NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Tụ cầu khuẩn Staphylococcus spp đã được phân lập từ đường hô hấp của gà nuôi tại huyện Gia Lâm, Hà Nội, cũng như ở một số tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Hải Dương.
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi đã thực hiện một số nội dung sau:
Phân lập và thuần khiết vi khuẩn;
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn;
Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học của vi khuẩn;
Nghiên cứu biến động của quá trình sản sinh màng sinh học theo thời gian;
Nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học.
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 4/2015 đến tháng 3/2016.
Nguyên liệu
- Thạch thường của hãng Merck
- Môi trường lỏng: tryptone water, tryptic soy broth, peptone water của hãng Merck
- Yeast extract của hãng Oxoid
- Giấy tẩm kháng sinh, kháng sinh bột
- Đĩa nhựa 96 giếng vô trùng (SPL Life Sciences)
- Hóa chất dùng trong định lượng màng sinh học: methanol, đệm PBS 1x, dung dịch 1% tím kết tinh (crystal violet), dung dịch cồn 80% có bổ sung 5% sodium dodecyl sulfate
- Máy đọc ELISA (Biotek, ELx808).
Phương pháp nghiên cứu
Dịch hầu họng được thu thập ngẫu nhiên từ đàn gà nuôi tại huyện Gia Lâm, Hà Nội và các tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hải Dương Việc lấy mẫu được thực hiện bằng tăm bông vô trùng từ dịch hầu họng và xoang mũi của gà Các mẫu tăm bông này được bảo quản trong đệm trypton và giữ ở nhiệt độ 4 độ C trong suốt quá trình vận chuyển.
3.6.2 Phương pháp phân lập, thuần khiết vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí được thuần khiết theo quy trình tiêu chuẩn của bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y Quy trình bao gồm việc cấy tăm bông thấm dịch swab lên đĩa thạch thường và ủ trong tủ ấm ở 37°C trong 24 giờ Sau đó, chọn lọc các khuẩn lạc có màu trắng hoặc vàng, dạng S, với kích thước lớn hoặc nhỏ để thuần khiết Cuối cùng, nhuộm Gram và lựa chọn mẫu có tụ cầu khuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.6.3 Phương pháp xác định khả năng sản sinh màng biofilm Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học được thực hiện trên đĩa 96 giếng (Stepanovic, 2007) Các bước được tóm tắt như sau:
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường lỏng
Chuyển 1 ml huyễn dịch vi khuẩn (pha trong TSB+Y) vào 9 ml dung dịch TSB+Y vô trùng và nuôi tĩnh ở 37 độ C trong 12 giờ Huyễn dịch vi khuẩn được tạo ra từ nước rửa mặt thạch chủng tụ cầu khuẩn thuần khiết.
Bước 2: Chuẩn bị huyễn dịch vi khuẩn 1/10
- Chuyển 1 ml vi khuẩn sau nuôi cấy 12 giờ trong môi trường TSB+Y vào ống nghiệm chứa 9 ml môi trường TSB+Y mới, vô trùng Trộn đều
- Chuyển 100 àl huyễn dịch vi khuẩn (1/10) vào mỗi giếng của đĩa nhựa vụ trựng 96 giếng (đó cú sẵn 100 àl mụi trường TSB+Y) Nuụi tĩnh ở
Bước 4: Rửa trôi vi khuẩn không bám vào thành/ đáy đĩa
- Loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn không nằm trong màng sinh học bằng cách rửa mỗi giếng bằng 200 àl PBS 1x; lặp lại 3 lần Thấm khụ giếng
Bước 5: Cố định màng sinh học
- Cố định vi khuẩn bỏm vào thành/ đỏy đĩa bằng 200 àl methanol;
- Giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 20 phút;
- Loại bỏ hoàn toàn methanol trong giếng bằng cách thấm khô
Bước 6: Nhuộm màng sinh học
- Bổ sung vào mỗi giếng 200 àl dung dịch tớm kết tinh 1%;
- Giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 phút;
- Loại bỏ hoàn toàn dung dịch tím kết tinh;
Để loại bỏ hoàn toàn thuốc nhuộm thừa không thấm vào lớp màng sinh học, cần rửa mỗi giếng bằng 200 µl PBS 1x Quá trình này nên được lặp lại ít nhất 3 lần cho đến khi không còn màu thuốc nhuộm sau khi thấm khô giếng.
