Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp tách, tinh sạch ADN tổng số
Các bước tinh sạch ADN tổng số từ mẫu được thực hiện như sau:
- 250 àl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm đƣợc trộn đều trong 500 àl dung dịch sucrose/proteinase K,
(2) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1)
- Bổ sung 200 àl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/ 15 phút, ở nhiệt độ 4 o C
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450 μl isopropyl + 450 μl dịch nổi phía trên, trộn đều
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 o C
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 70% (pha trong nước cất đã xử lý DEPC)
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 o C
- Loại bỏ hết cồn Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
- Tủa ADN đƣợc hũa tan trong 30 àl dung dịch đệm TE (pH = 8,0)
3.2.2 Phương pháp tách, tinh sạch ARN tổng số
Các bước chiết tách ARN tổng số được thực hiện như sau:
- 250 àl huyễn dịch tế bào đƣợc trộn đều trong 750 àl TRIzol Reagent
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút
- Bổ sung 200 àl dung dịch chloroform vào ống mẫu sau khi ly giải
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 o C
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450 μl isopropyl + 450 μl dịch nổi phía trên (thu được sau bước 2), trộn đều
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 o C
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 75% (pha trong nước cất đã xử lý DEPC)
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4 o C
- Loại bỏ hết cồn Hong khô ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 phút
- Tủa ARN được hũa tan trong 30àl nước cất 3 lần đó xử lý DEPC
- ARN sau tách chiết đƣợc bảo quản ở -70 o C
3.2.3 Phương pháp PCR phát hiện các virus và mycoplasma tạp nhiễm
Danh mục mồi đặc hiệu để phát hiện tạp nhiễm virus và mycoplasma được trình bày trong bảng 3.2 Nghiên cứu này sử dụng kít PCR i-Star Master với các thành phần đã được phối hợp sẵn, trong đó thể tích cuối cùng của phản ứng là 20 µl, bao gồm 17 µl i-Star Master mix solution, 1 µl mồi xuôi, 1 µl mồi ngược và 1 µl ADN mẫu tách chiết hoặc cDNA Chu trình nhiệt tối ưu cho các phản ứng PCR được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các giai đoạn của phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian (giây) Số vòng lặp
* Nhiệt độ bắt mồi cho từng cặp mồi như sau: PcF1/PcR1 (50 o C), MHP-2L/MHP-2R (52 o C), 2aF/VR2
(52 o C), 2bF/VR2 (52 o C), PALN/PARN (54 o C), VF2/VR2 (55 o C), T1/T2 (55 o C), CSFV-F/CSFV-R (56 o C), PRRSV-F/PRRSV-R (56 o C), PPV-F/PPV-R (56 o C), PRV-F/PRV-R (56 o C), PCV1-iF/PCV1-oR (60 o C), CV1/CV2 (60 o C)
** Đối với cặp mồi CV1/CV2, thời gian của giai đoạn kéo dài là 90 giây
Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2%, có bổ sung thuốc nhuộm RedSafe Nucleic Acid Staining (1x)
3.2.4 Phương pháp thực hiện phản ứng real-time PCR
Nghiên cứu này áp dụng kít real-time thương mại với 2 àl ADN tổng số cho mỗi phản ứng Phản ứng được thực hiện trên hệ thống CFX 96 Realtime (BioRad) và được điều khiển, phân tích bằng phần mềm CFX manager 3.0 Chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng real-time PCR được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5 Chu trình nhiệt hai giai đoạn của phản ứng real-time PCR
Các giai đoạn của phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian (giây) Số vòng lặp
Phản ứng real-time PCR đƣợc đánh giá hợp lệ nếu (i) hiệu suất (E) trong khoảng 90% đến 105%; (ii) giá trị R 2 của đường chuẩn > 0,97 và (iii) độ dốc
(slope) của đường chuẩn trong khoảng 3,2 đến 3,7 Mẫu xét nghiệm được đánh giá là dương tính nếu giá trị Ct ≤ 35
3.2.5 Phương pháp cô đặc virus
Cô đặc virus bằng phương pháp siêu ly tâm được tóm tắt ở các bước dưới đây:
Để loại bỏ cặn tế bào, huyễn dịch virus sau khi được đông- tan 3 lần sẽ được ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4 độ C Sau đó, huyễn dịch thu được sẽ được lọc qua màng lọc 0,45 µm.
(ii) Tủa virus: ly tâm huyễn dịch virus thu được ở bước (i) ở tốc độ 35.000 vòng/ phút/ 6 giờ Sử dụng type 45 Ti rotor
Để hòa tan tủa virus, cần bổ sung 5ml môi trường DMEM có chứa penicillin và streptomycin với nồng độ cuối cùng là 100 U/ml và 100μg/ml vào tủa virus đã thu được, sau đó để qua đêm ở nhiệt độ 4 độ C.
