Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định được tính kháng thuốc của vi khuẩn lao với các thuốc chống lao hàng một trên bệnh nhân lao phổi; xác định được đa hình di truyền gen NAT2 và mối liên quan tới tính kháng thuốc Isoniazid của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi. Mời các bạn cùng tham khảo.
TỔNG QUAN
Giới thiệu về vi khuẩn lao
Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, chi Mycobacterium, gồm hơn
Có 169 loài vi khuẩn, phần lớn không gây bệnh cho con người Nhóm vi khuẩn gây bệnh lao cho người được gọi là Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc), bao gồm các loài chính như Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium caprae và Mycobacterium microti, trong đó Mycobacterium tuberculosis là loài quan trọng nhất.
Mycobacterium, hay còn gọi là trực khuẩn kháng cồn kháng acid, được Robert Koch phân lập vào năm 1882 và được biết đến với tên gọi BK (Bacille de Koch) M tuberculosis là một loại trực khuẩn thanh mảnh, hơi cong, có kích thước khoảng 0,5 x 2-6 µm Vi khuẩn này không có vỏ, không có lông và không có nha bào, thường xuất hiện trong bệnh phẩm dưới dạng các đám nối đầu vào nhau Thành tế bào của M tuberculosis chứa một lượng nhỏ peptidoglycan nhưng lại giàu lipid, điều này góp phần tạo nên tính kháng cồn - kháng acid, khiến cho vi khuẩn lao không thể nhuộm bằng các phương pháp thông thường mà cần sử dụng phương pháp Ziehl - Neelsen.
Hình 1.1: M tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x
1.1.2.1 Độc lực và con đường lây truyền
Trực khuẩn lao không có ngoại độc tố và nội độc tố, nhưng độc lực của chúng liên quan đến yếu tố sợi và lớp sáp ở vách tế bào Các chủng lao độc lực chứa nhiều yếu tố sợi hóa học 6,6’-dimycoly trehalose, giúp vi khuẩn lao gắn kết thành bó; khi yếu tố này mất đi, độc lực sẽ giảm Vi khuẩn lao có khả năng sống sót trong đại thực bào sau khi bị thực bào, phát triển bên trong, phá vỡ tế bào và xâm nhập vào các đại thực bào khác.
Bệnh lao chủ yếu lây qua đường hô hấp khi người nhiễm hít phải giọt đờm chứa vi khuẩn từ bệnh nhân ho hoặc hắt hơi Vi khuẩn lao có thể xâm nhập vào phế nang, gây viêm phế quản phổi, thường không có triệu chứng rõ ràng Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm sang thai nhi qua đường máu hoặc nước ối nếu mẹ mắc lao Một con đường lây nhiễm khác là qua đường tiêu hóa khi tiêu thụ sữa bò nhiễm M bovis Từ cơ quan bị lao ban đầu, vi khuẩn có thể lây lan qua máu và bạch huyết đến các cơ quan khác như hạch, não, và xương Tuy nhiên, đường lây truyền chủ yếu vẫn là qua hô hấp.
Bệnh lao là một bệnh nhiễm trùng mạn tính do vi khuẩn lao gây ra Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào phế nang, một phần sẽ bị đại thực bào tiêu diệt, nhưng những tế bào sống sót sẽ tiếp tục sinh sản bên trong đại thực bào, hình thành các nang lao Nếu các nang lao này vỡ ra, vi khuẩn sẽ lây nhiễm rộng rãi, dẫn đến sự phát triển của bệnh lao.
Khi lần đầu tiếp xúc với vi khuẩn lao, phổi sẽ xuất hiện một phản ứng viêm cấp tính nhẹ Sau khi vi khuẩn lao bị thực bào, ở những người có hệ miễn dịch tế bào đầy đủ, lymphokin sẽ được sản xuất trong khoảng 4 - 6 tuần, giúp kích hoạt đại thực bào tiêu diệt vi khuẩn.
Khoa Sinh học 5 Khoá 2016-2018 nghiên cứu về phản ứng của cơ thể đối với vi khuẩn lao, dẫn đến việc hình thành u hạt và hoại tử trung tâm Sau khi tổn thương liền lại, vi khuẩn lao vẫn tồn tại dưới dạng không hoạt động, khiến người nhiễm chỉ biểu hiện test tuberculin (+) mà không lây nhiễm Khoảng 10% trong số họ có thể tái phát thành bệnh lao Các yếu tố nguy cơ bao gồm tuổi trẻ, bệnh đi kèm như đái tháo đường, bụi phổi, HIV, và phụ nữ mang thai, cũng như các yếu tố di truyền.
