Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại tỉnh Phú Thọ.
Thời gia nghiên cứu
Từ tháng 01 năm 2011 đến tháng 12 năm 2016.
Đối tượng/vật liệu nghiên cứu
- Bệnh Dại trên đàn chó nuôi trên địa bàn tỉnh Phú Thọ.
- Các mẫu xét nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y.
Nội dung nghiên cứu
3.4.1 Điều tra tình hình nuôi chó trên địa bàn tỉnh Phú thọ giai đoạn 2011–2016
Số liệu thu thập, xử lý, tổng hợp từ Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ.
3.4.2 Điều tra tình hình tiêm phòng bệnh Dại cho chó trên địa bàn tỉnh Phú thọ giai đoạn 2011 – 2016
Số liệu thu thập, xử lý, tổng hợp từ Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ và Trung tâm y tế dự phòng tỉnh Phú Thọ.
3.4.3 Điều tra tình hình bệnh Dại trên địa bàn tỉnh Phú thọ giai đoạn
- Trong 05 năm giám sát (từ năm 2011 - 2015), thu thập số liệu; phân tích số liệu về bệnh Dại trên địa bàn tỉnh Phú Thọ.
- Trong năm 2016, tiến hành công tác giám sát chủ động bệnh Dại trên địa bàn tỉnh Phú Thọ.
- Hằng ngày theo dõi, tổng hợp các trường hợp người bị chó cắn (chó nghi nhiễm bệnh Dại) trên toàn bộ địa bàn tỉnh Phú Thọ.
- Nhóm giám sát đến gặp trực tiếp người đó hoặc người thân để thu thập thông tin.
- Tiến hành điều tra các trường hợp chó nghi bị bệnh Dại.
3.4.4 Giám sát bệnh Dại trên địa bàn tỉnh Phú thọ năm 2016
29 địa bàn 03 địa phương nêu trên Ghi chép thông tin theo biểu mẫu 1 tại phụ lục
- Tiến hành đến các trường hợp chó nghi nhiễm bệnh Dại để điều tra, thu thập thông tin.
- Nếu chó bị ốm hoặc xuất hiện dấu hiệu của bệnh Dại thì tiến hành lấy mẫu để xét nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu
- Số liệu tổng đàn chó được tổng hợp từ mạnh lưới thú y cơ sở báo có về Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ.
- Số liệu tiêm phòng được mạnh lưới thú y cơ sở ghi chép lại và tổng hợp báo cáo về Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ.
Hằng ngày, nhóm giám sát tại tỉnh Phú Thọ tiếp nhận thông tin về các trường hợp điều trị dự phòng sau khi bị chó cắn, đặc biệt là những trường hợp chó nghi nhiễm bệnh Dại Nhóm này tổ chức theo dõi và tổng hợp dữ liệu liên quan để đảm bảo an toàn cho cộng đồng.
- Tìm kiếm thông tin từ các nguồn báo cáo khác (từ người dân báo, từ thông tin báo đài, từ điểm giết mổ chó…).
Tổ chức sẽ trực tiếp gặp gỡ người bị chó cắn hoặc người thân của họ để thu thập thông tin, xác định thêm các nạn nhân khác và tư vấn về phơi nhiễm cũng như điều trị dự phòng theo biểu mẫu 1 trong phụ lục.
Khi xác định chó nghi mắc bệnh Dại, cần tổ chức bắt chó và lấy mẫu gửi về Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương để tiến hành xét nghiệm Quy trình này phải được thực hiện trong vòng 48 giờ, thông tin sẽ được ghi theo biểu mẫu 2 trong phụ lục.
Hình 3.1 Mô hình điều tra
Hình 3.2 Thời gian điều tra giám sát 3.5.2 Phương pháp xét nghiệm
3.5.2.1 Phương pháp xét nghiệm mẫu
Quá trình lấy mẫu cho chó nghi mắc bệnh Dại bao gồm việc trợ tử và cắt lấy phần đầu, sau đó đầu chó được bọc kín trong ba lớp nilon sạch và đặt trong hộp xốp có đá lạnh, được dán kín Bề mặt ngoài của hộp xốp được khử trùng trước khi mẫu được chuyển về bảo quản trong tủ âm sâu tại Chi cục Thú y trong vòng tối đa 48 giờ Cuối cùng, mẫu sẽ được gửi đến Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương để tiến hành xét nghiệm mô não.
Tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y, phương pháp xét nghiệm DFA (Kháng thể huỳnh quang trực tiếp) được áp dụng để sàng lọc các mẫu có kết quả dương tính với bệnh Dại.
- Gửi mẫu đến Trung tâm Dự phòng và Kiểm soát Bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) để phân tích chuyên sâu - nếu cần thiết.
- Viết bút chì lên slide để ký hiệu mẫu gồm mã PTN của mẫu, ngày chuẩn bị, và loại mô não như minh họa dưới đây:
Vị trí làm tiêu bản mô não trong 3 ô tròn Đ N 08 /3 /1 6 16 R 3
- Tiêu bản có thể được chuẩn bị từ mẫu não tươi vừa mổ hoặc mẫu não được bảo quản nhiệt độ âm.
- Cắt mô não ở các phần Đại não (ĐN), Tiểu não (TN), và Cuống não
(CN) thành miếng nhỏ, kích thước khoảng 0.5 x 0.5 cm2.
- Áp slide vào mẫu để mô não dính vào tạo thành 1 lớp mỏng Mỗi vị trí mô não tương ứng với 1 ô trên slide.
- Để slide khô tự nhiên rồi chuyển vào ống chứa Acetone lạnh ở - 20C Cố định trong 2 -4 h.
- Lấy 1 slide đối chứng dương và 1 slide đối chứng âm (đã chuẩn bị và cố định acetone) Lấy slide mẫu ra khỏi dung dịch cố định.
- Rửa các slide 1 lần bằng dung dịch PBS, để khô.
- Pha kháng thể gắn huỳnh quang thành dung dịch 1/40 trong nước cất
- Nhỏ kháng thể lên slide, mỗi tiêu bản nhỏ 60 – 100 uL.
- Ủ trong hộp ẩm ở buồng tối, nhiệt độ 37C/30 phút hoặc nhiệt độ phòng trong 45 phút.
- Sau khi ủ, rửa slide 3 lần với PBS, mỗi lần trong 5 phút.
- Để khô slide, đậy coverslip bằng dung dịch Mounting medium.
- Đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang, bước sóng
Đối chứng dương cho thấy sự xuất hiện của hạt phát huỳnh quang màu xanh lá mạ trong bào tương tế bào Mật độ huỳnh quang được đánh giá từ 0 đến 4+, trong đó điểm số cao hơn tương ứng với sự hiện diện nhiều hơn của virus.
- Đối chứng âm: Không thấy hiện tượng phát huỳnh quang.
- Mẫu được coi là dương tính khi hiện tượng phát huỳnh quang như đối chứng dương.
- Mẫu được coi là âm tính nếu không có phát huỳnh quang như đối chứng âm.
3.5.2.2 Phương pháp xử lý số liệu
- Số liệu thu thập được nhập và phân tích bằng chương trình
Ms Excel 2010 và các phần mềm thống kê sinh học khác.