Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Virus cúm A/H5N6 đã được phát hiện trong các mẫu dịch ngoáy hầu họng của gà và vịt, cũng như trong các mẫu môi trường như phân tươi, nước thải, nước uống và chất thải trên lông nhốt gia cầm Nghiên cứu được thực hiện tại 12 chợ buôn bán gia cầm sống ở ba tỉnh: Hải Phòng (bao gồm các chợ Lương Văn Can, Quán Toan, Đầm Triều và chợ Thị trấn Tiên Lãng), Lạng Sơn (các chợ Đồng Đăng, Thất Khê, Hội Hoan và Na Dương), và Quảng Ninh (các chợ Minh Thành, Rừng, Địa Chất và Cái Răm).
Nội dung nghiên cứu
Tình hình chăn nuôi gia cầm tại các tỉnh từ 2010 – 6 tháng đầu năm 2016
Kết quả tiêm vaccine cúm gia cầm tại các tỉnh từ 2010 – 6 tháng đầu năm
Tình hình dịch cúm gia cầm tại các tỉnh từ 2010 - 6 tháng đầu năm 2016 Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ
- Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu bệnh phẩm
- Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H5 trong các mẫu bệnh phẩm
- Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype N6 trong các mẫu bệnh phẩm
- Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 qua các vòng lấy mẫu
- Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ lấy mẫu.
Nguyên liệu
Mẫu dịch ngoáy hầu họng của gà, vịt và mẫu môi trường tại 12 chợ đã được lựa chọn
3.3.2 Dụng cụ, hóa chất lấy mẫu, thiết bị, hóa chất xét nghiệm
Bảo hộ lao động là yếu tố quan trọng trong môi trường làm việc, bao gồm các sản phẩm như tăm bông vô trùng, ống đựng mẫu, thùng bảo quản mẫu, nhãn dán mẫu, phiếu ghi thông tin, túi đựng mẫu, thuốc sát trùng và găng tay Những thiết bị này không chỉ đảm bảo an toàn cho người lao động mà còn hỗ trợ trong việc thu thập và bảo quản mẫu một cách hiệu quả.
3.3.2.2 Hóa chất, trang thiết bị xét nghiệm a Môi trường bảo quản mẫu: Môi trường PBS - Glycerol b Dụng cu, hóa chất cho xét nghiệm mẫu bệnh phẩm
- Máy Realtime PCR: Biorad IQ5, ABI 7500; máy spin, máy vortex, máy ly tâm lạnh Máy đọc kết quả RT-PCR Cerpheid, Biorad IQ5, ABI 7500
- Micropipet các cỡ, Multisepper và đầu típ phù hợp; ống eppendorf có thể tích khác nhau
- Bộ kít chiết tách TACO DNA/RNA EXTRACTION KIT
- Đối chứng dương tính (+), đối chứng âm tính (-) H5N6
- Nguyên liệu nhân gen: kít One-Step RT-PCR Qiagen® (Cat No.210210) hoặc Invitrogen One-step RT-PCR (Cat No.11732-020)
- Đoạn mồi (primers) và Đoạn dò (probe) để phát hiện virus:
Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi và đoạn dò để phát hiện virus H5N6
Kí hiệu mồi/probe Trình tự (5'-3')
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tích Áp dụng cho điểu tra tình hình chăn nuôi gia cầm, công tác tiêm phòng vaccine phòng cúm, tình hình dịch cúm gia cầm tại các tỉnh trong giai đoạn từ năm 2010 đến 6 tháng đầu năm 2016
3.4.2.1 Phương pháp lấy mẫu dịch ngoáy hầu họng
Sử dụng tăm bông vô trùng, lấy mẫu dịch hầu họng của gà và vịt bằng cách ngoáy nhẹ trên bề mặt niêm mạc Mỗi lần, thu thập 30 mẫu từ gà và 30 mẫu từ vịt, sau đó cho vào ống nghiệm chứa dung dịch bảo quản Gộp 05 mẫu đơn thành 01 mẫu xét nghiệm và bảo quản lạnh ở 4°C, vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 48 giờ sau khi lấy mẫu.
3.4.2.2 Phương pháp lấy mẫu môi trường
Sử dụng tăm bông vô trùng để lấy mẫu phân gia cầm, chất thải từ lồng nhốt gia cầm, mẫu nước thải tại khu vực buôn bán gia cầm, và mẫu nước uống cho gia cầm Sau đó, các mẫu này được cho vào ống nghiệm chứa dung dịch bảo quản Mỗi chợ sẽ tiến hành lấy một mẫu phân tươi.
Hai mẫu chất thải, hai mẫu nước thải và hai mẫu nước uống cho gia cầm cần được thu thập Sau đó, các mẫu này phải được bảo quản trong thùng lạnh ở nhiệt độ 4 độ C và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 48 giờ kể từ thời điểm lấy mẫu.
Trong quá trình lấy mẫu phải đảm bảo đúng kỹ thuật, tránh lây nhiễm chéo giữa các mẫu bệnh phẩm
3.4.3 Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6
Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H5N6 sử dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR được thực hiện theo quy trình TYV2-HDPP-VR-54 - TCCS 16:2016/TYV2-CĐ của Cơ quan Thú y vùng II.
Quy trình xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H5N6 bao gồm việc đọc kết quả với các điều kiện phản ứng được công nhận Mẫu đối chứng dương, đã được chuẩn độ trước, cần có giá trị Ct ≤ 25 (± 2 Ct), trong khi mẫu đối chứng âm tính không được có giá trị Ct.
Theo các tiêu chí đã nêu, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được xác định là dương tính, trong khi mẫu không có giá trị Ct được xem là âm tính Đối với mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40, chúng được phân loại là nghi ngờ.
Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập virus) để khẳng định
3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu dịch bệnh được tổng hợp và vẽ bản đồ bằng phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ ArcGIS 9.3
Kết quả xét nghiệm được xử lý qua MS Excel và phần mềm WinEpiscope 2.0, cho phép tính tỷ lệ dương tính (tỷ lệ nhiễm p) theo công thức, trong đó a là số mẫu dương tính và n là tổng số mẫu xét nghiệm Để ước tính tỷ lệ nhiễm trong quần thể (P) với độ tin cậy 95%, công thức cụ thể cũng được áp dụng.
P = p ± 1,96 x SE trong đó SE là sai số chuẩn được tính theo công thức: