Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
- Tuyến trùng Meloidogyne sp được thu trên vườn hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông;
- Các vườn hồ tiêu thời kỳ kinh doanh;
- Một số chế phẩm bảo vệ thực vật sử dụng trong thí nghiệm thử thuốc. 3.1.2 Dụng cụ nghiên cứu
3.1.2.1 Dụng cụ sử dụng tách lọc và đếm tuyến trùng:
- Hệ thống phễu Baermann, rây lọc tuyến trùng;
- Bình xịt, bình tia, máy xay, rây lọc, giấy thấm, ống tuýp nhỏ đường kính 1,2 cm - cao 75 mm, đĩa petri kẻ ô, đồng hồ đếm…
3.1.2.2 Dụng cụ sử dụng trong làm tiêu bản tuyến trùng
- Lam kính, lamen, desicator, đèn cồn;
- Chén lõm,kim gắp tuyến trùng, ống đồng, đèn cồn;
3.1.2.3 Vật dụng sử dụng trong thử thuốc
- Chậu nhựa, đất sạch (hấp khử trùng);
- Cốc đong, đĩa petri nhựa đường kính 5cm;
- Chế phẩm sinh học, thuốc hóa học.
- Formalin 4- 6%, Glycerin, kháng sinh Steptomycine;
- Hóa chất dùng trong tách DNA và chạy PCR.
- Kính lúp soi nổi (Nikon SMZ1500);
- Kính hiển vi quang học;
- Máy chạy điện di, máy chụp băng điện di.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu thành phần loài tuyến trùng chính hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
3.2.2 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái chủ yếu và đặc điểm phân tử của loài tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne incognita) 3.2.3 Nghiên cứu diễn biến phát sinh gây hại của quần thể tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne incognita) hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
3.2.4 Thử nghiệm hiệu lực phòng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu của một số chế phẩm bảo vệ thực vật
3.3.1 Nghiên cứu thành phần loài tuyến trùng chính hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
3.3.1.1 Thu thập mẫu đất và mẫu rễ hồ tiêu
Chúng tôi đã chọn 5 vườn tiêu tiêu biểu từ các khu vực sản xuất hồ tiêu tập trung tại huyện Đăk Song, Đắk Nông Mỗi vườn sẽ thu thập 6 cây tiêu, bao gồm 3 cây khỏe mạnh và 3 cây có biểu hiện vàng lá Những vườn có ít cây bệnh và cây khỏe mạnh sẽ được lấy mẫu cây khỏe và cây bệnh để phục vụ cho việc phân tích đặc điểm của vùng đó.
Nghiên cứu mẫu rễ và mẫu đất dưới tán cây hồ tiêu được thực hiện ở độ sâu 15-20 cm, nhằm so sánh giữa cây có triệu chứng bệnh vàng lá (chết chậm) và cây khỏe mạnh Mỗi cây được điều tra với 3 điểm lấy mẫu theo hình tam giác đều, lấy gốc cây làm trung tâm Mỗi mẫu rễ có trọng lượng từ 20-30 g, trong khi mỗi mẫu đất nặng 500 g.
Hình 3.1 Vị trí lấy mẫu
Mẫu đất và rễ cần được bảo quản trong túi nilon, ghi rõ ngày tháng và địa điểm lấy mẫu Sau đó, mẫu sẽ được mang về phòng thí nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ 5-10°C trong tủ lạnh để tiến hành phân tích sau.
+ Địa điểm điều tra: tại Đăk Song, Đăk Nông.
Thời gian điều tra loài trên vườn hồ tiêu được thực hiện hai lần mỗi năm, vào đầu mùa mưa vào tháng 5 và cuối mùa mưa vào tháng 9, khi mà sự phong phú về thành phần loài đạt mức cao nhất.
+ Tách tuyến trùng trong đất và rễ theo phương pháp của Kirjanova and Krall, 1969; Nguyễn Vũ Thanh và Nguyễn Ngọc Châu, 1992.
Để phân tích mức độ gây hại và số lượng tuyến trùng ở rễ, từ mỗi mẫu thu được, chúng tôi tiến hành lấy trung bình 5g rễ và 250g đất Tuyến trùng được tách lọc từ mẫu đất bằng phương pháp lọc tĩnh, trong khi đó, việc tách tuyến trùng từ rễ được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Ngọc Châu (2003).
- Lọc tuyến trùng từ đất
Hình 3.2 Phân loại mẫu và tiến hành lọc mẫu đất
Hệ thống lọc tuyến trùng được thiết kế dựa trên phương pháp Baermann, bao gồm một phễu thủy tinh có đường kính 13,5 cm và cuống dài 8 cm Phần dưới của cuống phễu kết nối với ống silicon đường kính 1,5 cm, dài 9,5 cm, và phía dưới ống silicon là ống tuýp đường kính 1,2 cm, cao 7,5 cm Cốc đựng đất bằng nhựa có đường kính 7,6 cm và cao 5 cm, với đáy cốc là lưới rất mịn đặt trên phễu Hệ thống lọc được lắp đặt trên giá sắt cao 30 cm và đặt trên mặt đá để hạn chế rung động.
+ Lắc đều túi mẫu đất, mỗi mẫu lấy ra 250 g cho vào các cốc đựng đất như mô tả ở trên.
