Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được nghiên cứu từ tháng 11/2015 đến tháng 4/2016 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu
-Phòng thí nghiệm Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương (TTCĐ)
- Khu nuôi động vật ATSH của TTCĐ
- Phòng thí nghiệm ATSH củaTTCĐ.
Nguyên liệu, đối tượng dùng trong nghiên cứu
- Gà và vịt 1 ngày tuổi
Vacxin CGC là loại vacxin vô hoạt tái tổ hợp cúm H5 nhị giá, bao gồm chủng Re-6 và Re-8, được nhập khẩu từ Trung Quốc Vacxin này được phát triển từ virus H5N1 clade 2.3.2.1 (chủng Re-6) và virus H5N6 clade 2.3.4.4 (chủng Re-8), nhằm tăng cường khả năng phòng ngừa bệnh cúm gia cầm.
- Virus cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4B phân lập từ mẫu gà ở Lạng Sơn ngày 08/01/2016 (A/Ck/Vietnam/LangSon/16A10/2016(H5N6)
- Kháng nguyên chuẩn H5N1 dùng cho phản ứng HI: A/ck/VN1203/2004 (clade 1), A/Hubei/1/2010 (clade 2.3.2.1) và A/ck/VN/LangSon(TrangDinh)- NCVD140450(14A324)/2014 (H5N6 clade 2.3.4.4).
3.2.2 Các loại dung dịch, môi trường
- Môi trưởng bảo quản swabs
- Bộ kit chiết tách ARN, kit nhân gen qRT-PCR
- Prime, Probe, đối chứng dương H5N6.
Trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm
Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh, tủ lạnh âm sâu 80 độ C, tủ lạnh âm 20 độ C, hệ thống bơm hút chân không dùng trong chiết tách RNA, và máy Real time PCR (RT-PCR) là những thiết bị quan trọng trong nghiên cứu và phân tích sinh học.
- Phòng thí nghiệm ATSH cấp 2 để phân lập virus
- Phòng nuôi động vật ATSH cấp 2+ để công cường độc.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Tình hình dịch bệnh cúm trên đàn gia cầm tại Việt Nam
- Nghiên cứu sự phân bố và lưu hành các chủng virus cúm gia cầm trên địa bàn cả nước
- Đánh giá hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 + Re-8 khi tiêm cho đàn gà, vịt thí nghiệm
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và mức độ bài thải virus của gà thí nghiệm sau khi công cường độc
+ Nghiên cứu các triệu chứng lâm sàng của gia cầm sau công cường độc
+ Xét nghiệm virus bài thải
+ So sánh hiệu giá kháng thể trung bình và tỉ lệ bảo hộ lâm sàng của lô gà và vịt
+ Bệnh tích đại thể của đàn gà, vịt sau khi công cường độc 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu
Gà và vịt được lựa chọn từ đàn sạch bệnh, chưa tiêm phòng vacxin CGC và không có kháng thể kháng cúm H5 Trước khi tiêm vacxin, khoảng 30% tổng đàn gà, vịt sẽ được lấy máu để kiểm tra kháng thể kháng cúm gia cầm bằng phương pháp HI với kháng nguyên H5N1.
Bố trí tiêm vacxin cho gà gồm 50 con, chia thành lô Vacxin 30 con và lô Đối chứng 20 con Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, 30 gà trong lô Vacxin sẽ được tiêm 1 mũi lúc 3 tuần tuổi, trong khi gà thuộc lô Đối chứng sẽ không được tiêm.
