, màu đen, dự đoán là kết quả của việc sử dụng xung điện với cường độ cao Tỉ lệ tế bào chết được xác định bằng thuốc nhuộm Trypan blue, cho thấy chúng chiếm khoảng 20% tổng số tế bào.
Tế bào ngày thứ 4, thứ 5 và ngày 8 sau chuyển gen được thể hiện trên hình 4.11
Hình 4.11: Quần thể tế bào sau 4 ngày chuyển gen (A), sau 5 ngày chuyển gen
Sau 4 ngày chuyển gen, số lượng tế bào tròn, sáng vẫn chiếm ưu thế (Hình 4.11 A) Đến ngày thứ 5, các tế bào bắt đầu bám xuống bề mặt đĩa nuôi cấy (mũi tên vàng) và đến ngày 8, chúng có hình dạng giống tế bào biểu mô, mọc thành cụm (Hình 4.11 C) Nhóm nghiên cứu hy vọng sau 2 tuần, các khuẩn lạc tiền thân iPSC sẽ hình thành và phát triển thành các khuẩn lạc giống kiểu hình của iPSC, được đánh giá bằng các phương pháp kiểm định phù hợp.
Kết quả kiểm tra biểu hiện gen
Bảy ngày sau khi thực hiện chuyển gen, toàn bộ tế bào trong một giếng được sử dụng để tách chiết RNA phục vụ cho phản ứng Real-time PCR, nhằm kiểm tra biểu hiện của các gen đã chuyển Đồng thời, RNA từ các tế bào gốc tạo máu không được chuyển gen cũng được tách chiết để làm nhóm đối chứng.
Kết quả tách chiết RNA được trình bày tại bảng 4.3
Bảng 4.3: Kết quả đo OD sau mỗi lần tách RNA
Nồng độ và chất lượng RNA
Tế bào nuôi tăng sinh 6 ngày
Tế bào sau 7 ngày chuyển gen lần thứ nhất (1 àl)
Tế bào sau 7 ngày chuyển gen lần thứ hai (2 àl)
Mẫu tách có độ tinh sạch trong khoảng 1.8-2.1, trong khi tế bào sau 7 ngày chuyển gen (1 µl) A260/280 đạt 2.13, vượt qua mức tối thiểu nhưng không có sự chênh lệch đáng kể, cho phép tiến hành phản ứng Real-time PCR 135 ng RNA từ mẫu tế bào đối chứng và mẫu tế bào chuyển gen được sử dụng để tổng hợp cDNA, với 2 µl cDNA trong tổng số 20 µl trong mỗi phản ứng từ mỗi mẫu được dùng cho phản ứng Real-time PCR.
Kết quả Realtime PCR cho thấy:
Khi sử dụng đối chứng âm (thay bằng nước), phản ứng khuếch đại không xảy ra, dẫn đến không thể xác định giá trị Ct Kết quả này khẳng định rằng quy trình chuẩn bị phản ứng không bị nhiễm chéo giữa các mẫu và các cặp mồi không tạo ra sản phẩm thứ cấp.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi xuôi của SOX2 và mồi ngược của KLF4 để xác định đoạn gen mã hóa cho SOX2-KLF4 trên vector SK-O, cùng với cặp mồi L-MYC-LIN28 trên vector UL-G nhằm tiết kiệm chi phí và thời gian Mức độ biểu hiện của gen GapDH được kiểm tra, và sự khác biệt trong mức độ biểu hiện của hai cặp gen SOX2-KLF4 và L-MYC-LIN28 trong các tế bào chuyển gen so với tế bào đối chứng được tính toán theo công thức của Livak và trình bày trong sơ đồ hình 4.12.
Hình 4.12: (A)Biểu hiện của các gen SOX2-KLF4, LMYC- LIN28
(B) Cấu trúc vector pCEB-hSK-O và pCEB-hUL-G
Kết quả cho thấy, trục tung biểu thị số lần thay đổi sau chuyển gen, được định mức theo gen chứng nội GapDH, một gen có biểu hiện đồng đều giữa các tế bào trong các điều kiện thí nghiệm khác nhau Trục hoành đại diện cho biểu hiện của gen.
Sau khi thực hiện chuyển gen SOX2-KLF4 và LMYC-LIN28 với 1 àg và 2 àg plasmid, chúng tôi ghi nhận sự gia tăng biểu hiện gen đáng kể ở các tế bào CD34+ Cụ thể, với 1 àg plasmid, biểu hiện của cặp gen SOX2-KLF4 tăng khoảng 30,957 lần và LMYC-LIN28 tăng khoảng 5,841 lần Đối với 2 àg plasmid, cặp gen SOX2-KLF4 tăng khoảng 26,000 lần và LMYC-LIN28 tăng khoảng 2,900 lần so với các tế bào không chuyển gen Kết quả cho thấy chúng tôi đã thành công trong việc chuyển vector tái lập trình vào tế bào CD34+ bằng phương pháp xung điện.