+ Làm ẩm đất bằng cách dung bình phun tay phun nhẹ đều lên mặt
+ Cho nước vào phễu, ước lượng mực nước sao cho khi cho cốc chứa đất vào thì lớp nước sẽ ngập bề mặt của đất.
+ Nhẹ nhàng đặt cốc đất vào phễu, bổ sung thêm nước vào phễu nếu cần
+ Thời gian lọc là 48 giờ.
+ Khi thu mẫu, nhẹ nhàng tháo ống nghiệm ra khỏi ống silicon, ghi nhãn, đậy nắp và giữ trong tủ lạnh.
Để tiến hành đếm mẫu tuyến trùng, trước tiên bạn cần lọc mẫu vào hộp petri có chia ô Sau đó, đặt hộp petri lên kính hiển vi soi nổi và thực hiện việc đếm số lượng tuyến trùng, có thể đếm theo số lượng bình quân trên mỗi ô hoặc đếm toàn bộ mẫu.
- Lọc tuyến trùng từ rễ
Theo phương pháp xay rễ được mô tả trong “Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ” của Nguyễn Ngọc Châu (2003), gồm các bước:
+ Mẫu rễ rửa sạch, lau khô, mỗi mẫu cân lấy 5 g, dùng kéo cắt nhỏ (chiều dài khoảng 5 mm).
Cho mẫu đã cắt vào cối xay sinh tố và thêm nước vừa đủ để ngập lưỡi dao Xay trong 10 giây, sau đó nghỉ 10 giây; tiếp tục xay 10 giây, nghỉ 5 giây, và cuối cùng xay thêm 5 giây.
Mở nắp và sử dụng vòi nước để xả vào, giúp các phần rễ đã xay bám vào nắp và thành cối rơi xuống đáy cối thu thập tuyến trùng Sau đó, lọc qua lưới lọc để loại bỏ các phần gỗ và cặn bã thô Xả nước mạnh để đẩy phần tuyến trùng trong rễ xuống dưới, và cuối cùng lọc bằng rây 38.
+ Thu mẫu vào hộp nhựa nhỏ bằng cách dùng bình phun tia gạn tuyến trùng vào trong lọ.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Đếm số lượng tuyến trùng trên 5g rễ bằng kính lúp soi nổi (Nikon SMZ1500).
Để cố định và bảo quản tuyến trùng kí sinh thực vật, các mẫu thu được từ các phương pháp tách lọc sẽ được đưa vào dung dịch TAF, theo phương pháp của Courtney, Polley và Miller (1955).
+ Theo các tài liệu phân loại của Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn
Vũ Thanh (2000), Siddiqi (2000) Castillo and Vovlas (2007), Perry and Moens (2009), Ryss (2002).
3.3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và phân tử của loài tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne incognita) hại hồ tiêu
- Xác định một số đặc điểm hình thái cơ bản của loài tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita.
Nghiên cứu này mô tả các đặc điểm hình thái cơ bản của loài tuyến trùng gây nốt sưng, được quan sát qua kính lúp Nikon SMZ1500 Phương pháp nghiên cứu dựa trên các tài liệu của Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1999), Loof P.A.A (1991), Nguyễn Ngọc Châu (2003), cùng với Castillo và Vovlas (2007).
Làm tiêu bản tuyến trùng và phân loại theo phương pháp của Franklin and Goodey (1949).
Để chuẩn bị mẫu tuyến trùng, trước tiên gắp khoảng 5-10 tuyến trùng lên lam lõm, nhỏ một lượng Lactophenon hoặc glycerol vừa đủ, sau đó đậy lamen và cố định bằng bông Canada Nếu không có bông Canada, có thể sử dụng paraphin để cố định bằng cách trải một lớp mỏng xung quanh vết lõm, đặt lamen cố định và hơ trên ngọn lửa nhẹ để paraphin chảy ra gắn kín lại Đối với tiêu bản mẫu cutin vùng chậu con cái của Meloidogyne, đưa con cái vào môi trường axit lactic 45%, cắt phần đầu bằng dao mổ, và dùng kim gắp nhấn nhẹ từ đuôi đến vết cắt để đẩy dịch bên trong ra ngoài Cắt 1/3 phía sau cơ thể và lật úp các tấm đã cắt xuống, làm sạch bằng đầu kim gắp, sau đó đưa các tấm đã làm sạch vào giọt glycerin để hoàn thiện tiêu bản (David et al., 2009).
Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái
Trước khi phân loại, tuyến trùng sẽ được làm tiêu bản cố định ở giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm để quan sát dưới kính hiển vi quang học Phương pháp này cho phép phân biệt nhanh chóng các giống tuyến trùng thông qua các đặc trưng hình thái quan trọng, bao gồm cấu trúc vùng đầu, vị trí lỗ bài tiết, đường bên, và cấu trúc dạng đuôi ở ấu trùng cảm nhiễm Ngoài ra, số lượng và vị trí nhú sinh dục, hình dạng gai giao cấu và gai đệm ở con đực, cùng với hình dạng, cấu trúc vulva và đuôi của con cái cũng là những yếu tố quan trọng trong việc phân loại.
Phương pháp làm tiêu bản bằng glycerol – ethanol (Seinhorst, 1959)
Tuyến trùng sau khi được xử lý bằng nước nóng ở nhiệt độ 50-60 độ C sẽ được bảo quản trong lọ thủy tinh chứa dung dịch cố định TAF Sau một tuần, chúng sẽ được chuyển sang đĩa thủy tinh sâu có 0,5ml dung dịch I và đặt trong bình thủy tinh kín có chứa khoảng 1/10 thể tích là cồn 96% ở áp suất bão hòa Toàn bộ bình thủy tinh cần được đặt trong tủ ấm ở 40 độ C ít nhất 12 giờ Sau thời gian này, các đĩa thủy tinh sẽ được lấy ra khỏi bình và tiếp tục để trong tủ ấm, bổ sung dung dịch II sau mỗi 2-3 giờ, khoảng 3-4 lần, và để trong tủ ấm tối thiểu 12 giờ Cuối cùng, tuyến trùng có thể được sử dụng làm tiêu bản.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2015 đến tháng 12/2016;
+ Bộ môn Côn Trùng, Viện Bảo vệ thực vật.
+ Xã Thuận Hà - Huyện Đăk Song – Tỉnh Đăk Nông.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Tình hình sản xuất hồ tiêu tại Đăk Nông và thành phần loài tuyến trùng chính gây hại trên hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
PHẦN LOÀI TUYẾN TRÙNG CHÍNH GÂY HẠI TRÊN HỒ TIÊU TẠI ĐĂK
4.1.1 Tình hình sản xuất hồ tiêu tại Đăk Nông Đăk Nông là một tỉnh vùng Tây Nguyên có điều kiện tự nhiên rất phù hợp để phát triển nhiều loại cây công nghiệp dài ngày như cà phê, hồ tiêu, điều, cao su Theo Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Đăk Nông, diện tích trồng hồ tiêu của tỉnh năm 2004 là 6,544 ha Năm 2005 diện tích hồ tiêu giảm xuống chỉ còn 5.575 ha do bị dịch bệnh Tuy nhiên đến năm 2015, diện tích hồ tiêu của Đăk Nông tăng rất nhanh lên tới 16.350 ha, đến tháng 9/2016 điện tích hồ tiêu đã đạt 20,579 ha (trồng mới là 4.229 ha, cây thời kỳ kiến thiết cơ bản 6.763 ha và kinh doanh là 9.578 ha) Trong khi đó, theo đinh hướng của của tỉnh Đăk Nông đến năm 2020, diện tích trồng hồ tiêu ổn định là 10.000 ha.
Hiện nay, diện tích hồ tiêu trồng tại Đăk Nông đã vượt mức định hướng với 10.579 ha Sản xuất hồ tiêu chủ yếu tập trung ở các huyện Đăk Song, Đăk RLấp, Cư Jut, Đăk Mil và Tuy Đức, trong đó Đăk Song dẫn đầu với diện tích 8.000 ha.
Bảng 4.1 Diện tích, sản lượng hồ tiêu tại tỉnh Đăk Nông năm 2016 Địa điểm Tổng số
Diện tích cho sp (ha)
NS trên DT cho SP
Trong những năm gần đây, diện tích trồng hồ tiêu ở Đăk Nông đã mở rộng đáng kể nhờ vào giá hạt tiêu luôn duy trì ở mức cao và ổn định Điều này đã khiến nhiều hộ gia đình tại Đăk Nông quyết định chuyển đổi từ trồng cà phê sang trồng tiêu, nhằm tối ưu hóa lợi nhuận từ cây trồng.
Sự gia tăng nhanh chóng diện tích trồng tiêu đã dẫn đến khó khăn trong việc kiểm soát, khi nhiều hộ nông dân áp dụng biện pháp thâm canh chưa hợp lý Họ thường bón phân không cân đối, thừa đạm và thiếu quan tâm đến phân hữu cơ, không phù hợp với từng giai đoạn phát triển của cây tiêu Điều này đã tạo điều kiện cho các dịch hại, đặc biệt là nấm đất và tuyến trùng, bùng phát, gây thiệt hại nghiêm trọng cho vườn tiêu Tính đến tháng 6/2016, toàn tỉnh Đăk Nông đã ghi nhận 455,8 ha tiêu bị nhiễm bệnh, trong đó có 311,2 ha nhiễm nhẹ, 44,25 ha nhiễm nặng, và 90,78 ha bị nhiễm tuyến trùng.
57 ha bị chết Nhiều hộ nông dân lâm vào cảnh nghèo đói, mất vốn làm ăn, không có khả năng chi trả ngân hàng.
4.1.2 Thành phần loài tuyến trùng chính gây hại trên hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
Tuyến trùng hiện đang là một trong những mối đe dọa lớn đối với cây hồ tiêu, gây ra triệu chứng vàng lá chết chậm Sự xuất hiện của chúng không chỉ làm giảm năng suất và chất lượng của cây hồ tiêu, mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến thu nhập của người trồng Hơn nữa, tuyến trùng còn tạo điều kiện cho các loại nấm, vi khuẩn, và virus xâm nhập, dẫn đến sự phát triển của nhiều bệnh khác nhau, khiến cho vườn hồ tiêu dễ bị tàn phá và khó phục hồi.
Triệu chứng của tuyến trùng ký sinh rễ cà phê bao gồm sự hình thành các nốt sưng trên rễ, gây tổn thương và biến dạng bộ rễ, dẫn đến tình trạng thối rễ và cây chết Khi bộ rễ bị hủy hoại, cây sẽ còi cọc, kém phát triển, lá chuyển sang màu vàng, và quả cùng hạt nhỏ, chất lượng giảm sút Nếu bị hại nặng, cây có thể chết hoàn toàn Do tuyến trùng ký sinh dưới mặt đất, dấu hiệu tổn thương ban đầu thường ít được chú ý, và khi triệu chứng xuất hiện trên các bộ phận trên mặt đất, cây đã bị hại nghiêm trọng, khiến cho biện pháp phòng trừ trở nên kém hiệu quả.
Hình 4.1 Vườn hồ tiêu vàng lá, rễ tiêu bị tuyến trùng nốt sưng gây hại
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Năm 2015, nghiên cứu đã tiến hành thu thập mẫu rễ và đất từ cây hồ tiêu bị vàng lá tại xã Thuận Hà, huyện Đăk Song, Đăk Nông vào đầu và cuối mùa mưa để xác định thành phần loài tuyến trùng gây hại Thời điểm này cho thấy sự phong phú nhất của các loài trên đồng ruộng, sau đó mẫu được đưa về phòng thí nghiệm để tách lọc và giám định Kết quả về số lượng loài tuyến trùng tại Đăk Song, Đăk Nông trong năm 2015 được trình bày trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2.Thành phần loài tuyến trùng gây hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông, 2015
Kết quả nghiên cứu cho thấy, loài tuyến trùng ký sinh trên hồ tiêu tại Đăk Song – Đăk Nông rất đa dạng, với 7 loài thuộc 6 họ và 3 bộ khác nhau, bao gồm Tylenchida, Triplonchida và Dorylaimida Trong số các họ đã xác định, Heteroderidae là họ có số loài nhiều nhất với 2 loài, trong khi các họ khác chỉ có một loài mỗi họ.
So với nghiên cứu của Lê Đức Khánh và cộng sự năm 2013 về thành phần loài tuyến trùng trên hồ tiêu tại Đăk Nông, năm 2015, chúng tôi đã phát hiện thêm loài Pratylenchus sp trong mẫu thu thập từ vườn tiêu tại Đak Song – Đăk Nông Loài này được biết đến là tuyến trùng gây vết thương, thường gây hại nhiều hơn trên cây cà phê so với hồ tiêu Để đánh giá mức độ gây hại của các loài tuyến trùng trong mẫu đất và rễ hồ tiêu, chúng tôi đã tính toán tần suất xuất hiện và mật độ trung bình của các loài trong năm 2015, với kết quả được trình bày trong Bảng 4.3.
Bảng 4.3 Tần suất xuất hiện và mật độ tuyến trùng ký sinh hồ tiêu tại Đăk Song – Đăk Nông, 2015
Ghi chú: Số liệu mật độ của các loài tuyến trùng được thể hiện qua giá trị
Kết quả từ Bảng 4.3 cho thấy trong mẫu đất và mẫu rễ hồ tiêu, tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita chiếm ưu thế Cụ thể, loài tuyến trùng này có mặt trong 88,5% các mẫu đất và 62,8% các mẫu rễ hồ tiêu.
% trong các mẫu rễ với mật độ tương đối cao (560,6 con/100 gr đất và 81,6 con/5g rễ).
Loài Rotylenchulus reniformis được phát hiện trong 30,5% mẫu đất và 3,5% mẫu rễ, với mật độ 229,1 con/100 gram đất và 6,2 con/5 gram rễ Trong khi đó, Meloidogyne spp xuất hiện trong 5,6% mẫu đất và 4,7% mẫu rễ, với mật độ lần lượt là 15 con/100 gram đất và 22 con/5 gram rễ Các loài khác có mặt ít hơn và mật độ tương đối thấp.
Kết quả điều tra cho thấy trong mẫu rễ hồ tiêu có sự hiện diện của các loài tuyến trùng Meloidogyne incognita, Meloidogyne spp và Rotylenchulus reniformis, trong đó chủ yếu là Meloidogyne incognita với tần suất xuất hiện 62,8% và mật độ trung bình 81,6 con/5 gr rễ Điều này cho thấy Meloidogyne incognita là loài tuyến trùng gây hại chủ yếu trên hồ tiêu, phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh.
Nghiên cứu này tập trung vào đặc điểm hình thái và phân tử của loài Meloidogyne incognita, dựa trên các ghi nhận từ Trịnh T T Thủy và cộng sự (1993), Lê Đức Khánh và cộng sự (2005), và Lê Đức Khánh cùng cộng sự (2014).
Một số đặc điểm hình thái và phân tử của loài tuyến trùng gây nốt sưng
4.2.1 Một số đặc điểm hình thái cơ bản của loài tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita
Giống Meloidogyne có đặc điểm lưỡng hình sinh dục, với giai đoạn ấu trùng có hình dạng giống giun, trong khi con cái trưởng thành có hình dáng quả lê hoặc hình cầu, thường nằm sâu trong mô rễ Đường kính cơ thể của chúng dao động từ 0,5 - 0,7 mm, với cổ cân đối và vulva nằm gần hậu môn ở phía sau Vỏ cutin mỏng, màu trắng nhạt và có phân đốt, trong khi kim hút ngắn và phân hóa trung bình Vùng đầu kitin hóa không mạnh, và lỗ bài tiết nằm ở phía trước đến van diều giữa, thường gần gốc stylet Hai nhánh sinh dục cuộn gấp lại, và trứng được đẻ ra bên ngoài cơ thể vào túi gelatin.
Hình 4.3 Con cái trong mô rễ hồ tiêu (A) và bọc trứng (B)
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Con cái có hình dạng cơ thể từ quả lê đến hình cầu không cân đối, với cổ ngắn và mấu đuôi rất nhỏ, gần như không thấy Stylet có núm gốc tròn và phần chóp cong về phía lưng, trong khi vị trí lỗ bài tiết nằm ngay sau gốc stylet một chút Vùng môi được thể hiện rõ ràng, và diều giữa có kích thước khoảng 30 - 32.
Kích thước của mẫu perineal dao động từ 23 đến 27 μm, với hình dạng chủ yếu là oval, kéo dài về phía lưng bụng Mẫu này có vòm lưng cao và không bị bóp lại từ hai bên, trong khi các đường vân không liên tục Trong trường hợp các đường vân ở phía bụng xuất hiện mạnh mẽ, chúng có thể tạo thành những làn sóng dồn Vùng bên thường không có hoặc chỉ xuất hiện dạng fork tại chỗ nối giữa các vân lưng và bụng.
Hình 4.4 Phần đầu của con cái Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.5 Tiêu bản mẫu cutin vùng chậu con cái của Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Con đực có hình dạng giống giun, sống tự do trong đất với chiều dài từ 1-2 mm Cơ thể thường xoắn 180 độ quanh trục khi được cố định trong dung dịch nóng Đầu của nó có vùng kitin hóa mạnh và stylet phát triển khỏe Đuôi ngắn, hình cầu và gai giao cấu phát triển mạnh, không có cánh đuôi.
Hỡnh 4.6 Phần đầu con đực Meloidogyne incognita với kim hỳt (thước 10 àm)
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.7 Phần đuôi con đực với gai giao cấu
Ấu trùng có hình dạng cân đối giống như giun, dài từ 0,3 đến 0,5 mm Phần đầu có stylet và vùng kitin hóa yếu, trong khi đuôi có hình chóp và phần cuối thường có khoảng trống với chiều dài khác nhau.
Hình 4.8 Hình thái của ấu trùng Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.9 Phần đầu của ấu trùng Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.10 Phần đuôi của ấu trùng Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.11 Con đực (trên) và con cái (dưới)
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.12 Hình thái của trưởng thành đực Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.13 Hình thái của trưởng thành cái Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Chúng tôi đã tiến hành làm mẫu tiêu bản ấu trùng tuổi 2 và trưởng thành của Meloidogyne incognita, theo dõi một số chỉ tiêu hình thái Sau đó, các mẫu này được đưa lên kính hiển vi quang học có hệ thống camera và phần mềm đo ảnh để chụp Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 4.4.
Bảng 4.4 Các chỉ số đo của ấu trùng tuổi 2, con cái và con đực loài
2 Chiều dài kim hút (stylet)
3 chiều rộng gốc kim hút
4 chiều dài từ đỉnh đầu đến giữa thực quản
5 chiều dài từ giữa thực quản đến lỗ bài tiết
6 chiều rộng cơ thể vị trí lỗ bài tiết
Kết quả theo dõi các chỉ tiêu hình thái ở ấu trùng tuổi 2, trưởng thành cái và trưởng thành đực của Meloidogyne incognita cho thấy sự phù hợp với nghiên cứu của Kaur & Attri (2013).
4.2.2 Đặc điểm phân tử của loài tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita Để khẳng định lại nhận dạng và những mô tả về đặc điểm hình thái loài Meloidogyne incognita ở trên,chúng tôi tiến hành làm mẫu DNA của loài tuyến trùng nốt sưng thu thập được tại Đăk Song, Đăk Nông Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR trên agarose gel thể hiện trên Hình 18 Kết quả cho thấy sản phẩm điện di có băng gọn, rõ, không có sản phẩm không đặc hiệu.
Hình 4.14 minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS trên gel agarose, thể hiện hai mẫu tuyến trùng nốt sưng trên cây hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông (Viện Bảo vệ thực vật, 2015).
Chúng tôi đã thành công trong việc tách chiết và nhân gen (PCR) đoạn gen ITS của hai mẫu tuyến trùng M incognita gây hại cho hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông Phân tích trình tự gen ITS cho thấy hai mẫu này gần nhất với chủng M incognita KU356192 từ Tây Nguyên (Linh, L.T.M và Phap, T.Q., 2015) Cây phả hệ maximum likelihood (ML) được xây dựng từ kết quả trình tự vùng ITS của nghiên cứu sử dụng phần mềm MEGA 6 Phân tích cho thấy đoạn gen ITS của hai chủng M incognita trong nghiên cứu của chúng tôi có sự tương đồng cao với các chủng đã được lưu trữ trên GenBank.
M incognita 2 trong nghiên cứu của chúng tôi đồng nhất với nhau và gần tương đồng, cùng nhóm với chủng M.incognita KU356192 trên hồ tiêu thu thập tại Tây Nguyên (Linh,L.T.M and Phap,T.Q., 2015).
Diễn biến phát sinh gây hại của quần thể tuyến trùng gây nốt sưng
4.3.1 Diễn biến mật độ quần thể tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita tại Đăk Song, Đăk Nông
Tuyến trùng Meloidogyne incognita là loài gây hại quan trọng cho hồ tiêu tại Tây Nguyên, đặc biệt ở Đăk Song, Đăk Nông Nghiên cứu cho thấy mật độ quần thể tuyến trùng có mối liên hệ chặt chẽ với các yếu tố môi trường, đặc biệt là lượng mưa Để theo dõi diễn biến mật độ của loài này, vào năm 2015, chúng tôi đã thu thập mẫu đất và mẫu rễ từ các vườn hồ tiêu bị vàng lá tại Đăk Song, Đăk Nông và tiến hành phân tích tại Viện Bảo vệ thực vật Kết quả nghiên cứu được trình bày trong Bảng 4.5 và minh họa bằng đồ thị trong Hình 21.
Nghiên cứu cho thấy tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại cho cây hồ tiêu xuất hiện quanh năm, với mật độ cao ngay từ đầu tháng 1 (173 con/100 gam đất, 54,5 con/5 gam rễ) Mật độ tuyến trùng trong đất giảm dần vào mùa xuân, nhưng lại tăng cao vào đầu mùa mưa, với 42,5 con vào tháng 4 và 23 con vào tháng 5, thời điểm cây hồ tiêu đang ra hoa Sau đỉnh cao vào tháng 4, mật độ tuyến trùng giảm trong tháng 6 và tháng 7, nhưng lại tăng mạnh trở lại vào tháng 9.
164,2 con/100 gam đất Sau đỉnh cao về mật độ trong tháng 9, mật độ tuyến trùng giảm dần trong các tháng mùa khô.
Vườn hồ tiêu tại Đăk Song - Đăk Nông đã tiến hành thu thập mẫu đất và rễ vào năm 2015 Kết quả nghiên cứu cho thấy mật độ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita trong đất và rễ hồ tiêu tại khu vực này.
Mật độ quần thể tuyến trùng trong rễ có xu hướng tăng nhanh hơn so với trong đất, đặc biệt vào đầu năm trong mùa khô tại Đăk Nông Tuyến trùng Meloidogyne incognita bắt đầu xuất hiện với mật độ cao từ tháng 3 (203 con/5 gam rễ), sau đó giảm từ tháng 4 đến tháng 8 Tuy nhiên, mật độ lại tăng trở lại vào tháng 9 (223,3 con/5 gam rễ) khi quả đang ở giai đoạn vào chắc Sau đỉnh cao tháng 9, mật độ tuyến trùng giảm dần nhưng lại đạt đỉnh cao lần nữa vào tháng 11, trùng với thời điểm hồ tiêu chuẩn bị thu hoạch.
Hình 4.17 Diễn biến mật độ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong đất và rễ hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk
Hình 4.18 Diễn biến nhiệt độ và lượng mưa tại Đăk Nông năm 2015
Nghiên cứu khả năng sinh sản của tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại trên hồ tiêu cho thấy, trong năm 2015, chúng tôi đã tách bọc trứng từ mô rễ hồ tiêu bị sưng và đếm số lượng trứng trung bình trong các bọc trứng Kết quả ban đầu cho thấy số trứng trung bình/bọc của loài Meloidogyne incognita trong tháng 7 là 420 trứng/bọc, cao hơn nhiều so với số trứng thu được trong tháng 9 (trung bình 193,5 trứng/bọc) Sự chênh lệch này có thể liên quan đến mật độ tuyến trùng trong đất, thường đạt cao nhất vào tháng 8 - 9 trong năm.
Bảng 4.6 Số trứng trung bình/bọc của loài Meloidogyne incognita trong rễ hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông, năm 2015
Ghi chú: Số liệu số lượng trứng/ổ của tuyến trùng được thể hiện qua giá trị Mean ± STDEV (min – max)
4.3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến mật độ quần thể tuyến trùng gây nốt sưng hại hồ tiêu hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
4.3.2.1 Ảnh hưởng của đất trồng đến mật độ của tuyến trùng Meloidogyne incognita trong đất và rễ hồ tiêu
Yếu tố đất đai có ảnh hưởng lớn đến mật độ tuyến trùng trong vô sinh, đặc biệt là đất trồng hồ tiêu tại Tây Nguyên, chủ yếu là đất bazan màu mỡ và một phần là đất xám Năm 2015, chúng tôi đã theo dõi mật độ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong cả đất đỏ bazan và đất xám trong các giai đoạn sinh trưởng quan trọng của cây hồ tiêu, với kết quả được trình bày trong Bảng 4.7.
Bảng 4.7 Đặc điểm đất và mật độ tuyến trùng gây hại trong đất, rễ hồ tiêu tại Đăk Song - Đăk Nông, 2015
Ghi chú: *Mật độ tuyến trùng bình quân ở các thời kỳ:
Ra hoa rộ, quả phát triển, quả vào chắc và quả chín
Kết quả trình bày trong bảng 4.7.cho thấy tuyến trùng Meloidogyne incognita đều có khả năng phát triển trên cả hai loại đất trên.
Mật độ tuyến trùng trong rễ hồ tiêu trồng trên đất bazan (160,92 con/5 gam rễ) cao hơn so với rễ hồ tiêu trên đất xám (81,5 con/5 gam rễ) với độ tin cậy 95% Trong khi đó, mật độ tuyến trùng trung bình trong đất hồ tiêu trồng trên đất đỏ bazan là 70,96 con/100 gam đất, cũng cao hơn so với đất xám (17,92 con/100 gam đất) Tuy nhiên, phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về mật độ tuyến trùng giữa hai loại đất này.
4.3.2.2 Ảnh hưởng của bón phân hữu cơ đến mật độ quần thể tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita trong đất và rễ hồ tiêu
Tại Tây Nguyên, nông dân trồng hồ tiêu đang áp dụng nhiều loại phân bón, bao gồm cả vô cơ và hữu cơ Việc tăng cường sử dụng phân bón hữu cơ và sản phẩm bổ sung vi sinh vật có ích giúp kích thích sự phát triển của bộ rễ cây, tăng cường lượng vi sinh vật có lợi trong đất và hạn chế sự phát triển của tuyến trùng gây hại.
Kết quả theo dõi mật độ quần thể tuyến trùng nốt sưng ở các vườn có bón phân hữu cơ và ít bón phân hữu cơ được trình bày trong Bảng 4.8, tại các thời điểm cây ra hoa rộ, quả phát triển, quả vào chắc và khi quả chín.
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của phân hữu cơ tới mật độ tuyến trùng gây hại trong đất và rễ hồ tiêu tại Đăk Song – Đăk
Ghi chú: *Mật độ tuyến trùng bình quân ở các thời kỳ:
Mật độ quần thể tuyến trùng trung bình trong đất và rễ hồ tiêu tại vườn bón ít phân hữu cơ cao hơn so với vườn bón nhiều phân hữu cơ, với 145 con/5 gam rễ so với 99,95 con/5 gam rễ Tuy nhiên, không có sự khác biệt thống kê đáng kể giữa hai phương pháp bón phân Nguyên nhân có thể là do cây chưa nhận đủ lượng phân hữu cơ cần thiết và chất lượng phân bón không đồng đều Do đó, cần nâng cao chất lượng phân bón hữu cơ và bổ sung vi sinh vật có ích để cải thiện sức đề kháng cho cây và giảm mật độ quần thể tuyến trùng.
4.3.2.3 Ảnh hưởng của các giống hồ tiêu đến mật độ quần thể tuyến trùng trên vườn hồ tiêu
Tại Tây Nguyên, đặc biệt là Đăk Nông, hiện nay có nhiều giống hồ tiêu được trồng, bao gồm tiêu Vĩnh Linh, tiêu Trâu, tiêu Phú Quốc và một số ít giống Lộc Ninh, trong đó tiêu Vĩnh Linh và tiêu Trâu là chủ yếu.
Năm 2015, chúng tôi điều tra mật độ tuyến trùng trên hai giống tiêu Vĩnh Linh và tiêu Trâu tại Đăk Song, Đăk Nông Kết quả điều tra
Kết quả trong bảng 4.9 cho thấy tuyến trùng gây nốt sưng xuất hiện gây hại cho cả giống tiêu Vĩnh Linh và Tiêu Trâu ở tất cả các thời kỳ xung yếu của cây Mật độ tuyến trùng trong rễ giống tiêu Vĩnh Linh là 162 con, cao hơn 91,17 con so với giống tiêu Trâu với độ tin cậy 95%, cho thấy giống tiêu Vĩnh Linh bị hại nặng hơn Tuy nhiên, mật độ tuyến trùng trong đất trồng hai giống này không có sự khác biệt rõ rệt như trong rễ.
Bảng 4.9 Mật độ tuyến trùng gây hại trên các vườn hồ tiêu kinh doanh trồng các giống phổ biến tại Đăk Song – Đăk Nông, 2015
Ghi chú: *Mật độ tuyến trùng bình quân ở các thời kỳ:
Ra hoa rộ, quả phát triển, quả vào chắc và quả chín
4.3.2.4 Ảnh hưởng của cây ký chủ đến khả năng tồn tại của tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita Để tìm hiểu về khả năng tồn tại của tuyến trùng trong điều kiện không có thức ăn, năm 2015 chúng tôi tiến hành lấy đất ở các vườn hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng nặng và để hoang (không trồng bất cứ loại cây nào) và thường xuyên dọn sạch cỏ dại Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 4.10.
Bảng 4.10 Khả năng suy thoái mật độ quần thể tuyến trùng trong đất trồng hồ tiêu trong điều kiện không có nguồn thức ăn, Viện Bảo vệ thực vật, 2015
Trồng hồ tiêu Vĩnh Linh
Sau thí nghiệm 9 tháng (con/100g đất) 4,25 ± 2,2
Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 6 tháng, mật độ tuyến trùng gây nốt sưng giảm 88,58%, và sau 9 tháng, giảm 92,12% Tuy nhiên, trứng tuyến trùng được bảo vệ bởi lớp gelatin, cho phép chúng tồn tại lâu trong đất và nở nhanh khi gặp điều kiện thuận lợi, tiếp tục gây hại cho cây Do đó, để phòng trừ hiệu quả, cần áp dụng biện pháp cắt nguồn thức ăn kết hợp với các biện pháp phòng trừ tổng hợp nhằm hạn chế sự phát triển của tuyến trùng gây hại.
