Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là một số vi khuẩn gây ô nhiễm trong thịt đông lạnh nhập khẩu (quy định trong QCVN 8-3/ BYT) và các tiêu chuẩn sử dụng để xét nghiệm
- Salmonella spp – TCCS 03/TYV2/2016-CĐ
Phòng Vi sinh thực phẩm - Tổ Vệ sinh thú y - Trạm Chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật, Cơ quan Thú y vùng II
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8/2016 đến tháng 6/2017.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp
- Thẩm định phương pháp đinh lượng tổng số VSVHK trong thịt theo TCVN 9977-2013
- Thẩm định phương pháp đinh lượng vi khuẩn E.coli trong thịt theo TCVN 9975-2013
- Thẩm định (xác nhận giá trị sử dụng) phương pháp phát hiện Salmonella spp trong thịt theo TCCS 03/2016/TYV2-CĐ
3.2.2 Ứng dụng Kiểm nghiệm một số mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu
- Kiểm nghiệm các lô thịt bò đông lạnh
- Kiểm nghiệm các lô thịt đùi gà đông lạnh
- Kiểm nghiệm các lô thịt gà nguyên con đông lạnh
Nguyên liệu
3.3.1 Chủng chuẩn vi sinh vật
- Salmonella enterica subsp enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™*,
- Staphylococus aureus subsp aureus ATCC ® 29213 TM
3.3.2 Các mâũ thịt đông lạnh:
Các mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu đủ điều kiện xét nghiệm phải được đóng gói và niêm phong cẩn thận, đồng thời được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 độ C khi tiếp nhận tại phòng xét nghiệm vi sinh Những mẫu này bao gồm thịt gà xay, thịt bò, gà nguyên con và đùi gà.
3.3.3 Các thiết bị trong phòng thí nghiệm
- Tủ âm sâu(-20 0 C), tủ ấm các loại, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp cách thủy, cân, buồng cấy an toàn sinh học, máy dập mẫu stomatcher
Ống lưu giữ chủng chuẩn thương mại Microbank, đèn cồn, que cấy nhựa vô trùng dùng một lần, hộp lồng thủy tinh, khay men, cốc đong, ống nghiệm, dao mổ và kéo cong là những dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm, phục vụ cho các nghiên cứu và thí nghiệm khoa học.
- Hệ thống định danh Vitek 2 compact
3.3.4 Môi trường chính nuôi cấy vi sinh vật
Bảng 3.1 Môi trường chính dùng để thẩm định phương pháp và phân tích các chỉ tiêu VSV
TT Chỉ tiêu phân Môi trường chính tích/Phương pháp
4 TCVN 4884:2015 Đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí 3M Petrifilm TM Aerobic count plate Đĩa đếm 3M Petrifilm TM E coli/coliform count plate
Buffer peptone water (BPW), Iris Salmonella supplement(BS 07708), Iris Salmonella agar, confirm’ Salmonella (BT01108)
MKTTn - Tetrathionat/novobioxin Muller kauffman, RVS - Rappaport Vassiliadis, thạch XLD -
Deoxycholat lyzin xyloza, HE - Hektoen enteric agar,
Đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí Petrifilm TM chứa thạch và chất tạo đông tan trong nước lạnh, với màng phủ chứa chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua, giúp quan sát sự phát triển của khuẩn lạc dễ dàng Mỗi đĩa có vùng sinh trưởng được khoanh tròn, chứa khoảng hai mươi ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm² Đĩa đếm E coli/coliform Petrifilm TM được thiết kế với các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím, chất tạo đông tan trong nước lạnh, và chất chỉ thị hoạt độ glucuronidase, cho phép đếm coliform và E coli trên cùng một đĩa, cũng với vùng sinh trưởng tương tự.
Agar Salmonella IRIS là một môi trường chọn lọc có tính đặc hiệu cao trong việc phát hiện hầu hết các loài Salmonella, bao gồm cả các biến chủng huyết thanh không điển hình Môi trường này cho phép phát hiện Salmonella typhi và paratyphi, cũng như các loài Salmonella dương tính với đường lactose như Salmonella Senftenberg và các phân loài S arizonae và S diarizonae Ngoài ra, agar cũng đảm bảo phát hiện các serovar bất động như S Pullorum và S Gallinarum, cũng như các chủng đơn IRIS ® Salmonella Agar còn có khả năng phát hiện các dòng có ít hoặc không có hoạt tính esterase trên các môi trường khác, bao gồm Salmonella bongori, Salmonella Dublin và một số phân loài S houtenae và S diarizonae.