3.2.6 Phương pháp tinh khiết virus
Tinh khiết virus bằng gradient đường (sucrose) được tóm tắt ở các bước dưới đây:
(i) Chuẩn bị dung dịch đường: pha dung dịch đường 10%, 50% trong dung dịch PBS1x, vô trùng Pha dung dịch đường 20%, 30%, 40%
(ii) Chuẩn bị gradient đường liên tục: chuyển lần lượt vào ống siêu ly tâm
(Cat 344059, Beckman) các dung dịch đường như sau: 2 ml 50%, 2 ml 40%, 2 ml 30%, 2 ml 20% và 2 ml 10% Để gradient qua đêm trên mặt phẳng
Siêu ly tâm tinh khiết virus là bước quan trọng trong quy trình xử lý mẫu, trong đó 2 ml huyễn dịch virus được chuyển vào ống siêu ly tâm đã chuẩn bị Quá trình ly tâm được thực hiện ở tốc độ 35.000 vòng/phút trong 12 giờ, sử dụng rotor swing bucket SW 41 để đạt được hiệu quả tối ưu.
(iv) Thu interphase: rọi đèn, thu 1ml interphase (dải có màu đục, chứa virus tinh khiết)
3.2.7 Phương pháp vô hoạt virus
Bất hoạt virus bằng Binary ethyleneimine (BEI) gồm các bước:
(i) Chuẩn bị dung dịch BEI 10%
- Thêm 2 gam 2-bromoethylamine hydrobromide vào 20 ml dung dịch NaOH 0,2 N vô trùng
- Ủ dung dịch trong bể ổn nhiệt ở 37 o C trong 2 giờ
- Bảo quản ở 4 o C, chỉ sử dụng trong vòng 1 tháng
- Thêm dung dịch BEI 10% (chuẩn bị ở bước (i)) vào huyễn dịch virus cần bất hoạt để thành nồng độ BEI cuối cùng là 0,2%
- Bất hoạt virus ở 37 o C/ 24 giờ, có khuấy nhẹ trong quá trình bất hoạt
(iii) Trung hòa BEI thừa
- Bổ sung vào huyễn dịch virus sau bất hoạt dung dịch sodium thiosulphate với nồng độ cuối cùng là 1%
- Khuấy nhẹ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ
3.2.8 Phương pháp kiểm tra vô trùng của vacxin PCV2
Theo phương pháp thường quy tại bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y và theo TCVN 8684-2011
3.2.9 Phương pháp gây miễn dịch cho bản động vật và lấy mẫu huyết thanh
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng PCV2 tinh chế qua siêu ly tâm và đã được bất hoạt để tạo miễn dịch cho lợn Virus sau khi tinh chế được điều chỉnh nồng độ protein 0,5 mg/ml và nhũ hóa với Freund’s Adjuvant (hoàn chỉnh) theo tỷ lệ 1:1 Kháng nguyên sau khi nhũ hóa được bảo quản ở 4 độ C và được cân bằng ở nhiệt độ phòng trước khi tiêm.
Trước khi tiến hành gây miễn dịch, lợn được kiểm tra để đảm bảo âm tính với PCV2 và không có kháng thể đặc hiệu Quá trình theo dõi lợn thí nghiệm bao gồm việc đánh số tai, nuôi thích nghi và theo dõi thân nhiệt Lợn thí nghiệm sẽ được tiêm 2 ml kháng nguyên đã nhũ hóa qua đường tiêm bắp, và mũi tiêm nhắc lại sẽ được thực hiện sau 14 ngày kể từ mũi tiêm đầu tiên.
Lợn sau gây miễn dịch đƣợc theo dõi thân nhiệt hàng ngày (vào thời điểm cố định) và những bất thường khác
Lợn thí nghiệm sau gây miễn dịch đƣợc lấy máu xét nghiệm tại thời điểm gây miễn dịch (D0), và cứ 7 ngày/ lần (D7, D14, D21, D28, D35, D42, D49, D56, v.v…)
Mẫu máu được lấy từ vịnh tĩnh mạch cổ với thể tích 1 ml mỗi con Sau khi lấy, mẫu máu được để đông tự nhiên ở 37 độ C trong 2 giờ, rồi bảo quản qua đêm ở 4 độ C Tiến hành ly tâm mẫu máu ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để thu được huyết thanh Nếu không tiến hành xét nghiệm trong ngày, huyết thanh sẽ được bảo quản ở -20 độ C.