4.3.2.5 Ảnh hưởng của cây trồng xen đến khả năng tích lũy quần thể của tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita Để đánh giá khả năng tích lũy quần thể của tuyến trùng nốt sưng khi trồng xen cây ký chủ và một số loại cây trồng có khả năng ức chế hoặc dẫn dụ, năm 2015 chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trồng xen cây cúc vạn thọ và cây thì là trong các chậu đất trồng hồ tiêu có nhiễm tuyến trùng Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 4.11.
Bảng 4.11 Khả năng ức chế, dẫn dụ của cúc vạn thọ và cây thì là đối với tuyến trùng hại hồ tiêu tại Đăk Nông, 2015
Trồng hồ tiêu xen cúc
3 Trồng hồ tiêu xen thì là LSD 05
Mật độ Meloidogyne sp.(con/100 g đất)
Phòng trừ tuyến trùng nốt sưng bằng một só chế phẩm bảo vệ thực vật 52 1 Hiệu lực của các loại thuốc trừ tuyến trùng trong điều kiện phòng thí nghiệm
4.4.1 Hiệu lực của các loại thuốc trừ tuyến trùng trong điều kiện phòng thí nghiệm
Tuyến trùng là một loại dịch hại khó kiểm soát trong đất, và mặc dù một số thuốc hóa học như Furadan, Mocap, và Nemacur có hiệu quả cao, chúng thường chỉ được sử dụng hạn chế trong vườn ươm Việc sử dụng thuốc hóa học ngoài sản xuất gặp nhiều hạn chế do chi phí cao và khả năng gây ô nhiễm môi trường Do đó, việc áp dụng các chế phẩm sinh học để phòng trừ tuyến trùng được khuyến khích, không chỉ bảo vệ môi trường mà còn giúp cây trồng phát triển cân đối và mang lại hiệu quả kinh tế.
Vào năm 2016, nghiên cứu đã thử nghiệm 6 loại thuốc, bao gồm 5 loại có nguồn gốc sinh học và 1 loại hóa học Kết quả của các thí nghiệm này được trình bày chi tiết trong Bảng 4.12.
Kết quả thử nghiệm hiệu lực của 6 sản phẩm phòng trừ tuyến trùng trong phòng thí nghiệm cho thấy chế phẩm Sông Lam 333 50 ND, AH No6, SH – BV1 và Marshal 5G đạt hiệu lực 100% chỉ sau 1 ngày xử lý Tiếp theo, Tervigo cho hiệu lực 82,19% và chế phẩm AT đạt 80,82% sau 7 ngày xử lý.
Bảng 4.12 Hiệu lực của một số sản phẩm trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong phòng thí nghiệm, Viện Bảo vệ thực vật, 2016
4.4.2 Hiệu lực trừ tuyến trùng nốt sưng của một số chế phẩm bảo vệ thực vật trong điều kiện nhà lưới
Năm 2016, dựa trên kết quả đánh giá hiệu lực trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đã giới thiệu 4 loại chế phẩm bảo vệ thực vật để tiến hành đánh giá trong nhà lưới, bao gồm Sông Lam 333 50 ND, AH No6, SH – BV1 và Marshal 5 G Kết quả thử nghiệm được trình bày chi tiết trong bảng 4.13 và 4.14.
Bảng 4.13 Kết quả đánh giá hiệu lực của một số sản phẩm phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong đất ở điều kiện nhà lưới, Viện Bảo vệ thực vật, 2016
SH -BV1 Sông Lam 333 50ND
AH No6Marshal 5 G Đối chứng (nước
Kết quả đánh giá hiệu lực phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng trong điều kiện nhà lưới cho thấy thuốc hóa học Marshal 5 G đạt hiệu lực cao nhất với tỷ lệ trừ tuyến trùng trong đất là 75,01% Bên cạnh đó, chế phẩm SH – BV1 cũng cho hiệu quả tương đối tốt trong việc kiểm soát tuyến trùng.
Sau một tháng xử lý, thuốc Marshal cho hiệu lực trừ tuyến trùng trong rễ cao nhất, đạt 47,53% Chế phẩm SH – BV1 có hiệu lực 41,90%, trong khi hai chế phẩm Sông Lam 333 50 ND và AH No6 chỉ đạt hiệu lực trung bình thấp với 50,77% và 42,20% Cụ thể, hiệu lực trừ tuyến trùng trong rễ của Sông Lam 333 50 ND và AH No6 rất thấp, chỉ đạt 32,23% và 22,43%.
Bảng 4.14 Kết quả đánh giá hiệu lực của một số sản phẩm phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong rễ ở điều kiện nhà lưới, Viện Bảo vệ thực vật, 2016
SH -BV1 Sông Lam 333 50ND
Marshal 5 G Đối chứng (nước lã)
Trong điều kiện vườn ươm, thuốc hóa học Marshal 5G có thể được sử dụng để phòng trừ tuyến trùng Đối với sản xuất, các chế phẩm như SH – BV1, Sông Lam 333 50 ND và AH No6 là lựa chọn hiệu quả cho việc phòng trừ tổng hợp tuyến trùng trong đất.