MKTTn và RVS là hai môi trường tăng sinh thứ cấp, trong đó có một số thành phần có khả năng ức chế một số loài vi khuẩn không phải Salmonella.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp thẩm định tiêu chuẩn
Thẩm định, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp thử nghiệm được thực hiện theo:
- Trần Cao Sơn 2010, TCVN 9332:2012 Các thông số cần xác định:
+ Độ lặp lại, độ tái lặp, độ không đảm bảo đo ( phương pháp định lượng)
+ Giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng (phương pháp định tính)
Các bước thẩm định phương pháp:
Đánh giá môi trường nuôi cấy trong các phương pháp xét nghiệm được thực hiện theo tiêu chuẩn TCVN 8128:2015, nhằm xác định hiệu suất của môi trường Hiệu suất này được ký hiệu là P R %.
P R: Hiệu suất môi trường đánh giá
N S: Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường kiểm tra
N 0 : Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường tham chiếu và phải > 100
Để thực hiện, lấy một hạt giá thể chứa chủng chuẩn Salmonella enteritidis ATCC®49223™ và Escherichia coli ATCC® 11303™ đã được hoạt hóa, bảo quản trong ống Microbank ở -20°C Sau đó, tiến hành tăng sinh trong môi trường Brain Heart Infusion ở 37°C trong 24 giờ Cuối cùng, ria cấy chủng từ các ống tăng sinh lên môi trường TSA và ủ tiếp ở 37°C trong 18 giờ.
24 giờ Thực hiện các bước pha loãng, cấy lên các môi trường:
- Môi trường dùng để kiểm tổng số VSVHK 3M TM Petrifilm TM Aerobic count plate với môi trường dinh dưỡng Plate count agar (PCA)
- Môi trường dùng để kiểm Coliform và E.coli 3M TM Petrifilm TM
E.coli/Coliform count plate với môi trường Plate count agar (PCA)
- Môi trường Iris Salmonella agar với môi trường Tryptic Soy agar (TSA)
Đối với các mẫu nhiễm tự nhiên (mẫu dương tính), việc kiểm tra tính ổn định của mẫu là rất quan trọng Các vi sinh vật mục tiêu có trong nền mẫu cần phải duy trì sự ổn định qua các lần kiểm tra khác nhau.
Để đảm bảo độ chính xác trong các phương pháp phân tích định tính, các mẫu nền cần phải không nhiễm vi sinh vật mục tiêu Cụ thể, cần lấy riêng 1 kg thịt bò và 1 kg thịt gà xay cắt nhỏ, đồng nhất từng mẫu nền Từ mỗi nền mẫu, rút ra 5 mẫu, mỗi mẫu có trọng lượng 25g.
Kiểm tra tổng VSVHK theo TCVN 4884-1: 2015
Kiểm tra E.coli trong các nền mẫu theo TCVN 7924-2: 2008 Kiểm tra Salmonella trong các nền mẫu theo TCVN 4829: 2005 B3: Kiểm tra chủng chuẩn phục vụ cho việc gây nhiễm
Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn gây nhiễm là cần thiết để đảm bảo rằng các chủng chuẩn không bị biến đổi trong quá trình lưu giữ và bảo quản Đề tài này sử dụng hệ thống định danh vi khuẩn Vitek 2 để thực hiện việc kiểm tra chủng, với các bước chi tiết được mô tả trong phụ lục 1.
Trước khi tiến hành gây nhiễm chủng vào mẫu, các chủng bao gồm
(Salmonella enterica subsp enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™*, Escherichia coli ATCC® 11303™, Vibrio parahaemolyticus ATCC ® 17802 TM , Staphylococus aureus subsp aureus ATCC ®
29213 TM ) được định danh lại bằng hệ thống định danh Vitek2
Hai chủng vi khuẩn Salmonella enterica subsp enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™ và Escherichia coli ATCC® 11303™ đã được định danh và so sánh với giấy chứng nhận sinh học từ nhà cung cấp để kiểm tra sự tương đồng trong các phản ứng sinh hóa.
Chủng vi sinh vật gây nhiễm cần thể hiện các đặc tính nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc chuyên biệt, như khả năng sinh hơi, lên men trong môi trường lỏng, hoặc khả năng tạo màu trên các môi trường này.