1.1.3 Nuôi cấy vi khuẩn lao Để chuẩn đoán xác định có nhiều phương pháp cận lâm sàng như nhuộm Ziehl-Neelsen tìm AFB, Xpert MTB/RIF, nuôi cấy… trong đó xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn lao là tiêu chuẩn vàng
Vi khuẩn lao, thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C và áp suất oxy 100 mmHg, là lý do chính khiến lao phổi trở thành thể bệnh phổ biến nhất Chúng không thể sinh trưởng trong môi trường thông thường và cần được nuôi cấy trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng Hình ảnh vi khuẩn M.tuberculosis được nuôi cấy trên môi trường đặc cho thấy sự phát triển của khuẩn lạc.
Vi khuẩn lao phát triển rất chậm, với thời gian phân chia khoảng 20-24 giờ trong môi trường thử nghiệm Trên môi trường Lowenstein-Jensen (LJ), vi khuẩn này cần 4-6 tuần để hình thành khuẩn lạc điển hình, có dạng R, sần sùi như hoa lơ Trong môi trường lỏng như canh thang Sauton hoặc Middlebrook 7H9, 7H12, vi khuẩn lao tạo thành váng, đám hoặc lắng cặn Hiện nay, môi trường thương mại Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) cho phép phát hiện vi khuẩn lao chỉ sau 3-13 ngày nuôi cấy.
Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc
1.2.1 Thuốc điều trị lao và phân loại lao kháng thuốc
Hiện nay, trong thực tế điều trị, người ta phân loại 2 nhóm thuốc trị bệnh lao, thường gọi là “thuốc kháng lao hàng 1” và “thuốc kháng lao hàng 2” [18]:
Kháng lao hàng 1 bao gồm các thuốc Streptomycin (SM), Rifampicin (RIF), Isoniazid (INH), Pyrazinamid (PZA) và Ethambutol (EMB) Đây là những thuốc đầu tiên được lựa chọn để điều trị cho bệnh nhân mắc bệnh lao.
Kháng lao hàng 2 bao gồm nhiều loại thuốc được chia thành 4 nhóm: Nhóm A chứa các kháng sinh Fluoroquinolones như Levofloxacin, Moxifloxacin, Gatifloxacin; Nhóm B là các thuốc tiêm như Amikacin, Capreomycin, Kanamycin; Nhóm C bao gồm các thuốc chủ đạo khác như Ethionamide, Cycloserin, Clofazimine, Linezolid, Prothionamide; và Nhóm D là các thuốc bổ sung như Isoniazid liều cao, Pyrazinamide, Ethambutol, Bedaquiline, Meropenem Những thuốc này được sử dụng khi bệnh nhân kháng với thuốc lao hàng một hoặc trong các trường hợp đặc biệt Tuy nhiên, chúng thường có nhiều tác dụng phụ và phức tạp hơn trong việc sử dụng so với thuốc kháng lao hàng một, đồng thời giá thành cũng cao hơn Việc nhận diện nhanh các chủng kháng thuốc, đặc biệt là RMP và INH, rất quan trọng để áp dụng các biện pháp điều trị kịp thời, từ đó giảm sự lan truyền của các chủng kháng thuốc.
Lao kháng thuốc có thể được phân loại dựa vào khả năng kháng các loại thuốc chống lao hàng một Nếu vi khuẩn kháng một loại thuốc kháng lao hàng một mà không phải là Rifampicin, được gọi là kháng một loại thuốc Nếu vi khuẩn kháng nhiều loại thuốc chống lao hàng một nhưng không kháng Rifampicin, được gọi là kháng nhiều loại thuốc Khi vi khuẩn kháng Rifampicin, có hoặc không kháng thêm các thuốc khác ngoại trừ Isoniazid, được gọi là kháng Rifampicin Cuối cùng, vi khuẩn kháng đồng thời với ít nhất hai thuốc Isoniazid và Rifampicin được gọi là lao đa kháng thuốc (MDR-TB).
Lao siêu kháng thuốc (XDR-TB) được phân loại dựa trên tính kháng thuốc với các thuốc chống lao hàng hai Lao tiền siêu kháng là dạng lao đa kháng có kháng thêm với bất kỳ thuốc nào thuộc nhóm Fluoroquinolone hoặc ít nhất một trong ba thuốc tiêm hàng hai, bao gồm Capreomycin, Kanamycin và Amikacin Trong khi đó, lao siêu kháng thuốc không chỉ kháng Fluoroquinolone mà còn kháng tất cả các thuốc tiêm hàng hai này.
Ngoài ra còn có phân loại bệnh nhân lao theo tiền sử điều trị:
Bệnh nhân lao mới là những người chưa từng sử dụng thuốc chống lao hoặc chỉ sử dụng trong thời gian dưới một tháng Lao phổi mới là loại bệnh lao mà bệnh nhân vừa mới được chẩn đoán mắc phải.
Lao tái trị là những bệnh nhân đã sử dụng thuốc chống lao trong thời gian trên một tháng, có thể là do đã điều trị khỏi trước đó hoặc gặp thất bại trong quá trình điều trị vì nhiều lý do Trong đó, lao phổi tái trị là tình trạng bệnh nhân tái phát mắc thể lao phổi.
Trong quá trình điều trị lao, bệnh nhân có thể gặp phải tình trạng tái nhiễm do nhiễm phải chủng vi khuẩn ngoại sinh khác với chủng vi khuẩn ban đầu, hoặc tái phát với chủng vi khuẩn giống như chủng ban đầu.
1.2.2 Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao
Kháng thuốc là hiện tượng vi khuẩn lao giảm độ nhạy cảm với thuốc điều trị, thể hiện qua việc một số chủng kiểm tra có phản ứng kém hơn so với chủng hoang dã chưa từng tiếp xúc với thuốc.
Kháng thuốc tiên phát là tình trạng kháng thuốc xảy ra ở bệnh nhân chưa từng điều trị lao, trong khi kháng thuốc thứ phát xảy ra sau khi bệnh nhân đã tiếp xúc với thuốc Ngoài ra, kháng thuốc tự nhiên đề cập đến khả năng kháng thuốc vốn có của một số chủng vi khuẩn, như M.tuberculosis có khả năng kháng tự nhiên với penicillin.
Tỷ lệ vi khuẩn lao kháng thuốc tự nhiên thay đổi tùy thuộc vào từng loại thuốc, với Rifampicin là 1/10^8, Isoniazid là 1/10^6, và Streptomycin cùng Ethambutol là 1/10^5 Trong quá trình sinh sản, vi khuẩn có thể phát sinh tính kháng thuốc do đột biến ngẫu nhiên Khi không có thuốc, các chủng mẫn cảm sẽ phát triển và lấn át các chủng đột biến Tuy nhiên, khi thuốc có mặt, áp lực chọn lọc sẽ khiến các chủng đột biến kháng thuốc trở nên ưu thế, dẫn đến việc lây lan sang người khác, khiến người nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc ngay từ đầu.
Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao tương tự như ở các loại vi khuẩn khác, bao gồm hạn chế xâm nhập của kháng sinh, sản xuất enzyme để phá hủy kháng sinh, hoặc biến đổi đích tác động của kháng sinh Khoảng 70-80% vi khuẩn lao kháng INH có sự biến đổi ở gen katG, dẫn đến giảm hoặc mất hoạt tính của men catalase-peroxidase, làm giảm tác dụng của INH INH không còn khả năng ức chế tổng hợp axit mycolic, dẫn đến kháng thuốc ở vi khuẩn lao Đối với RMP, vi khuẩn lao kháng RMP có đột biến gen rpoB, khiến RMP mất khả năng ức chế enzyme RNA-polymeraza Mỗi loại thuốc có cơ chế tác động khác nhau, do đó cũng có cơ chế kháng thuốc khác nhau.
Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tính kháng thuốc của vi khuẩn lao
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), vào năm 2014, ước tính có khoảng 480.000 ca nhiễm lao đa kháng thuốc (MDR/RR-TB) và siêu kháng thuốc (XDR-TB) ở bệnh nhân nhiễm mới, nhưng chỉ khoảng 25% trong số này được chẩn đoán và báo cáo.
Năm 2014, ước tính có 190.000 người tử vong do bệnh lao kháng đa thuốc (MDR-TB) Đến năm 2015, XDR-TB đã xuất hiện tại 105 quốc gia, với khoảng 9,7% bệnh nhân mắc MDR-TB có nguy cơ phát triển thành XDR-TB Tính đến năm 2016, có khoảng 600.000 ca nhiễm MDR/RR-TB, nhưng chỉ 153.000 ca được báo cáo và 130.000 ca được điều trị.
Việt Nam nằm trong nhóm 30 quốc gia có gánh nặng lao đa kháng thuốc cao nhất thế giới, xếp thứ 14 trong 27 quốc gia có số lượng bệnh nhân MDR-TB nhiều nhất, chiếm 1,7% toàn cầu (WHO, 2015) Ngoài ra, Việt Nam cũng là một trong 20 quốc gia ghi nhận 80% trường hợp nhiễm lao mới trên toàn thế giới Hiện tượng kháng thuốc đã được giám sát từ năm 1978, với tỷ lệ kháng thuốc giảm dần cho đến năm 1998.
Năm 1997, Việt Nam tham gia dự án nghiên cứu tình hình kháng thuốc lao toàn cầu do WHO thực hiện, cho thấy tỷ lệ kháng thuốc tiên phát ở nước ta khá cao, đạt 32,5%.
Isoniazid trong điều trị lao
1.3.1 Dược lý và chuyển hóa của Isoniazid
Isoniazid (INH) là một hydrazid của axit isonicotinic, được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1912 tại Praha, nhưng chỉ đến năm 1952 mới phát hiện tác dụng của nó đối với vi khuẩn lao Với cấu trúc đơn giản chứa vòng pyridine và nhóm hydrazide, INH có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng và tiêu diệt vi khuẩn lao cả trong và ngoài tế bào Cơ chế tác dụng của INH là ức chế sự hình thành axit mycolic trong thành tế bào của vi khuẩn lao Tuy nhiên, M.tuberculosis có thể phát triển kháng thuốc INH thông qua các đột biến ở nhiều gen như katG, ahpC, inhA, kasA, và ndh INH cần được hoạt hóa để phát huy hiệu quả điều trị.
Trong Khoa Sinh học 11 Khoá 2016-2018, catalase/peroxidase được mã hóa bởi katG đóng vai trò quan trọng trong khả năng kháng thuốc của vi khuẩn lao Isoniazid (INH) hoạt hóa can thiệp vào quá trình tổng hợp mycolic acid, một thành phần thiết yếu của vi khuẩn lao, bằng cách ức chế enzyme NADH-dependent enoyl-ACP reductase do inhA mã hóa Hai cơ chế phân tử này, bao gồm đột biến trên katG và inhA, là nguyên nhân chính dẫn đến tính kháng Isoniazid.
Sau khi uống, INH được hấp thu qua ruột vào máu, trong đó 40% ở dạng tự do và một phần kết hợp với axit amin thành hydrazol, cả hai đều có tác dụng với vi khuẩn lao Phần còn lại được chuyển hóa ở gan thành các hợp chất không có tác dụng với vi khuẩn lao, với 50% - 90% INH được acetyl hóa bởi enzyme NAT2, tạo thành acetyl Isoniazid và acetyl hydrazine INH cũng có thể bị thủy phân trực tiếp tạo ra hydrazin, sau đó NAT2 xúc tác quá trình acetyl hóa của hydrazin INH, acetyl hydrazine và hydrazin có thể bị oxi hóa bởi cytochrome P450 2E1, tạo thành các hợp chất trung gian độc hại Enzyme glutathione S-transferase (GST) giúp loại bỏ các chất chuyển hóa độc hại này bằng cách kết hợp với glutathione Cuối cùng, các chất chuyển hóa của INH chủ yếu được thải trừ qua hệ tiết niệu (80%), trong khi dưới 10% liều INH được đào thải qua phân.
Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid ở gan [40]
Nồng độ ức chế tối thiểu trong huyết thanh của INH đối với vi khuẩn lao là 0,04 àg/mL, với hệ số vượt là 20 ở người có kiểu hình acetyl hóa nhanh và 62 ở người có kiểu hình acetyl hóa chậm Nồng độ INH trong huyết thanh khác nhau giữa các cá thể tùy thuộc vào kiểu hình acetyl hóa Sau khi uống liều INH 5 mg/kg, nồng độ tối đa trong huyết tương sẽ đạt từ 3-5 àg/mL sau 1-2 giờ.
Liều dùng hàng ngày của INH cho cả trẻ em và người lớn là 5 mg (4-6 mg)/kg thể trọng, với liều tối đa là 300 mg, nên được uống một lần vào lúc đói Đối với liều cách quãng, 3 lần/tuần là 10 mg/kg thể trọng (8-12 mg), trong khi 2 lần/tuần là 15 mg/kg thể trọng (13-17 mg).
INH có thể gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng cho hệ thần kinh và gan Trên hệ thần kinh, bệnh nhân có thể gặp phải viêm dây thần kinh, co giật, viêm dây thần kinh thị giác và rối loạn tâm thần Về gan, INH có thể gây viêm gan với các triệu chứng như chán ăn, buồn nôn, nôn và mệt mỏi Khoảng 10-20% bệnh nhân sử dụng INH có thể trải qua sự gia tăng nồng độ transaminase huyết thanh (AST, ALT) và bilirubin trong máu, thường xảy ra trong 1 đến 3 tháng đầu điều trị nhưng sẽ trở lại bình thường sau đó Ngoài ra, bệnh nhân cũng có thể gặp các tác dụng phụ khác như buồn nôn, đau thượng vị, viêm tụy, thiếu máu, giảm bạch cầu hạt, giảm bạch cầu ưa axit, giảm tiểu cầu, sốt và viêm da.
1.3.2 Gen liên quan đến chuyển hóa Isoniazid ở bệnh nhân lao
Tổn thương gan do thuốc chống lao, chủ yếu do INH gây ra, là một tác dụng phụ phổ biến Quá trình chuyển hóa INH có vai trò quan trọng trong việc gây tổn thương gan Sự khác biệt về độc tính của INH liên quan đến biến đổi di truyền ở một số gen như N-acetyltransferase 2 (NAT2), Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1), glutathione S-transferase M1 (GSTM1) và glutathione S-transferase T1 (GSTT1).
Gen CYP2E1 mã hóa enzyme CYP2E1, chịu trách nhiệm chuyển hóa thuốc tại gan Enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa AcHz và Hz, tạo ra các chất trung gian độc hại cho cơ thể Đặc điểm đa hình của gen CYP2E1 ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của nó, với hoạt tính cao hơn có thể dẫn đến sự gia tăng tổng hợp các độc tố gan.
Enzyme Glutathione S-transferase (GST) đóng vai trò quan trọng trong khả năng giải độc của cơ thể bằng cách chuyển hóa các chất độc hại thành các sản phẩm ít độc hơn để thải ra ngoài GST tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc điều trị lao thông qua các phản ứng liên hợp với các chất chuyển hóa độc hại Sự thiếu hụt hoạt tính GST do đồng hợp tử tại locus GSTM1 và GSTT1 có thể làm tăng nguy cơ nhạy cảm với độc tính gan do INH Nghiên cứu cho thấy bệnh nhân Ấn Độ có GSTM1 đồng hợp tử đột biến có nguy cơ nhiễm độc gan cao hơn so với nhóm khác Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác không tìm thấy mối liên quan giữa đa hình gen GST và tổn thương gan, đồng thời cũng chỉ ra rằng một số gen khác như HLA-DQA1/DQB1 cũng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa INH.
N-acetyltransferase 2 (NAT2) là enzyme quan trọng nhất trong việc chuyển hóa Isoniazid Đa hình gen NAT2 ảnh hưởng đến tốc độ acetyl hóa, dẫn đến các kiểu hình acetyl hóa chậm, làm tăng nồng độ Isoniazid trong huyết thanh, giảm tốc độ thanh thải của thuốc và gia tăng các sản phẩm chuyển hóa trung gian có thể gây độc cho cơ thể.
Đặc điểm của gen NAT2 và đa hình gen NAT2
NAT là enzyme xúc tác cho quá trình acetyl hóa arylamine từ acetyl-CoA, được tìm thấy ở nhiều loài khác nhau Hai gen chính của NAT, NAT1 và NAT2, nằm gần nhau trên nhiễm sắc thể số 8 tại vị trí 8p22 Biểu hiện của hai gen này khác nhau ở các mô riêng biệt, với NAT1 biểu hiện chủ yếu ở mô thần kinh, gan, đường tiêu hóa và tế bào máu, trong khi NAT2 có các ưu tiên biểu hiện khác.
Gen NAT2 chỉ hoạt động tại gan và đường tiêu hóa, bao gồm hai exon, trong đó exon 2 là khung đọc mở dài 870 bp mà không có intron Đa hình gen NAT2 gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm, dẫn đến nồng độ INH trong huyết thanh tăng, giảm tốc độ thanh thải INH và làm tăng các sản phẩm chuyển hóa trung gian độc hại cho cơ thể.
Hình 1.5: Vị trí gen NAT2 trên NST số 8
Đa hình gen NAT2 đóng vai trò quan trọng trong khả năng đáp ứng thuốc và tỷ lệ mắc bệnh khi tiếp xúc với yếu tố phơi nhiễm Dựa vào kiểu gen của NAT2, enzyme này được phân loại thành ba kiểu hình: acetyl hóa nhanh (RA), acetyl hóa chậm (SA) và acetyl hóa trung gian (IA) Nghiên cứu cho thấy kiểu hình acetyl hóa nhanh xuất hiện khi có hai alen kiểu dại (NAT2*4*4), trong khi acetyl hóa trung bình liên quan đến một alen kiểu dại (NAT2*4/*5, NAT2*4/*6).
NAT2*4/*7 là kiểu gen liên quan đến acetyl hóa chậm, trong khi các đa hình alen như NAT2*5/*5, NAT2*5/*6, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7 và NAT2*7/*7 cũng gây ra hiện tượng này Các nhà di truyền học đã xác định alen kiểu dại là NAT2*4 và phát hiện 88 biến thể trên gen NAT2, trong đó có 3 alen gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm.
NAT2*5, *6, *7 được nghiên cứu nhiều nhất Alen NAT2*5 có axit amin thay thế là
The NAT2 gene exhibits variations, with the NAT2*6 allele featuring an amino acid substitution of Arg197Gln and the NAT2*7 allele showing Gly286Glu The most common phenotype observed is rapid acetylation, characterized by the homozygous wild-type genotype (NAT2*4) at all three SNP positions (T341C).
Cá thể có kiểu hình acetyl hóa trung bình thường có kiểu gen dị hợp tử tại một trong ba locus NAT2*5, *6 hoặc *7, trong khi những người acetyl hóa chậm thường có nhiều hơn một đa hình alen Nhiều nghiên cứu cho thấy bệnh nhân có kiểu hình acetyl hóa chậm có nguy cơ tổn thương gan, tác dụng phụ và tỷ lệ thất bại điều trị cao hơn so với hai kiểu hình còn lại Đặc biệt, gần 50% người da trắng Châu Âu có kiểu hình acetyl hóa chậm, trong khi chỉ 10% người Nhật có kiểu hình này Tại Nhật và Đài Loan, bệnh nhân có kiểu hình chuyển hóa INH chậm có nguy cơ nhiễm độc gan cao gấp 28 lần so với những người chuyển hóa nhanh Nghiên cứu tại Hàn Quốc cũng chỉ ra rằng kiểu hình acetyl hóa chậm có nguy cơ nhiễm độc gan cao gấp 3 - 8 lần khi điều trị bằng INH so với kiểu chuyển hóa nhanh Một nghiên cứu tổng hợp 14 nghiên cứu khác cho thấy mối liên quan đáng kể giữa acetyl hóa chậm và nguy cơ nhiễm độc gan do INH Tại Việt Nam, nghiên cứu gần đây cho thấy người Việt Nam có tỷ lệ acetyl hóa nhanh chiếm ưu thế.
Enzyme NAT2 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi phản ứng quá mẫn với thuốc và môi trường, đồng thời giúp giải độc nhiều loại thuốc và hóa chất độc hại, bao gồm cả hợp chất gây ung thư Nghiên cứu suốt hơn 50 năm qua đã chỉ ra tầm quan trọng của việc xác định kiểu hình acetyl hóa ở bệnh nhân lao và những người tiếp xúc với tác nhân ung thư Việt Nam hiện xếp thứ 14 trong số 30 quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao nhất thế giới, do đó, việc xác định kiểu hình acetyl hóa không chỉ hỗ trợ các bác sĩ trong việc điều chỉnh liều Isoniazid cho bệnh nhân lao mà còn cung cấp dữ liệu di truyền để đánh giá các yếu tố nguy cơ, đặc biệt là đối với những người mắc lao kháng Isoniazid.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Dụng cụ, trang thiết bị
Thiết bị chính : Hệ thống cấy nhanh BACTEC MGIT 960 hoặc 320
The article highlights essential laboratory equipment, including a Class II biosafety cabinet (Telstar, USA), a cold centrifuge with a centrifugal force exceeding 3000g (USA), a shaker (Scientifica, Europe), and various refrigeration units such as a deep freezer and refrigerator (Panasonic, Japan) It also mentions a balance (Shinko, Japan), an incubator or warming chamber (Memmert, Germany), a microscope (Olympus, Japan), a wet autoclave (Tomy, Japan), a gel imaging system (Gel Doc It, USA), and an electrophoresis system (Cleaver Scientific, UK) Additionally, it features a PCR machine (Prime Thermal Cycler, UK), another biosafety cabinet (ESCO, Singapore), the EBA 21 centrifuge (Hettich Zentrifugen, Germany), a spectrophotometer (NP80, Nanophotometer, Germany), and a flake ice machine (Fiocchetti, Italy).
Dụng cụ và vật tư cần thiết bao gồm: lam kính trứng, ống thủy tinh vô trùng, lọ nhựa chia vạch vô trùng, pipet nhựa chia vạch, pipet tự động với dung tích 2-100µL và 1000µL kèm đầu cụt vô trùng, ăng nhựa vô trùng, ống bi vô trùng, găng tay và khẩu trang N95.
Các hóa chất chính dùng cho phân lập, nuôi cấy và kháng sinh đồ lao:
The decontamination solution and phosphate buffer, along with the Ziehl-Neelsen staining kit, are essential components for tuberculosis testing The MGIT liquid culture system includes BBL MGIT 7mL tubes, 15mL BACTEC MGIT Growth Supplement, BBL MGIT PANTA, and the BD MGIT TM TBcID rapid test for MTB identification Additionally, the PZA liquid antibiotic susceptibility testing kit comprises MGIT960 PZA tubes, BACTEC MGIT 960 PZA Supplement, AST code pricing, PZA antibiotics at 8000 µg/ml, and standard turbidity measures of 0.5 and 1.0 McFarland Sterile distilled water and LJ media, both with and without antibiotics, are also included in the setup.
Key chemicals for NAT2 gene polymorphism analysis include the E.Z.N.A blood DNA Mini kit from Omega-Biotek, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA) Disodium Salt Dihydrate from Affymetrix, TAE 1X, 5X DNA loading dye from ThermoScientific, and the Gene Ruler Ladder DNA marker.
Đối tượng nghiên cứu
The article discusses various laboratory reagents and tools, including the Lambda DNA/HindIII Ladder and Kapa2G TM Robust HotStart ReadyMix (2X) from ThermoScientific and Kapabiosystems, respectively It also mentions Tris base sourced from Bio Basic, acetic acid from Merck, and ion-exchanged water from Omega Biotek Additionally, the article highlights primer pairs synthesized by IDT, emphasizing the importance of these components in scientific research and experimentation.