Lợn thí nghiệm được mổ khám theo phương pháp thường quy của Bộ môn
Vi sinh vật - Truyền nhiễm, đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
- Quan sát những bất thường ngoài da, các lỗ tự nhiên; rạch 4 chân,
- Quan sát và ghi lại biến đổi của hạch dưới hàm, hạch bẹn nông,
- Khám cơ quan trong xoang miệng: hạch amidal, vùng hầu họng,
- Bộc lộ xoang ngực, kiểm tra xoang phế mạc, xoang bao tim,
- Khám cơ quan hô hấp: thanh quản, khí quản, phế quản, thực thể phổi, hạch phổi,
- Khám hệ tuần hoàn: mỡ vành tim, cơ tim, nội tâm mạc, van tim,
- Bộc lộ và kiểm tra xoang phúc mạc: dịch rỉ viêm, màng giả, v.v
- Khám gan, lách, thận, hạch màng treo ruột:
- Khám hệ tiêu hóa: dạ dày, ruột non, manh tràng, kết tràng, v.v
- Khám khớp xương: tình trạng bao khớp, dịch khớp,
- Bộc lộ não và khám não
3.2.11 Phương pháp phát hiện kháng thể kháng PCV2
Các bước thực hiện phản ứng blocking ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng PCV2 trong mẫu huyết thanh của động vật thí nghiệm:
Huyết thanh được pha loãng 1/100 trong dung dịch mẫu, với bước đầu tiên là pha loãng 1/10 trước khi chuyển vào đĩa phản ứng để đạt được độ pha loãng cuối cùng.
Pha loãng huyết thanh 1/10 bằng dung dịch sample diluent buffer trong đĩa
96 giếng: (i) chia 90 àl sample diluent buffer vào cỏc giếng, (ii) cho 10ul huyết thanh/ giếng, (iii) vỗ nhẹ đĩa (mixing) để trộn đều
Để thực hiện thí nghiệm với huyết thanh 1/100 trong đĩa phản ứng, đầu tiên cho 100 µl đối chứng âm vào mỗi giếng A1 và B1, sau đó cho 100 µl đối chứng dương vào giếng C1 và D1 Tiếp theo, chia 90 µl dung dịch pha loãng mẫu vào các giếng phản ứng, rồi thêm 10 µl huyết thanh đã pha loãng 1/10 vào mỗi giếng Cuối cùng, vỗ nhẹ đĩa để trộn đều và dán đĩa bằng tấm dán chuyên dụng.
(b) Ủ mẫu Ủ đĩa ở 37 o C/60 phút ( 5 phút), tránh ánh sáng
Rửa 4 lần, 200 àl/lần bằng dung dịch rửa (washing solution 1X)
(c) Cho kháng thể đặc hiệu gắn enzyme
Pha loãng conjugate (kháng thể đặc hiệu kháng PCV2 gắn enzyme)
Tính toán lƣợng conjugate cần dùng:
Lƣợng cần pha = (số giếng phản ứng + 4) x 100 àl
Pha conjugate 1/100 Ủ conjugate và mẫu
Cho 100 àl conjugate đó pha loóng vào toàn bộ giếng phản ứng Ủ 37 o C trong 60 phút ( 5 phút), tránh ánh sáng
Rửa 4 lần, 200 àl/lần bằng dung dịch rửa (washing solution 1X)
(d) Cho cơ chất/chất màu (Buffered peroxidase substrate)
Cho 100 àl cơ chất/ chất màu vào mỗi giếng của đĩa ELISA Để ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong vòng 20 phút
Thờm 50 àl dung dịch H 2 SO 4 2N để dừng phản ứng
Vỗ nhẹ đĩa để trộn đều Đĩa phản ứng sau khi dừng phản ứng cần đƣợc đo ngay giá trị OD
(f) Đo giá trị OD, tính toán kết quả
Giá trị OD được đo ở bước sóng 450 nm, với kết quả hợp lệ khi giá trị OD trung bình của đối chứng âm lớn hơn 0,800 và giá trị OD trung bình của đối chứng dương nhỏ hơn 0,600 Tính toán giá trị S/N (OD mẫu xét nghiệm/OD đối chứng âm) được thực hiện trên bảng tính Excel từ nhà sản xuất Nếu S/N nhỏ hơn hoặc bằng 0,4, mẫu được coi là dương tính huyết thanh học; ngược lại, nếu S/N lớn hơn 0,4, mẫu được coi là âm tính huyết thanh học.
3.2.12 Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Các bước làm tiêu bản vi được tuân theo các bước thường quy của bộ môn Giải phẫu – Tổ chức, Khoa Thú y, đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
- Tẩy formol: lấy miếng tổ chức đã ngâm formol rửa dưới vòi nước chảy trong vòng 24 giờ,
- Chuyển cồn: (i) ngâm 2-3 giờ trong cồn 70%, (ii) ngâm 2-3 giờ trong cồn 90%, (iii) ngâm 2-3 giờ trong cồn tuyệt đối,
- Ngâm xylen: (i) ngâm 2-3 giờ trong xylen 1, (ii) ngâm 2-3 giờ trong xylen 2,
- Cắt tiờu bản với độ dài lỏt cắt 2-5 àm,
3.2.13 Phương pháp xử lý số liệu
Kiểm định sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm được thực hiện thông qua phân tích phương sai một nhân tố (one-way ANOVA) tích hợp trong phần mềm MS Excel 2003 Bên cạnh đó, để so sánh sự sai khác giữa các yếu tố, phép thử χ² được sử dụng với phần mềm Minitab 14.0, và phép thử Fisher Exact Test được thực hiện qua phần mềm SAS 9.1.