Bố trí tiêm vắc xin cho 50 con vịt được chia thành hai nhóm: lô Vắc xin gồm 30 con và lô Đối chứng gồm 20 con Nhóm Vắc xin sẽ được tiêm một mũi vắc xin khi 3 tuần tuổi và nhắc lại vào lúc 6 tuần tuổi theo khuyến cáo của nhà sản xuất, trong khi vịt thuộc lô Đối chứng sẽ không được tiêm.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin
Tiêm vacxin Vịt Đối chứng
- Ba tuần sau khi hoàn tất liệu trình vacxin, lấy máu gà, vịt để xác định hiệu giá kháng thể kháng H 5 của virus CGC bằng phương pháp
HI với kháng nguyên H5N1 đồng chủng vacxin (hoặc gần với chủng virus vacxin nhất) và kháng nguyên virus dùng để công cường độc
Công cường độc cho gà được thực hiện ở tuổi 6 tuần và cho vịt ở tuổi 9 tuần, tức là 3 tuần sau khi hoàn tất liệu trình tiêm vacxin Việc lựa chọn gà, vịt để công cường độc dựa trên tỷ lệ phân bố hiệu giá kháng thể đối với kháng nguyên đồng chủng vacxin Mỗi loài sẽ bao gồm 10 con từ lô vacxin và 5 con từ lô đối chứng, trong khi số còn lại sẽ được giữ lại để dự phòng.
Trong vòng 10 ngày sau khi công bố cường độc, cần theo dõi và chấm điểm lâm sàng hàng ngày theo quy trình của OIE Việc đánh giá sẽ được thực hiện dựa trên các mức độ khác nhau, trong đó có mức điểm không chấm điểm là 1.
- Mổ khám gia cầm chết, đánh giá bệnh tích đại thể Mổ khám gia cầm sống sót để so sánh bệnh tích với những con chết
Lấy mẫu swab hầu họng vào ngày thứ 3, ngày thứ 10 và vào ngày gia cầm chết sau khi tiêm công cường độc để tiến hành xét nghiệm virus bài thải bằng phương pháp Real-time RT-PCR.
- Lấy mẫu huyết thanh gia cầm sống sót vào ngày thứ 10 để đánh giá đáp ứng miễn dịch đối với virus cường độc
3.4.2.2 Phương pháp điều tra hồi cứu
Thu thập và tổng hợp thông tin từ Cục Thú y về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch CGC, kết quả tiêm phòng vacxin và xét nghiệm giám sát huyết thanh sau tiêm phòng qua các năm giúp đánh giá hiệu quả của việc tiêm phòng vacxin cúm trên thực địa.
3.4.2.3 Chuẩn đoán phòng thí nghiệm
Sơ đồ chẩn đoán bệnh cúm gia cầm yêu cầu tất cả các thao tác xử lý mẫu, chiết tách ARN và phân lập virus phải được thực hiện trong buồng an toàn sinh học cấp 2 trở lên Điều này đảm bảo an toàn cho người thực hiện và độ chính xác của kết quả chẩn đoán Việc lấy mẫu bệnh phẩm là bước đầu tiên trong quy trình này.
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên
Mẫu xét nghiệm kháng nguyên yêu cầu lấy từ 3 đến 5 gam bệnh phẩm từ các bộ phận như não, phổi, khí quản, lách hoặc ruột của gia cầm bị bệnh Đối với gia cầm còn sống, cần sử dụng tăm bông để lấy dịch ổ nhớp, họng hoặc phân tươi, sau đó hòa vào dung dịch PBS có pH từ 7,2 đến 7,4, kèm theo dung dịch kháng sinh theo tỷ lệ 1:10.
Dung dịch muối đệm phosphat (PBS):
+ Natri clorua (NaCl) + Natri hydro photphat dihydrat (Na 2 HPO 4 2H 2 O) + Kali dihydro photphat (KH 2 PO 4 )
+ Kali clorua (KCl) + Nước cất
Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N Hấp vô trùng ở 121 o C trong 30 giây
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
Chỉ thực hiện lấy máu từ gia cầm chưa tiêm vacxin cúm gia cầm Sử dụng xy lanh 5 ml để lấy 1 ml máu, rút cán xy lanh tối đa để tạo khoảng trống Đặt xy lanh nghiêng 5 độ ở nhiệt độ 20 đến 30 độ C trong 30 phút để máu đông lại và tiết ra huyết thanh Sau đó, chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để phục vụ cho xét nghiệm.
Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2 o C đến 8 o C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24h b Phát hiện kháng nguyên
- Mẫu bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột)
+ Nghiền 1 gam bệnh phẩm bằng cối chày sứ với dung dịch PBS pH 7,2 theo tỉ lệ 1:10 thành huyễn dịch 10 %
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm Ly tâm ở tốc độ 8 000 r/min trong 15 s
Chia dịch bệnh phẩm thành hai ống 1,5 ml Một ống sẽ được sử dụng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR (rRT-PCR), phân lập virus trên tế bào và trên trứng, trong khi ống còn lại sẽ được bảo quản mẫu ở nhiệt độ -80 o C.
- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản, phân tươi
+ Lắc ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc trong 15 s, ly tâm ống ở tốc độ 8000 g/min trong 15 giây
Sử dụng pipet để chuyển dịch từ ống sang hai ống 1,5 ml Một ống sẽ được dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR, phân lập virus trên tế bào hoặc trên trứng, trong khi ống còn lại được bảo quản làm mẫu lưu ở nhiệt độ -80°C.
*) Phương pháp Realtime PCR (phụ lục 4)
Tất cả các quy trình tiêm truyền trứng và thu hoạch nước trứng (dịch niệu mô) sau khi phân lập cần được thực hiện trong môi trường an toàn sinh học cấp 3 để đảm bảo an toàn và hiệu quả.
+ Mỗi mẫu bệnh phẩm cần được tiêm truyền lên 3 trứng
+ Chọn trứng gà có phôi 9 ngày đến 10 ngày tuổi khoẻ mạnh không có kháng thể cúm
+ Lau trứng bằng cồn 70 % và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi
+ Dùng xi lanh 1 ml với kim 23G và hút dịch bệnh phẩm tiêm phía trên buồng hơi thẳng xuống xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng
+ Bịt lỗ tiêm trên vỏ trứng bằng keo dán
+ Đặt trứng trong tủ ấp trứng 37 o C và theo dõi trong vòng 72 h
+ Soi trứng mỗi ngày 2 lần, nếu phát hiện trứng chết, giữ trứng trong tủ lạnh (4 o C) cho đến khi thu hoạch dịch niệu mô để giám định virus.
+ Đối với trứng không chết sau 72 h, cất vào tủ lạnh (4 o C) qua đêm hoặc ít nhất 4 h trước khi thu hoạch dịch niệu mô cho giám định virus.
- Thu hoạch dịch niệu mô
+ Dùng panh và kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên
+ Thu hoạch dịch niệu mô từ 5 ml đến 10 ml/trứng vào các ống nghiệm riêng rẽ để giám định virus
Trước khi tiến hành giám định, cần sử dụng phương pháp HA để xác định sự hiện diện của virus cúm gia cầm, bao gồm Newcastle và vi rút gây hội chứng giảm đẻ, trong dịch niệu mô Nếu kết quả HA dương tính, điều này có nghĩa là dịch niệu mô đã chứa virus.
+ Giám định virus trong dịch niệu mô bằng phương pháp HI sử dụng kháng huyết thanh chuẩn H5 hoặc bằng phương pháp Realtime RT-PCR.
+ Kết quả giám định (bằng HI hoặc phản ứng realtime RT- PCR hoặc RT-PCR) dương tính, dịch niệu mô có virus cúm gia cầm H5N1
+ Kết quả giám định âm tính, dịch niệu mô không có virus cúm gia cầm.
Trong trường hợp giám định âm tính, sử dụng dịch niệu mô thu hoạch ở lần thứ nhất để tiêm truyền trứng lần hai, sau đó theo dõi và thu hoạch dịch niệu mô như lần thứ nhất để giám định Nếu kết quả giám định lần hai vẫn âm tính, có thể kết luận mẫu âm tính với virus cúm gia cầm H5N1 và tiến hành phát hiện kháng thể.