NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Lá sương sâm được thu mua trên địa bàn huyện Đại Lộc – tỉnh Quảng Nam Sau khi thu mua về thì lá sương sâm được xử lí như sau:
Lá sương sâm sau khi thu mua sẽ được loại bỏ rác và các lá vàng úa để đảm bảo chất lượng nguyên liệu cho nghiên cứu Tiếp theo, lá sẽ được phơi héo dưới nắng nhằm rút ngắn thời gian sấy, sau đó được sấy ở nhiệt độ 60°C cho đến khi lá khô giòn, giúp giảm độ ẩm và kéo dài thời gian bảo quản Cuối cùng, mẫu sau khi sấy sẽ được nghiền mịn và bảo quản ở điều kiện bình thường để phục vụ cho quá trình nghiên cứu.
Dụng cụ - hóa chất – thiết bị
Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ phòng thí nghiệm và được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Hóa chất Vật tư Khoa học Kỹ thuật Thành Trung, tọa lạc tại khu công nghiệp Hòa Khánh, Liên Chiểu, Đà Nẵng.
+ Acid citric xuất xứ Trung Quốc (hãng Xilong) + Cồn 96 o - cồn công nghiệp
+ KOH có xuất xứ Trung Quốc
Lá sương sâm mua về
Làm sạch sơ bộ Sấy khô Nghiền mịn
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xử lí nguyên liệu lá sương sâm
Hình 2.2 Lá sương sâm sau phơi héo Hình 2.3 Bột lá sương sâm
SVTH: Trần Thị Thảo Trâm GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh 20 NCS.ThS Ngô Thị Minh Phương
- Dụng cụ, thiết bị hỗ trợ trong quá trình nghiên cứu gồm:
+ Thiết bị: Máy siêu âm, máy lọc chân không, máy cô đặc chân không, tủ sấy, máy đo pH, nhớt kế quay
Dụng cụ nghiên cứu bao gồm cân điện tử, bếp điện, nhiệt kế, Bx kế, bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 250ml và 500ml, đũa thủy tinh, đĩa petri, phễu lọc và giấy lọc Hình ảnh minh họa cho một số thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Xác định hàm lượng pectin trong nguyên liệu bằng phương pháp canxi pectat a Nguyên tắc
Phương pháp sản xuất canxi pectat bắt đầu bằng việc xà phòng hóa pectin trong dung dịch xút, sau đó acid hóa và bổ sung ion Ca2+ Kết quả là thu được kết tủa canxi pectat, được rửa sạch, sấy khô và cân trọng lượng để xác định.
Dung dịch canxi clorua (CaCl2) 2N: Hòa tan 230 – 250 g CaCl2 trong bình định mức 1000 ml, sau đó thêm nước cất tới vạch
Dung dịch NaOH 0,1N: Hòa tan 4 g NaOH trong bình định mức 1000 ml, sau đó thêm nước cất tới vạch định mức
Dung dịch acid acetic 1N: pha loãng 60,03 ml acid acetic bằng nước cất trong bình định mức 1000 ml c Cách tiến hành
Hình 2.4 Bơm lọc chân không Hình 2.5 Nhớt kế quay BROOKFIELD
SVTH: Trần Thị Thảo Trâm GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh 21 NCS.ThS Ngô Thị Minh Phương
Cho 0,15 g pectin vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước cất và định mức đến vạch 100 ml Để yên một thời gian cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất.
Hút 20 ml dung dịch pectin vừa định mức được cho vào bình tam giác 250ml, thêm vào bình tam giác 100 ml dung dịch NaOH 0,1N và để yên hỗn hợp trong vòng 7 giờ hoặc để qua đêm cho pectin bị xà phòng hóa hoàn toàn thành acid pectic
Thêm 50 ml dung dịch acid acetic 1N và sau 5 phút cho thêm 50 ml dung dịch CaCl2 2N vào rồi để yên tiếp 1h Đun sôi 5 phút hỗn hợp dung dịch sau đó lọc qua giấy lọc (giấy lọc đảm bảo không tan và đã được sấy khô đến khối lượng không đổi)
Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi hết ion Cl - (thử lại nước rửa với dung dịch bạc nitrat 1%)
Sau khi rửa xong, tiến hành sấy giấy lọc và kết tủa ở 105 o C cho tới khối lượng không đổi, cân thu được kết quả [21] d Tính toán kết quả
Lượng pectin lấy để xà phòng hóa (B) được tính theo công thức sau [21]:
Trong đó: W – khối lượng pectin lấy để pha thành dung dịch (g)
V1 – Thể tích dung dịch pectin ban đầu (ml)
V2 – Thể tích dung dịch pectin lấy để xà phòng hóa Hàm lượng pectin (P) được tính theo công thức sau [21]:
Trong công thức tính toán, m2 đại diện cho khối lượng giấy lọc có kết tủa (g) và m1 là khối lượng giấy lọc ban đầu (g) Hệ số chuyển đổi được sử dụng là 0,92, phản ánh rằng pectin chiếm 92% trọng lượng của canxi pectat, đã trừ hàm lượng canxi có trong kết tủa.
