Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm chứng minh khả năng lưu trú và nẩy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng, và ảnh hưởng của nó tới sự đa dạng quần xã vi sinh vật trong ruột tôm. Đánh giá mức độ tăng trưởng của các chỉ số miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng khi cho ăn bào tử B. aquimaris SH6, kèm theo các chỉ số tăng trọng và tăng hàm lượng astaxanthin ở tôm. Mời các bạn cùng tham khảo.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
2.1.1 Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)
Nghiên cứu sử dụng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) được cung cấp từ cơ sở nuôi tôm tại Từ Sơn - Bắc Ninh, với độ tuổi 30 ngày và trọng lượng từ 1,2 - 1,5 g Các mẫu tôm đảm bảo đồng đều về kích thước và trọng lượng Trước khi tiến hành thí nghiệm, tôm được nuôi thuần trong điều kiện phòng thí nghiệm với nhiệt độ từ 26-28°C, pH 7,5-8,5 và độ mặn 16‰ trong khoảng thời gian nhất định.
Chủng vi khuẩn B aquimaris SH6, được phân lập từ ruột tôm thẻ chân trắng, đã được nghiên cứu bởi Ngo và cộng sự vào năm 2016.
SH6 có màu sắc vàng cam đặc trưng do khả năng sản sinh carotenoid (Hình 2.1)
Hình 2.1: Bào tử B aquimaris SH6
A - Bột bào tử B aquimaris SH6 (3 × 10 11 CFU/g) màu đỏ cam B - Hình ảnh hiển vi quang học bào tử B aquimaris SH6 [48].
Thức ăn cho tôm thẻ chân trắng trong nghiên cứu này được sản xuất bởi hãng Tomboy – Sketting tại Việt Nam, với kích thước phù hợp theo độ tuổi và kích thước của tôm (Hình 2.2).
Hình 2.2: Thức ăn cho tôm thẻ chân trắng
A - Thức ăn chưa trộn bào tử B - Thức ăn đã trộn bào tử và bao dầu
2.1.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm:
- LB (Luria Bertani) dạng lỏng, pH 7,5-8,5: Peptone (15 g/l), cao nấm men (5 g/l), NaCl (5 g/l) (Trung Quốc)
- LB (Luria Bertani) dạng rắn, pH 7,5-8.5: Peptone (15 g/l), cao nấm men (5 g/l), NaCl (5 g/l), thạch (16-18 g/l) (Trung Quốc)
- MRS dạng rắn, pH 5,6 ± 0,2 (Oxoid, Anh): 56 g/l
Môi trường sinh bào tử:
- DSM (Difco Sporulation medium), pH 7,5-8,5: Nutrien Broth (8 g/l) (Merck, Đức); KCl (1 g/l); MgSO4.7H2O (0,25 g/l); Ca(NO3)2 1M (1 ml/l); MnCl2
0,01M (1 ml/l); FeSO4 1 mM (1 ml/l) (Trung Quốc)
Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng các hóa chất tiêu chuẩn cho nuôi cấy vi sinh vật và thử nghiệm hóa sinh học, được cung cấp bởi các hãng uy tín như Merck (Đức) và BioBasic (Canada) cho hoạt tính enzyme, cùng với Enzynomics (Hàn Quốc) và Quiagen (Đức) cho các thí nghiệm sinh học phân tử Dưới đây là danh sách một số hóa chất chính.
Hóa chất, thành phần phản ứng tạo cDNA, PCR và Real-time PCR:
- Phản ứng tạo cDNA sử dụng enzyme phiờn mó ngược M-MLV, V = 20 àl
Thành phần phản ứng Thể tích
M-MLV Reverse Transcriptase 1 àl dNTP: 2 àl
Khuụn DNA/cDNA (100-150 ng/àl): 2 àl
Thành phần phản ứng Thể tích
10X nTaq buffer: 2 àl nTaq DNA polymerase: 0,2 àl
Khuụn DNA/cDNA (50-100 ng/àl): 2 àl
- Phản ứng Real-time PCR , V = 20 àl
Thành phần phản ứng SYBR
Taq-man Probe TOPreal TM qPCR 2X PreMIX (SYBR Green): 10 àl
TOPreal TM One-step 4X RT qPCR Kit (TaqMan Probe): 5 àl
Fw (5 pmol/àl): 1 àl 1 àl
Rv (5 pmol/àl): 1 àl 1 àl
Nước khử RNA: 6 àl 9,8 àl
Khuụn DNA/cDNA (50-100 ng/àl): 2 àl 2 àl
Hóa chất cho đánh giá hoạt tính enzyme PO (Phenoloxydase) [30]:
- Đệm cacodylate: 0,01M Natri cacodylate; 0,45M NaCl; 0,01M CaCl2; 0,26M MgCl2, pH 7,0
- Trypsin: 100 àg/ml trong đệm cacodylate
- L-DOPA (L-3-4-dyhydroxyphenylalanine): 3 mg/ml trong đệm cacodylate
Hóa chất cho đánh giá hoạt tính enzyme SOD (Superoxidase dimutase) [46]:
- Đệm phosphate: Dung dịch đệm K2HPO4 216 mM, pH 7,8
- Pha hỗn hợp dung dịch phản ứng đo hoạt tính enzyme SOD: Đệm phosphate (K2HPO4 216 mM, pH 7,8); EDTA 10,7 mM pH 8,5; Cytochrome C 1,1 mM; xanthin 0,108 mM; xanthin oxidase (XOD)
Hóa chất tách chiết carotenoid: Methanol và chloroform [34]
2.1.6 Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: Bình tam giác (dung tích 50 ml, 200 ml, 1l), đĩa petri, que cấy, pipet, cuvet, đĩa 96 giếng, ống falcon (15 ml, 50 ml), ống eppendoft (1,5 ml, 2 ml), ống PCR,…
Trong nghiên cứu vi sinh vật, các thiết bị quan trọng bao gồm tủ nuôi cấy vi sinh vật, tủ an toàn sinh học, nồi hấp khử trùng, và lò vi sóng Bên cạnh đó, bể ổn nhiệt, máy lắc, máy ly tâm, máy PCR và máy Real-time PCR cũng đóng vai trò thiết yếu Đặc biệt, máy quang phổ UV-Vis và máy quang phổ Nano DropOne Microvolume UV-Vis là công cụ không thể thiếu trong phân tích mẫu Cuối cùng, tủ lạnh với các mức nhiệt độ 4°C, -20°C và -80°C giúp bảo quản mẫu một cách hiệu quả.
Phương pháp
2.2.1 Chuẩn bị bào tử B aquimaris SH6 và tách chiết carotenoid
Bào tử B aquimaris SH6 được tạo ra từ chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm thẻ chân trắng, theo nghiên cứu của Ngo và cộng sự Quy trình tạo bào tử bắt đầu bằng việc cấy tế bào sinh dưỡng B aquimaris SH6 trên đĩa thạch LB và ủ ở 35°C trong 16 giờ Sau đó, các khuẩn lạc màu vàng cam được cấy vào môi trường LB lỏng và nuôi lắc để tạo chủng giống cấp 1 Tiếp theo, 1 ml giống cấp 1 được cấy vào 10 ml LB lỏng để tạo giống cấp 2, và sau đó 10 ml giống cấp 2 được chuyển vào 500 ml môi trường DSM lỏng, nuôi lắc trong 48-72 giờ ở nhiệt độ 33-35°C để tạo bào tử Hiệu suất hình thành bào tử được kiểm tra bằng kính hiển vi quang học, với mục tiêu đạt trên 95% trước khi ly tâm dịch nuôi.
Bằng máy ly tâm SIGMA 3K của Đức, chúng tôi đã ly tâm ở tốc độ 7000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ dịch nuôi và thu được sinh khối bào tử SH6 màu vàng cam Sau đó, bào tử được rửa bằng dung dịch muối NaCl 0,9% và ly tâm lặp lại ở cùng tốc độ để loại bỏ dịch rửa, quá trình này được thực hiện 2-3 lần Cuối cùng, bào tử SH6 được trộn với dung dịch NaCl 0,9%, chia nhỏ và bảo quản ở -20°C cho các nghiên cứu tiếp theo Để xác định nồng độ bào tử (CFU/ml), mẫu bào tử SH6 được pha loãng đến nồng độ 10^-7 và cấy trải trên đĩa thạch LB hoặc DSM ở ba nồng độ pha loãng liên tiếp (10^-5, 10^-6, 10^-7) để đếm số khuẩn lạc hình thành (CFU), từ đó tính toán nồng độ bào tử bằng công thức.
- CFU/ml: số tế bào vi khuẩn trong 1ml mẫu
- C: Tổng số tế bào vi khuẩn đếm được trên mỗi đĩa ở độ pha loãng tương ứng (25-250 khuẩn lạc)
- ni: Số đĩa petri cấy tại độ pha loãng tương ứng
- di: Hệ số pha loãng tương ứng
- vi: Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa tại độ pha loãng tương ứng
Môi trường nuôi cấy cùng với các dụng cụ và thiết bị sử dụng trong quá trình nuôi cấy đều phải được khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút, nhằm loại bỏ hoàn toàn các vi sinh vật nhiễm từ môi trường bên ngoài.
Để thu được dịch chiết carotenoid từ tế bào SH6, tế bào sinh dưỡng B aquimaris SH6 được kích hoạt bằng cách cấy ziczac trên đĩa thạch LB và ủ trong 16 giờ ở nhiệt độ 35°C Sau đó, 2-3 khuẩn lạc màu vàng cam riêng biệt trên đĩa được cấy vào 5 ml môi trường LB lỏng và nuôi lắc ở tốc độ thích hợp.
Để tạo giống SH6 cấp 1, cấy chuyển 1 ml giống vào 10 ml LB lỏng và nuôi lắc ở 200 vòng/phút trong 16-18 giờ Tiếp theo, cấy chuyển 10 ml giống SH6 cấp 2 vào 500 ml môi trường LB lỏng với tỷ lệ 1:50 và nuôi lắc ở cùng tốc độ trong 24 giờ để thu tế bào sinh dưỡng Nhiệt độ nuôi lắc cho SH6 là 33-35°C, sau 24 giờ tiến hành ly tâm để thu sinh khối Phương pháp tách chiết carotenoid được tham khảo từ các nghiên cứu trước, tuy nhiên, việc sử dụng dung môi methanol:chloroform có thể gây độc cho tôm khi cho ăn Do đó, chúng tôi sử dụng dầu gan cá làm dung môi tách chiết Sinh khối tế bào SH6 được đông ở -80°C trong 4 giờ, sau đó giã nhuyễn và phá tế bào bằng máy Sonicator Dịch chiết carotenoid được đo quang phổ ở bước sóng 480 nm để xác định nồng độ astaxanthin, và được bảo quản ở -20°C cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 2.3: Đường chuẩn nồng độ Astaxanthin
2.2.2 Chuẩn bị thức ăn cho tôm Đầu tiên, thức ăn của tôm được khử trùng ở 121°C, 15 phút để diệt toàn bộ các probiotic dạng Bacillus sp có sẵn và các vi sinh vật nhiễm trong quá trình vận chuyển và bảo quản thức ăn Sau đó, tiến hành trộn thức ăn theo các nhóm thí nghiệm (theo phần Kế hoạch thí nghiệm) Nhóm “ĐC” là thức ăn tôm đã khử trùng, không bổ sung bất kỳ thành phần Carophyll hay bào tử Nhóm “Carophyll”: hòa tan 0,5 g bột Carophyll pink vào 10 ml DW (70°C), phun đều lên bề mặt 100 g thức ăn đã khử trùng để đạt nồng độ astaxanthin cuối cùng là 0,5 mg/g thức ăn Nhóm “SH6 carotenoid”: dựa vào nồng độ carotenoid đã xác định (xem phần 2.2.1) pha dịch chiết carotenoid trong 10ml dầu gan cá và phun đều lên bề mặt 100 g thức ăn đã khử trùng để đạt nồng độ carotenoid cuối cựng là 5 àg/g thức ăn Nhúm “SH6 spore”: hũa tan dịch lưu bào tử SH6 trong 10 ml DW, phun đều lên bề mặt 100 g thức ăn đã khử trùng Đối với các nhóm: “ĐC”, “Carophyll” và “SH6 spore”, thức ăn sau khi trộn với các thành phần trên sẽ được bao phủ bằng 10 ml dầu gan cá để giảm thiểu tối đa hiện tượng viên thức ăn bị tan ra trong nước nuôi tôm Riêng nhóm “SH6 carotenoid” không cần tiến hành bao dầu do đã sử dụng dầu gan cá làm dung môi chiết và pha loãng carotenoid Thức ăn đã bao dầu sẽ được mã hóa, chia nhỏ và bảo quản ở -20°C
2.2.3 Bố trí các nhóm thi ghiệm và quy trình nuôi tôm Để đánh giá khả năng lưu trú của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm và hoạt tính probiotic của chúng đối với tôm thẻ chân trắng (L vannamei) với các chỉ số cụ thể như: tăng trọng lượng, tăng hàm lượng astaxanthin, màu sắc và các chỉ tiêu miễn dịch, chúng tôi thiết kế và thực hiện thí nghiệm với 4 nhóm thí nghiệm gồm: “ĐC”,
Trong nghiên cứu này, các yếu tố như "Carophyll", "SH6 spore" và "SH6 carotenoid" đã được theo dõi trong vòng 28 ngày, với thời gian thu mẫu và số lượng mẫu được mô tả chi tiết trong thiết kế thí nghiệm Mỗi nhóm thí nghiệm bao gồm 70 tôm được nuôi trong 2 bể, tất cả được thực hiện tại phòng Sinh học Nano và Ứng dụng - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ enzyme và protein - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, nơi nhiệt độ được kiểm soát chặt chẽ.