B4: Xác định mật độ vi khuẩn để phục vụ cho việc gây nhiễm vào mẫu thẩm định
Sử dụng phương pháp xác định nồng độ vi sinh vật mục tiêu trong các ống pha loãng từ 10 0 , 10 -1 ….10 -n bằng cách thăm dò từng ống trong dãy pha loãng:
Để thực hiện quy trình, đầu tiên lấy một khuẩn lạc của chủng E.coli hoặc Salmonella đã được kiểm tra về đặc tính sinh hóa và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Sau đó, hòa loãng khuẩn lạc trong 9ml buffer peptone water với nồng độ 10^0 Tiếp theo, chuyển 1ml dung dịch sang ống chứa 9ml buffer peptone water để tạo ra nồng độ 10^-1 Quy trình này được thực hiện liên tiếp cho đến khi đạt nồng độ 10^-7 và 10^-8.
Xác định nồng độ vi khuẩn trong canh trùng được thực hiện bằng phương pháp cấy trang trên đĩa thạch theo TCVN 4884-2:2015 Sử dụng Micropipep để lấy 0,1ml mẫu cấy lên mặt thạch, có thể là môi trường dinh dưỡng TSA hoặc môi trường chọn lọc cho vi sinh vật mục tiêu, hoặc 1ml cho phương pháp đổ đĩa Mỗi độ pha loãng cần được lặp lại trên 2 đĩa Sau đó, nuôi cấy trong tủ ấm theo điều kiện nhiệt độ và thời gian quy định Kết quả được tính toán dựa trên 2 nồng độ liên tiếp và theo tiêu chuẩn TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).
B5 Gây nhiễm vi sinh vật vào các mẫu
Với phương pháp định lượng:
Sử dụng vi sinh vật hoặc các mẫu nhiễm tự nhiên để gây nhiễm là phương pháp hiệu quả nhất, đặc biệt khi chúng nằm trong khoảng phát hiện của phòng thí nghiệm trên các nền mẫu xét nghiệm.
Mỗi ngày, thực hiện việc gây nhiễm cho tối thiểu 10 mẫu nghiên cứu, bao gồm 10 mẫu thịt gà xay và 10 mẫu thịt bò Mỗi mẫu có trọng lượng 50g và được nhiễm cùng một lượng vi khuẩn E.coli trong khoảng nồng độ từ 10^2 đến 10^4 CFU/g.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện phân tích chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí (VSVHK) theo tiêu chuẩn TCVN 9977:2013 và TCVN 4884:2015 trên 10 mẫu thịt xay nhiễm tự nhiên và 10 mẫu thịt bò gây nhiễm chủng E.coli Đối với các mẫu thịt bò, do số lượng vi sinh vật ban đầu thấp, cần phải gây nhiễm thêm một lượng vi khuẩn nhất định Chúng tôi đã sử dụng chủng E.coli để gây nhiễm với mức khoảng 7*10² CFU/g trên 50 g mẫu, tương đương với 2 ml dịch canh khuẩn từ ống pha loãng 10^-4 Quá trình này được thực hiện lặp lại 10 lần cho 10 mẫu trong vòng 2 ngày.
Thực hiện thẩm định phương pháp định lượng E.coli theo TCVN 9975:2013 trên mẫu thịt bò và thịt gà, cân 50 g mẫu với số lần lặp n Sử dụng chủng chuẩn E.coli, gây nhiễm vào 2 nền mẫu với nồng độ ban đầu 1,6*10^3 CFU/g, tương đương bổ sung 0,5ml dịch canh khuẩn ở nồng độ 10^-3 Xét nghiệm song song 2 phương pháp TCVN 9975:2013 và TCVN 7924-2:2008 trong 2 ngày.
Bố trí thí nghiệm được thực hiện trên mỗi nền mẫu với việc gây nhiễm từ 3 đến 5 mức khác nhau Số lượng vi khuẩn ở mức thấp nhất gần bằng 0, sau đó tăng dần ở các mức tiếp theo thông qua phương pháp pha loãng nhị phân Nồng độ vi khuẩn Salmonella enterica được xác định tại các mức này.
Mức 1: 1-3cfu/25g/ mẫu: lặp lại 10 lần
Mức 2: 3-6cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
Mức 3: 6-10cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
Mức 4: 10-20cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
Mức 5: > 20cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
… đến mức n sao cho kết quả đạt được ở mức gây nhiễm nồng độ vi khuẩn thấp nhất đạt được 100% cho kết quả dương tính
Mẫu âm tính, sử dụng 3 nền mẫu âm tính, mỗi nền mẫu lặp lại
The study involved ten trials using white noise samples and negative controls with specific microorganisms: Vibrio parahaemolyticus ATCC ® 17802 TM, E coli ATCC ® 11303 TM, and Staphylococcus aureus subsp aureus ATCC ® 29213 TM to induce infection.