100 – Hệ số chuyển đổi phần trăm
2.3.2 Phương pháp sản xuất pectin trong phòng thí nghiệm Đề xuất quy trình sản xuất pectin trong phòng thí nghiệm từ lá sương sâm như sơ đồ hình 2.6 [13]
Bột lá khô sẽ được ngâm trong acid citric với tỉ lệ 1:20 (g/ml) trong 10 phút, sử dụng nồng độ acid citric từ 3% đến 7% Sau đó, bột sẽ được xử lý bằng siêu âm trong các điều kiện nghiên cứu cụ thể.
Quá trình chiết xuất pectin từ lá sương sâm bắt đầu bằng việc siêu âm trong khoảng thời gian 5 – 15 phút với chu kỳ siêu âm đạt 70 – 90% Sau đó, hỗn hợp bột lá và acid citric được ngâm chiết bằng nhiệt ở nhiệt độ từ 70 – 90 độ C trong khoảng thời gian 20 – 60 phút, đây là giai đoạn quan trọng nhất trong quy trình Cuối cùng, hỗn hợp sẽ được lọc qua vải màn nhiều lần để loại bỏ tạp chất.
Hình 2.6 Sơ đồ quy trình sản xuất pectin trong phòng thí nghiệm
Tối ưu hóa 3 yếu tố (nồng độ acid citric, thời gian và chu kì siêu âm) bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Tối ưu hóa 2 yếu tố ( nhiệt độ và thời gian ngâm chiết) bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Tỉ lệ bột lá :acid citric = 1:20
Siêu âm Ngâm chiết bằng nhiệt
Cô đặc (60 o C, Bx = 10) Kết tủa (dịch : cồn = 1:2) Lọc chân không
Rửa kết tủa Sấy khô (60 o C) Nghiền mịn Pectin thô
Sau khi thu được dịch lọc trong từ quá trình lọc bã, dịch này sẽ được trung hòa bằng dung dịch KOH 0,2N để đạt pH khoảng 4,5 – 5 Để loại bỏ bớt nước và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình kết tủa, dịch lọc sau khi trung hòa sẽ được cô đặc ở máy cô đặc chân không tại 60°C cho đến khi đạt Bx = 10 Tiếp theo, pectin sẽ được kết tủa bằng cồn 96° với tỉ lệ 1:2, để yên khoảng 10 phút trước khi lọc thu nhận kết tủa bằng máy lọc chân không Kết tủa sau khi lọc sẽ được rửa nhiều lần với nước cất để loại bỏ dung môi còn sót lại Cuối cùng, pectin sẽ được sấy ở 60°C cho đến khi khối lượng không đổi và nghiền mịn thành bột để tạo thành pectin thô.
2.3.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận pectin và độ nhớt dung dịch thu được bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Để tìm ra điều kiện sản xuất pectin nhanh chóng và hiệu quả mà vẫn đảm bảo các tính chất mong muốn, tôi đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng của quá trình siêu âm hỗ trợ và quá trình ngâm chiết bằng nhiệt Nghiên cứu này tập trung vào hiệu suất thu nhận pectin và độ nhớt của dung dịch pectin Đặc biệt, tôi đã tối ưu hóa các yếu tố của quá trình siêu âm hỗ trợ trong điều kiện ngâm chiết không đổi bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm với 3 yếu tố, 2 mức và 2 hàm mục tiêu.
Dựa trên các nghiên cứu trước về chiết xuất pectin từ lá sương sâm, ba yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình siêu âm đã được xác định, bao gồm nồng độ acid citric (x1 – C%), thời gian siêu âm (x2 – phút) và chu kỳ siêu âm (x3 – %).
Hai hàm mục tiêu là hiệu suất thu nhận pectin (%) và độ nhớt dung dịch pectin thu được (cP)
Tối ưu hóa quá trình ngâm chiết bằng nhiệt dưới sự hỗ trợ của siêu âm được thực hiện thông qua phương pháp chập phi tuyến tính, sử dụng phần mềm Design Expert 9 Nghiên cứu áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 2 yếu tố, 2 mức để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này.