Để nuôi tôm thẻ chân trắng hiệu quả, nhiệt độ cần duy trì liên tục ở mức 26-28°C và pH trong khoảng 7,5-8,5 Bể nuôi phải được sục khí liên tục để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho tôm, đồng thời nước nuôi cũng cần được lọc liên tục và thay đổi định kỳ mỗi 5 ngày, tối đa 30% lượng nước Quy trình kỹ thuật này được tham khảo từ tài liệu “Kỹ thuật nuôi tôm thẻ chân trắng” của tác giả Thái Bá Hồ và các nghiên cứu liên quan, nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi trong phòng thí nghiệm Mô hình bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm được thể hiện trong Hình 2.4.
Hình 2.4 : Mô hình bể nuôi tôm trong quy mô phòng thí nghiệm
Mỗi bể nuôi tôm có dung tích 45 lít, chứa 25 lít nước với độ mặn 16‰, được vận hành bằng hệ thống sục khí liên tục để đảm bảo oxy hòa tan đủ cho tôm Hệ thống bơm tuần hoàn được lắp đặt để lọc nước, loại bỏ chất cặn bã như phân tôm và thức ăn thừa, nhưng cần tắt bơm trong 1 giờ đầu khi cho tôm ăn để tránh lọc bỏ thức ăn Các bể nuôi tôm được bố trí trong phòng thí nghiệm Tôm được cho ăn 3 lần/ngày trong 28 ngày, với lượng thức ăn mã hóa từ 2-3 gram mỗi ngày.
Để đảm bảo phát hiện kịp thời những thay đổi về sức khỏe của tôm, cần theo dõi sức khỏe, vận động và khả năng ăn của tôm hàng ngày nhằm thực hiện các điều chỉnh phù hợp.
Hình 2.5: Bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm
A - Đại diện hệ thống các bể nuôi tôm quy mô phòng thí nghiệm B - Đại diện một bể nuôi tôm có hệ thống sục khí và bơm
Phương pháp và nguyên tắc thu mẫu:
Tiến hành thu mẫu tôm ngẫu nhiên tại các thời điểm xác định, với 03 mẫu cho mỗi nhóm thí nghiệm Sử dụng bộ dụng cụ đã khử trùng như dao, kéo, và kẹp để giải phẫu tôm, cẩn thận lấy các bộ phận cần thiết và cho vào ống eppendorf 2 ml vô trùng Mẫu cần được xử lý ngay lập tức hoặc bảo quản lạnh ở -80°C để đảm bảo tính chất mẫu được duy trì.
2.2.4 Xác định số lượng B aquimaris SH6 và tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm
Trong quá trình nuôi tôm, mẫu tôm được thu thập (n = 3) vào các thời điểm ngày 0, 1, 3, 7, 14 và 28, được ký hiệu lần lượt là 0 D, 1 D, 3 D, 7 D, 14 D và 28 D Sau khi thu mẫu, tiến hành giải phẫu và thu toàn bộ ruột tôm vào ống eppendorf 2 ml vô trùng, sau đó giã nhuyễn bằng que giã.
Để tiến hành phân tích vi sinh vật trong ruột tôm, đầu tiên, cần vô trùng và bổ sung 1 ml NaCl 0,9%, sau đó ủ trong 15 phút và lắc vortex trong 1 phút để hòa tan vi sinh vật Tiếp theo, pha loãng dịch đồng nhất chứa vi sinh vật đến độ pha loãng 10^4 Cuối cùng, cấy 100 µl dịch pha loãng lên đĩa thạch LB, đảm bảo mỗi nồng độ được lặp lại.
Số khuẩn lạc thu được trên đĩa là cơ sở để xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm, trong đó khuẩn lạc có màu sắc và hình thái đặc trưng, nghi ngờ là B aquimaris SH6, được kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA Quá trình phân lập vi sinh vật hiếu khí được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên đĩa thạch, chọn lọc các khuẩn lạc riêng rẽ, và tách chiết DNA tổng số bằng bộ Kit Anapure Bacterial DNA Mini Kit Chất lượng DNA tách chiết được kiểm tra bằng điện di gel electrophoresis và định lượng bằng máy quang phổ Nano DropOne Sản phẩm DNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR nhằm nhân bản đoạn gen 16S rRNA với kích thước 1500 bp, sau đó tinh sạch bằng Kit Anapure PCR Product & Gel Purification Mini Kit và giải trình tự tại 1st BASE DNA Sequencing Division Những sản phẩm có độ tương đồng > 98% với trình tự trong ngân hàng gen NCBI được chọn để xác định loài tương ứng với khuẩn lạc phân lập, từ đó phân tích và xác định tỷ lệ phần trăm mỗi chủng dựa trên số khuẩn lạc trên đĩa thạch (CFU/g ruột).