Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Chúng tôi đã tiến hành đánh giá chất lượng tinh dịch của 33 lợn đực giống
“bố mẹ”, trong đó có 10 Landrace, 10 Yorkshire, 5 PiDu, 5 Móng Cái và 3 đực Rừng
- Các lợn đực giống từ 2 – 4 năm tuổi, đã qua kiểm tra năng suất cá thể.
- Các lợn đực giống có cùng chế độ chăm sóc nuôi dưỡng, chuồng trại. 3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm giống lợn Đông Mỹ -Công ty Cổ phần giống chăn nuôi Thái Bình trong thời gian từ tháng7/2015 đến tháng 5/2016.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Đánh giá chất lượng tinh dịch lợn thông qua các chỉ tiêu
- Chỉ tiêu tổng hợp VAC
- Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình
- Sức kháng của tinh trùng.
3.2.2 Ảnh hưởng của mùa vụ trong năm đến chất lượng tinh dịch lợn Đánh giá chất lượng tinh dịch lợn theo các mùa xuân, hè, thu, đông.
Phương pháp nghiên cứu
- Lợn đực giống được khai thác tinh vào sáng sớm, chế độ khai thác theo từng giống.
- Phương pháp khai thác bằng nhảy giá, kỹ thuật khai thác tinh bằng tay bởi các kỹ thuật viên lành nghề.
+ Đối với lợn đực giống Landrace, Yorkshire và Móng cái là 3 ngày /lần.
+ Đối với lợn đực PiDu và Rừng là 4 hoặc 5 ngày/lần tùy theo nhu cầu thực tế sản xuất tại Công ty.
- Dụng cụ lấy tinh được vô trùng trước khi sử dụng.
3.3.2 Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh dịch lợn
- Chất lượng tinh dịch được kiểm tra theo tiêu chuẩn Quốc gia do Bộ khoa học và Công nghệ công bố.
Bảng 3.1 Một số tiêu chuẩn về chất lượng tinh dịch của lợn đực giống
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, K pH tinh dịch
Sức kháng của tinh trùng, R
Nguồn: Bộ Khoa học và Công nghệ
- Xác định thể tích tinh dịch hay lượng xuất tinh V (ml/lần)
Thể tích tinh dịch của lợn đực được xác định sau khi lọc bỏ keo phèn, sử dụng cốc đong có chia mức ml Để lọc chất keo nhầy, đặt 3 - 4 lớp vải gạc đã khử trùng trên miệng cốc khi tinh dịch chảy vào Kết quả được đọc ở mặt cong dưới của cốc Sau khi đo, cốc tinh dịch cần được bảo quản trong tủ ấm ở nhiệt độ 38,5 o C.
- Xác định hoạt lực tinh trùng A (%)
Kiểm tra tinh dịch ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể lợn đực giống trong vòng 5-10 phút là rất quan trọng Nên thực hiện kiểm tra ở nhiệt độ 38,5 độ C, sử dụng kính hiển vi kết nối với máy tính OPTIKA của Italy với độ phóng đại 1.000 lần để đảm bảo độ chính xác cao.
Sử dụng đũa thuỷ tinh sạch để lấy một giọt tinh dịch và đặt lên phiến kính sạch, ấm ở nhiệt độ 38,5 độ C Đậy giọt tinh dịch bằng một la-men kính khô sạch, đảm bảo giọt tinh dịch được phân bố đều ra bốn cạnh của lá kính Sau đó, đặt tiêu bản lên kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần để tiến hành đếm và ước lượng tỷ lệ tinh trùng tiến thẳng trong vi trường.
Hoạt lực tinh trùng được xác định theo thang điểm của Milovanov (1932)
Bảng 3.2 Thang điểm đánh giá hoạt lực của tinh trùng theo Milovanov (1932)
- Nồng độ tinh trùng, C (triệu/ml): là số tinh trùng có trong 1ml tinh nguyên Cách xác định: bằng máy so màu quang phổ CO7500 của Anh.
+ Đo độ hấp thu của tinh dịch lợn bằng bước sóng: 550 nm (490 – 590nm)
+ Trước hết đưa về 0 (lấy 10 ml môi trường vào ống cuvet đặt vào máy ấn nút R để trở về trạng thái ban đầu).
Để pha loãng tinh dịch, sử dụng 1 pipet tự động chia vạch để lấy 1 ml tinh nguyên và 9 ml môi trường, theo tỷ lệ 1:10 Sau khi pha loãng, cho tinh dịch vào ống cuvet và đặt lên máy so màu để đọc kết quả độ hấp thu.
Nồng độ tinh trùng được xác định theo độ hấp thu ở bảng sau:
Bảng 3.3 Độ hấp thu của nồng độ tinh trùng
- Nồng độ tinh trùng của mỗi đực giống được đo 2 lần và lấy giá trị trung bình
- Xác định chỉ tiêu tổng hợp VAC hay tổng số tinh trùng tiến thẳng (tỷ/lần khai thác):
VAC được tính bằng tích của 3 chỉ tiêu: thể tích (V), sức hoạt động của tinh trùng (A) và nồng độ tinh trùng (C).
Để xác định pH của tinh dịch, bạn cần sử dụng giấy đo pH của Đức Nhúng giấy vào tinh dịch cho đến khi ngập hoàn toàn và đọc kết quả sau 5 giây Thực hiện quy trình này 3 lần và lấy giá trị trung bình để có kết quả chính xác.