2.2.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 3/2017 đến tháng 6/2018 tại ba bệnh viện: Bệnh viện Bệnh phổi Trung ương, Bệnh viện Lao phổi Hà Nội và Bệnh viện 74 Trung ương Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều đáp ứng các tiêu chuẩn đã được đề ra.
Chẩn đoán ban đầu: lao phổi mới hoặc lao phổi tái trị
Kết quả Genxpert MTB+/RIF-
Chỉ định điều trị phác đồ có INH Điều trị nội trú tại bệnh viện
Chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu
Chuẩn đoán xác định: lao phổi có bằng chứng vi khuẩn - nuôi cấy dương tính và định danh Mycobacteria tuberculosis;
- Bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS
- Phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp tiến cứu kết hợp hồi cứu, sử dụng mẫu thuận tiện Đối tượng tham gia được chọn dựa trên tiêu chuẩn mục 2.2.1 và phải tự nguyện đồng ý tham gia Quá trình thu thập mẫu diễn ra từ tháng 3/2017 đến tháng 6/2018 cho đến khi đạt được cỡ mẫu 125.
2.3.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm
Bệnh nhân đạt đủ 5 tiêu chuẩn đầu tiên trong mục 2.2.1 sẽ được lấy đờm (3-5ml) theo hướng dẫn của Chương trình chống lao quốc gia (2017) để nuôi cấy và theo dõi kết quả Nếu kết quả định danh là MTB, mẫu sẽ được gửi đến Khoa Vi sinh và Labo tham chiếu Quốc gia của Bệnh viện Phổi trung ương để lưu trữ tại -70 0 C, chờ thực hiện kháng sinh đồ đặc và lỏng.
Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu và luân chuyển mẫu tại 3 bệnh viện
2.3.3 Quy trình nuôi cấy đờm trên môi trường lỏng BACTEC MGIT
Nguyên lý hoạt động của hệ thống BACTEC MGIT 960/320 dựa trên việc sử dụng một lớp huỳnh quang nằm bên trong lớp silicon ở đáy ống có đường kính 16x100 mm, nhạy cảm với nồng độ oxy hòa tan Ban đầu, nồng độ oxy trong ống làm bất hoạt huỳnh quang Khi vi sinh vật tiêu thụ oxy, nồng độ oxy giảm, dẫn đến sự phát quang Ống môi trường được ủ liên tục ở 37°C, và tín hiệu huỳnh quang được giám sát mỗi 60 phút Khi có sự phát hiện vi sinh vật, máy sẽ báo dương bằng tín hiệu đèn và âm thanh khi nồng độ vi sinh vật đạt khoảng 10^5.
10 6 CFU/mL Sau 42-56 ngày nếu không có tín hiệu huỳnh quang được thu nhận thì máy sẽ báo âm tính
Mẫu đờm nuôi cấy, định danh MTB tại Bệnh viện Phổi Hà Nội
Mẫu đờm nuôi cấy, định danh MTB tại Bệnh viện K74
Nuôi cấy, định danh và phân lập làm kháng sinh đồ tại khoa Vi sinh và Labo Lao chuẩn Quốc Gia - Bệnh viện Phổi Trung ương
Hình 2.2: Hệ thống BACTEC MGIT 960
Để tiến hành thu thập mẫu đờm, cần lấy 3-5 ml đờm có nhày mủ cho vào ống falcon 50ml Sau đó, mẫu đờm của bệnh nhân sẽ được khử tạp bằng dung dịch NaCl-NaOH với tỉ lệ pha 1:1 Tiến hành khuấy đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, sau đó thêm dung dịch cần thiết.
Hòa tan NaCl và NaOH cho đến khi đạt thể tích 40 ml, sau đó ly tâm ở 3000 rpm trong 15 phút ở nhiệt độ 10 độ C Gạn lấy dịch nổi và thêm 0,5 ml dung dịch đệm nuôi cấy để thu được huyền dịch Huyền dịch này được chuyển vào ống MGIT đã bổ sung các yếu tố tăng trưởng (PANTA supplement), kháng sinh và kháng nấm, sau đó được nuôi cấy trong hệ thống BACTEC MGIT.
Kết quả cấy được theo dõi trong 42 ngày, với mẫu bệnh phẩm được máy tự động ghi nhận Phương pháp đánh giá kết quả được tóm tắt trong bảng 2.1.