Sau khi đã tối ưu hóa được các điều kiện của quá trình siêu âm hỗ trợ, tiến hành tối ưu hóa quá trình ngâm chiết bằng nhiệt
Dựa vào các nghiên cứu trước về chiết xuất pectin từ lá sương sâm, hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình ngâm chiết bằng nhiệt được xác định là nhiệt độ ngâm chiết (x1 – °C) và thời gian ngâm chiết (x2 – phút).
SVTH: Trần Thị Thảo Trâm GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh 24 NCS.ThS Ngô Thị Minh Phương
Hai hàm mục tiêu là hiệu suất thu nhận pectin (%) và độ nhớt dung dịch pectin thu được (cP)
Tối ưu hóa bằng phương pháp chập phi tuyến tính (sử dụng phần mềm hỗ trợ Design Expert 9)
2.3.4 Xác định độ nhớt của pectin thu nhận bằng nhớt kế quay
Sau khi sấy và xác định khối lượng pectin, tiến hành pha chế dung dịch pectin 2% bằng nước ấm khoảng 60°C Sau ít nhất 2 giờ hydrate hóa, dung dịch được đo độ nhớt bằng thiết bị tự động Brookfield Synchro Electric Các phép đo được thực hiện ở các tốc độ 10, 12, 16, 20, 50 và 100 rpm nhằm xác định tốc độ quay phù hợp Sau khi tìm được tốc độ tối ưu, tiến hành đo độ nhớt của mẫu tại tốc độ đó và thực hiện lặp lại 3 lần.
2.3.5 Xác định cấu trúc phân tử pectin thu nhận bằng phương pháp phổ hồng ngoại FTIR (Fourier Transformation Infrared Spectrometer) a Nguyên tắc: Ở thiết bị biến đổi Fourier, bức xạ không bị tán sắc mà trái lại tất cả bước sóng đều đi đến detector cùng lúc và phương pháp biến đổi toán học (biến đổi Fourier) được áp dụng để biến đổi kết quả thu được thành một phổ hồng ngoại thông thường Giống như các máy đo hồng ngoại khác, thiết bị FTIR sử dụng dụng cụ đo giao thoa (interferometer) thay cho máy đơn sắc Dụng cụ này sẽ tách chùm tia hồng ngoại ra và sau đó kết hợp lại bằng cách cho phản xạ các chùm sáng trở lại hệ thống thông qua hệ thống các gương Do quãng đường đi của mỗi chùm sáng thay đổi khi di chuyển qua gương của nó, khi gặp lại nhau hai chùm sáng sẽ giao thoa với nhau theo kiểu tăng cường hoặc giảm tùy thuộc vào sự chênh lệch pha Do đó, cường độ của bức xạ đi đến detector thay đổi tùy thuộc vào hiệu số đường đi ánh sáng của hai chùm và đồ thị thể hiện cường độ năng lượng đo được theo hiệu số đường đi quang học được gọi là phổ giao thoa (interferogram) Khi mẫu được đặt vào đường đi của chùm ánh sáng kết hợp trước detector, phân tử trong mẫu sẽ hấp thụ bức xạ tại các tần số đặc trưng và do đó bức xạ đi đến detector bị thay đổi khi có mặt mẫu Sau đó nhờ phép biến đổi fourier, phổ giao thoa này (thể hiện mối quan hệ giữa cường độ và hiệu số quãng đường) được chuyển đổi thành phổ hồng ngoại (thể hiện mối quan hệ giữa độ hấp thụ và tần số) Phép biến đổi này được thực hiện nhanh chóng nhờ máy tính [14][25] b Cách chuẩn bị mẫu:
Phổ hồng ngoại có thể đo được với các chất phân tích ở dạng rắn, dạng lỏng tinh khiết, dạng lỏng ở trong dung dịch hoặc có thể đo ở dạng hơi
SVTH: Trần Thị Thảo Trâm GVHD: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh 25 NCS.ThS Ngô Thị Minh Phương
Để phân tích chất nghiên cứu ở dạng rắn, có thể nghiền nhỏ vài mg chất cùng với một ít parafin lỏng, sau đó ép hỗn hợp này giữa hai tấm NaCl Một phương pháp khác là trộn mẫu nghiên cứu với KBr theo tỉ lệ 1:10 hoặc 1:100, rồi ép thành viên mỏng gần như trong suốt bằng máy ép thủy lực Ngoài ra, có thể đo phổ chất rắn ở dạng màng lỏng bằng cách làm nóng chảy chất nghiên cứu hoặc làm bay hơi dung môi của dung dịch chất nghiên cứu, nếu chất đó có khả năng tạo màng.