- Xác định tỷ lệ tinh trùng kỳ hình K (%):
Nhỏ một giọt tinh nguyên lên phiến kính sạch đã tẩy mỡ và nếu tinh dịch đặc, có thể pha loãng bằng vài giọt dung dịch nước sinh lý 0,85% Dùng đầu đũa thuỷ tinh sạch trộn đều hỗn hợp và dùng cạnh của phiến kính khác để dàn mỏng giọt tinh dịch Để lớp tinh dịch tự khô trong không khí, sau đó hơ qua ngọn lửa đèn cồn Nhỏ thuốc nhuộm xanh metylen lên lớp tinh dịch đã khô và đợi cho thuốc nhuộm ngấm từ 5-15 phút tùy theo mùa Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất, để khô hoặc hơ lên ngọn lửa, rồi quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần Cuối cùng, đếm số tinh trùng kỳ hình và không kỳ hình để xác định số lượng tinh trùng kỳ hình.
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K %) được tính bằng công thức K (%) = (n / N) x 100, trong đó n là số tinh trùng kỳ hình đếm được và N là tổng số tinh trùng (bao gồm cả kỳ hình và không kỳ hình) được đếm.
- Sức kháng của tinh trùng (R):
Hiện nay, phương pháp của Milovanov (1952) được áp dụng phổ biến để kiểm tra sức kháng của tinh trùng lợn ngoại và lợn lai Phương pháp này sử dụng ba ống nghiệm hoặc ba lọ có dung tích 10 ml, được đánh số thứ tự từ 1 đến 3.
3 Dùng pipet hút dung dịch NaCl 1% (đã được thanh trùng từ trước) cho vào ống 1: 5 ml, ống 2: 1 ml, ống 3: 0,5 ml Dùng micropipet hút 0,01 ml tinh nguyên cho vào ống 1, lắc nhẹ cho đều Như vậy ở ống 1 tinh dịch được pha loãng 500 lần (500x0,01) Hút 1 ml hỗn dịch ở ống 1 sang ống 2, lắc nhẹ để hỗn dịch đều Như vậy hỗn dịch ở ống 2 được pha loãng là
Để thực hiện quy trình kiểm tra tinh trùng, đầu tiên pha loãng mẫu ban đầu 1000 lần (500 x 2) Sử dụng ống hút khác, chuyển 0,5 ml hỗn dịch từ ống 2 sang ống 3, tạo ra độ pha loãng 2000 lần (1000 x 2) Dùng đũa thủy tinh khô sạch, lấy 1 giọt hỗn hợp từ ống 3, cho lên phiến kính đã rửa sạch và sấy khô, sau đó dàn mỏng và nâng nhiệt độ lên 40 - 41 độ C Kiểm tra dưới kính hiển vi với độ phóng đại 160 lần trở lên (A) Nếu tinh trùng vẫn còn tiến thẳng, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% vào ống 3, nâng mức pha loãng lên 2200 lần (1,1 ml x 2000) Tiếp tục kiểm tra A và lặp lại quá trình thêm NaCl cho đến khi không còn tinh trùng tiến thẳng.
Sức kháng của tinh trùng được tính theo công thức:
R = V/v (1), trong đó R biểu thị sức kháng của tinh trùng, V là lượng dung dịch NaCl 1% đã sử dụng, và v là lượng tinh dịch được dùng để kiểm tra Để tránh nhầm lẫn trong quá trình pha chế 3 ống, công thức này đã được chuyển đổi thành công thức tổng quát.
Sức kháng của tinh trùng (R) được xác định dựa trên mức pha loãng tinh dịch ở ống thứ 3 (r0 = 2000 lần) Mỗi lần thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% sẽ tạo ra mức pha loãng (r = 200), và n là số lần thêm dung dịch này.
Công thức tổng quát trên có thể sử dụng để tính sức kháng của hầu hết các loại gia súc gia cầm.
+ Phương pháp kiểm tra sức kháng tinh trùng của lợn nội
Do sức kháng tinh trùng của lợn nội thấp, phương pháp hai lọ được áp dụng Sử dụng hai ống nghiệm 10 ml, rửa sạch và sấy khô, ghi thứ tự lọ 1 và 2 Thêm 5 ml dung dịch NaCl 1% vào lọ 1 và 0,5 ml vào lọ 2 Nhỏ 0,01 ml tinh nguyên vào lọ 1, lắc nhẹ để pha loãng tinh dịch 500 lần Hút 0,5 ml từ lọ 1 sang lọ 2, lắc đều để tinh dịch được pha loãng 1.000 lần Cuối cùng, lấy 1 giọt hỗn hợp từ lọ 2 nhỏ lên phiến kính đã rửa sạch và sấy khô, dàn mỏng bằng đũa thủy tinh và nâng nhiệt độ lên 40°C.
Để kiểm tra hoạt lực của tinh trùng, mẫu được đưa lên kính hiển vi với độ phóng đại 160 lần trở lên Nếu vẫn còn tinh trùng tiến thẳng, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% vào và tiếp tục kiểm tra cho đến khi không còn tinh trùng tiến thẳng Sau đó, áp dụng công thức tổng quát để tính toán, với r o = 1.000 và r = 100 Trong thụ tinh nhân tạo, yêu cầu sức kháng của tinh trùng lợn ngoại phải đạt tối thiểu 3000 lần, trong khi lợn nội yêu cầu tối thiểu 1500 lần.
3.3.3 Phương pháp kiểm tra ảnh hưởng của mùa vụ đến chất lượng tinh dịch Số liệu khai thác tinh dịch lợn tại Trung tâm theo các mùa (xuân, hè, thu, đông) trong năm để phân được sử dụng để phân tích đánh giá chất lượng tinh dịch lợn.
3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu
- Số liệu được thu thập tại Trung tâm giống lợn Đông Mỹ từ tháng 9 năm 2013 đến tháng 6 năm 2015.
- Số liệu trực tiếp thực nghiệm từ tháng 7 năm 2015 đến tháng 5 năm 2016
- Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và SAS 9.1 (2002).