Bảng 2.1: Nhận định kết quả nuôi cấy MGIT
Máy báo Nhuộm soi Định danh Kết quả
Dương Vi khuẩn khác, nấm Ngoại nhiễm
AFB cuộn thừng, AFB Dương tính M.tuberculosis complex Âm tính NTM*
AFB vụn Âm tính NTM* Âm tính Không thấy cặn vụn Âm tính
Có cặn vụn hoặc nhuộm soi dương tính làm theo quy trình ống dương
* NTM: Non-tuberculosis Mycobacteria (Mycobacteria ngoài lao)
2.3.4 Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một
Kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao được thực hiện bằng 2 phương pháp: môi trường lỏng cho Pyrazinamid (PZA) và môi trường đặc cho 4 thuốc còn lại là Rifampicin (RMP), Isoniazid (INH), Ethambutol (EMB), và Streptomycin (SM) Quá trình này diễn ra trong phòng an toàn sinh học có áp lực âm và tủ an toàn sinh học cấp độ II, theo quy trình chuẩn của Labo Lao tại Bệnh viện Phổi Trung ương.
2.3.4.1 Phương pháp xác định tính kháng Pyrazinamide (PZA) trên môi trường lỏng
Hệ thống BACTEC MGIT 960 được sử dụng để thực hiện thử nghiệm kháng sinh đồ PZA, dựa trên chỉ số growth unit (GU) Hệ thống tự động so sánh sự phát triển của vi khuẩn trong ống chứa thuốc kháng sinh với ống đối chứng không có thuốc, và tự động phân tích kết quả Chủng vi khuẩn được pha theo tỷ lệ quy định và cấy vào môi trường lỏng MGIT có và không có PZA, sau đó đưa vào hệ thống nuôi cấy Hệ thống giám sát liên tục sự phát quang của ống cấy dựa trên đơn vị sinh trưởng GU, và kết quả kháng sinh đồ được báo cáo trong vòng 4 ngày.
Sau 21 ngày, khi ống chứng đạt 400 GU, việc so sánh sự phát triển của vi khuẩn lao trong ống chứng và ống có thuốc PZA cho thấy rằng ống có thuốc PZA với GU < 100 là nhạy cảm, trong khi GU > 100 cho thấy tình trạng kháng thuốc Mỗi mẻ kháng sinh đồ trong ngày được kiểm tra chất lượng bằng chủng chuẩn H 37 RV 10 0 và được thực hiện như một chủng thử nghiệm.
Chuẩn bị môi trường thử nghiệm bằng cách sử dụng 02 ống (ống chứng và ống thử nghiệm) chứa MGIT960 PZA với 0,8ml yếu tố sinh trưởng Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và ngày xét nghiệm lên ống Pha PZA với nồng độ 8000µg/ml trong 2.5 ml nước cất, sau đó lấy 100µl PZA bổ sung vào ống MGIT thử nghiệm.
Chuẩn bị chủng làm kháng sinh đồ yêu cầu sử dụng các chủng thuần Để tạo huyền dịch vi khuẩn, cần gặt chủng vào ống bi thủy tinh vô trùng cùng vài giọt nước cất, sau đó vorton trong 2-3 phút cho đến khi chủng hòa tan hoàn toàn Tiếp theo, ủ trong 15 phút rồi thêm nước cất và khuấy đều, điều chỉnh huyền dịch đạt độ đục hơn chuẩn Mac Farland 1.0 Sau 20 phút, chuyển phần huyền dịch đã chuẩn bị.
Khoa Sinh học 21 Khoá 2016-2018 thực hiện quy trình pha loãng huyền dịch bằng cách chuyển nước nổi sang ống vô trùng khác Nước cất được thêm vào để điều chỉnh huyền dịch đạt độ đục tương đương với chuẩn Mc Farland 0.5 Huyền dịch được pha loãng với tỷ lệ 1:5 và sử dụng làm kháng sinh đồ Tiếp theo, 1ml huyền dịch đã pha loãng 1:5 được tiếp tục pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:10, tạo ra huyền dịch để cấy vào ống MGIT960 PZA, phục vụ cho ống chứng GC.
Cấy huyền dịch vi khuẩn vào môi trường kháng sinh đồ bằng cách sử dụng Pipet tự động để hút 0,5ml huyền dịch vào ống chứng GC và 0,5ml huyền dịch pha loãng tỷ lệ 1:5 vào ống thử nghiệm PZA Sau khi vặn chặt nắp và đảo ngược ống 3-4 lần để đồng nhất dung dịch, xếp hai ống vào giá code AST theo thứ tự GC-PZA Đưa giá code AST vào máy BACTEC MGIT960 và ghi thông tin vào sổ kháng sinh đồ Kết quả kháng sinh đồ sẽ được báo khi ống chứng GC đạt 400GU trong khoảng 4-21 ngày, với ngưỡng kháng là 100GU Kết quả có thể thông báo theo một trong ba trường hợp.
+ Kết quả nhạy (S): ống thử nghiệm PZA có mức GU < 100
+ Kết quả kháng (R): ống thử nghiệm PZA có mức GU > 100
Kết quả không kết luận được khi ống thử nghiệm GU >400 và thời gian máy báo < 4 ngày, có thể do pha huyền dịch đặc hoặc chủng nhiễm trùng Đối với lỗi GU