Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Đề tài gồm 3 nội dung nghiên cứu:
- Tình hình chăn nuôi và dịch PRRS ở lợn tại huyện Thanh Hà tỉnh Hải
- Một số đặc điểm dịch tễ của PRRS ở lợn tại huyện Thanh Hà tỉnh Hải
- Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chung virus KTY-PRRS-07
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Tình hình chăn nuôi và dịch PRRS ở lợn tại Thanh Hà năm 2014
Số liệu điều tra về chăn nuôi lợn và dịch PRRS được thu thập từ các tài liệu lưu trữ của Cục thống kê, Chi cục thú y và Trạm thú y, nhằm phân tích tình hình hiện tại của ngành chăn nuôi.
Số lợn mắc PRRS (con)
Số lợn bị tiêu hủy (con)
Để thu thập thông tin về các hộ chăn nuôi, chúng tôi tiến hành sử dụng bảng hỏi (phiếu điều tra) kết hợp với phỏng vấn sâu các cán bộ thú y cơ sở.
3.2.2 Nghiên cứu đặc sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-07
Chủng virus KTY-PRRS-07 phân lập được tại Thái Bình năm 2014 Dụng cụ : Máy PCR , máy ly tâm, bộ điện di, buồng đếm Neubauer, tủ ấm, lò vi sóng
Hóa chất: DMEM, FBS, PBS, Trypsin − EDTA, DMSO, Agarose 1.2%
Phương pháp nuôi cấy tế bào Để chuẩn bị cho các bước nghiên cứu tiếp theo, cần phải chuẩn bị lượng tế bào Marc-145 buồng đếm Neubauer cần thiết.
- “Gọi” tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: môi trường DMEM bổ sung 5% FBS làm ấm trong tủ 37 0 C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FBS, chuyển tế bào và bình nuôi cấy chứa 5 ml môi trường DMEM + 5% FBS.
Giữ tế bào trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 độ C với 5% CO2 và theo dõi sự phát triển hàng ngày Khi tế bào phát triển dày và che kín bề mặt đáy bình, có thể thu hoạch tế bào để bảo quản hoặc chuyển sang bình nuôi cấy mới.
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin − EDTA Thêm 7 ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào bằng cách hòa tan tế bào trong 6 ml môi trường đầy đủ Sau đó, pha loãng tế bào với tỷ lệ 1:100 (10 µl tế bào trong 990 µl môi trường không đầy đủ) và sử dụng buồng đếm để đếm số tế bào trên kính hiển vi, từ đó tính số lượng tế bào trong 1 ml.
Bước 5: Tiến hành cấy chuyển tế bào bằng cách pha loãng tế bào đến nồng độ 2x10^5 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ Sau đó, chia huyễn dịch tế bào vào các bình nuôi, cụ thể là 6 ml cho bình T25 và 15 ml cho bình T75.
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37 0 C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
Sau khi thu thập đủ số lượng tế bào cần thiết, chúng sẽ được bảo quản để sử dụng trong các lần sau Mỗi loại tế bào thường có giới hạn về số lần nuôi cấy, tức là số lần phân chia tế bào, ngoại trừ tế bào ung thư, vốn có khả năng phân chia không giới hạn.
Việc ghi chép hồ sơ theo dõi tế bào trong quá trình cấy chuyển và thu hoạch là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng tế bào cho nghiên cứu, đặc biệt khi có 25 phân chia vô hạn.
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào, chỉ khác ở bước
Bước 5: Pha loãng tế bào ở nồng độ 5x10^6 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ với 10% DMSO, sau đó chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản, mỗi ống 1 ml.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20 0 C trong 2 − 3 giờ, chuyển sang -80 0 C qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
- Phương pháp đếm tế bào
Việc đếm tế bào là bước quan trọng trước khi nuôi cấy tế bào, giúp xác định đường cong sinh trưởng của virus Mật độ tế bào trước khi nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình, đặc biệt là trong nuôi cấy tế bào một lớp Để xây dựng đường cong sinh trưởng của virus, việc đếm tế bào cần thiết nhằm đảm bảo tỷ lệ nhiễm virus phù hợp Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện việc gây nhiễm virus với MOI = 0,01, tương đương với tỷ lệ 1 virus trên 100 tế bào.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng buồng đếm Neubauer để đếm tế bào.
Vị trí đếm tế bào được áp dụng tương tự như đối với đếm hồng cầu Để xác định số lượng tế bào, cần đếm trong 5 ô đếm hồng cầu và thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thị Lan và cộng sự, năm 2005.
Phương pháp xác định hiệu giá virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng với mật độ 2.0×10^4 tế bào/giếng Sau khi hút bỏ dịch nổi, virus được pha loãng theo tỷ lệ 1:10 và được ủ trên bề mặt tế bào trong các giếng đã được đánh dấu trước đó với thể tích 25 µl/giếng, mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần Sau 1 giờ ủ, dung dịch DMEM có chứa 10% TBP được bổ sung vào mỗi giếng với thể tích 100 µl.
CPE được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm.
TCID50 được xác định theo phương pháp của Reed-Muench.
Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5x10 4 tế bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên.
Virus PRRS phân lập được và chủng virus vacxin được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0.01 Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus
Sau khi hút bỏ 26, môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch một lần với 0.5ml PBS Tiếp theo, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào mỗi giếng với lượng 100µl.
Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong tế bào được thu thập riêng biệt từ dịch nổi và phần tế bào còn lại Việc thu mẫu được thực hiện ở các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 và 108 giờ sau khi gây nhiễm virus.
Để định lượng virus, cần xác định hiệu giá của các ống virus đã thu thập Đường biểu diễn sự nhân lên của virus được xây dựng dựa trên biến lg của TCID50 tại từng thời điểm thu mẫu virus.
Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR
- Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
+ Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch
TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40 o C bổ sung thêm 10 ul Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần điện di.
+ Chuẩn bị mẫu: Thêm 2l loading dye vào 8l sản phẩm RT-PCR
+ Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
+ Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6l maker 100bp và 10l sản phẩm PCR mỗi giếng.
+ Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
+ Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
Phương pháp giải trình tự gen
Kỹ thuật giải trình tự DNA là quá trình xác định thành phần nucleotide của một đoạn DNA Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gen tự động Beckman Coulter CEQ 8000 tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y Máy hoạt động dựa trên phương pháp Sanger, trong đó sợi DNA được tổng hợp sử dụng các nucleotide gắn thuốc nhuộm huỳnh quang Mỗi nucleotide sẽ phát ra màu sắc khác nhau khi được chiếu laser: Adenin màu đỏ, Thymine màu xanh, Guanine màu xanh lá cây và Cytosine màu đen.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:
Phản ứng PCR sequencing: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo bảng sau:
DTCS Quick Start Master Mix
Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter-Mỹ)
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự.
Phương pháp xử lý số liệu