Bước 7: Đo mật độ quang
- Hòa tan thuốc nhuộm tím kết tinh thấm vào màng sinh học bằng cách bổ sung vào mỗi giếng 200 àl dung dịch ethanol 95%;
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút;
- Đo giá trị OD ở bước sóng 595 nm
Bước 8: Phân tích kết quả đánh giá mức sản sinh màng sinh học theo phương pháp của Stepanovic (2000) được thực hiện bằng cách tính toán giá trị ODc = ODđc + 3SD, trong đó ODđc là giá trị OD trung bình của các mẫu đối chứng âm và SD là độ lệch chuẩn của giá trị OD của các mẫu đối chứng âm Mẫu dương tính, tức là mẫu có khả năng sản sinh màng sinh học, được xác định khi giá trị ODmẫu > ODc Mức tạo màng sinh học sẽ được đánh giá dựa trên kết quả này.
ODmẫu ≤ ODc : Không tạo màng sinh học
ODc < ODmẫu ≤ 2ODc : Tạo màng sinh học yếu
2ODc < ODmẫu ≤ 4ODc : Tạo màng sinh học trung bình 4ODc < ODmẫu : Tạo màng sinh học mạnh
3.6.4 Phương pháp nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian Để nghiên cứu biến động của sự sản sinh màng sinh học theo thời gian, chúng tôi nuôi vi khuẩn vào các giếng của đĩa 96 giếng Nuôi tĩnh ở 37 o C, loại bỏ dung dịch trong giếng, cố định lớp biofilm hình thành (nếu có) sau mỗi 4 giờ Các bước định lượng lớp biofilm tại mỗi thời điểm được thực hiện theo phương pháp trình bày ở mục 3.6.3 Các bước thực hiện được tóm tắt ở hình 3.1
Hình 3.1 Các bước nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian
3.6.5 Phương pháp xác định khả năng đề kháng kháng sinh
Khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành biofilm được tóm tắt qua các bước sau: đầu tiên, xác định loại kháng sinh mà vi khuẩn phân lập mẫn cảm; tiếp theo, xác định nồng độ kháng sinh nhỏ nhất (MIC) ức chế sự phát triển của vi khuẩn Sau đó, nuôi cấy vi khuẩn ở đĩa 96 giếng trong 20 giờ để hình thành biofilm, rồi loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn không nằm trong lớp biofilm Tiếp theo, thêm kháng sinh ở nồng độ cao hơn MIC và lưu giữ trong 12 giờ hoặc 24 giờ Cuối cùng, loại bỏ kháng sinh, bổ sung môi trường và tiếp tục nuôi cấy trong 24 giờ.
Nghiên cứu được thực hiện ở nhiệt độ 37 độ C, nhằm thu hồi vi khuẩn từ các giếng và đo giá trị OD 630 để xác định tỷ lệ số vi khuẩn ở các nồng độ kháng sinh khác nhau so với giếng đối chứng không bổ sung kháng sinh Các bước thực hiện được tóm tắt trong hình 3.2.
Hình 3.2 Tóm tắt các bước nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn
Hình 4.1 trình bày tóm tắt kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí trực tiếp từ mẫu swab trên môi trường thạch thường
Hình 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu swab
Chúng tôi đã phân lập nhiều loại vi khuẩn hiếu khí từ các mẫu swab, với các khuẩn lạc dạng S có kích thước khác nhau Để đạt được mục tiêu phân lập tụ cầu khuẩn, chúng tôi đã chọn những khuẩn lạc có màu vàng, bao gồm các sắc độ như vàng rơm, vàng chanh và không màu, nhằm thuần khiết hóa Hình 4.2 minh họa kết quả thuần khiết của vi khuẩn Staphylococcus spp.
Hình 4.2 Kết quả thuần khiết tụ cầu khuẩn từ mẫu swab
Các mẫu có màu vàng rơm, vàng chanh và không màu lần lượt được sắp xếp ở hàng trên cùng, hàng thứ hai và hàng dưới cùng
Sau 2 lần thuần khiết liên tiếp, chúng tôi đã thu được những thạch trong đó chỉ quan sát được một loại khuẩn lạc (giống nhau về dạng khuẩn lạc, màu sắc) Các loại khuẩn lạc thuần có màu phổ biến là vàng rơm, vàng chanh hoặc không màu (hình 4.2) Hình 4.3 là kết quả nhuộm Gram để khẳng định chắc chắn sự thuần khiết của khuẩn lạc
Hình 4.3 Hình thái của chủng tụ cầu khuẩn thuần khiết
Hình ảnh vi khuẩn ở độ phòng đại 1000 lần (ảnh nhỏ), vi khuẩn xếp cạnh nhau có dạng chùm nho (mũi tên, ảnh lớn)
Dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần, tụ cầu khuẩn hiện rõ hình thái đặc trưng, bắt màu Gram dương (màu tím xanh) và thường tập trung thành đám giống như chùm nho Quan sát trên các vi trường cho thấy chỉ có một loại vi khuẩn được phát hiện, xác nhận rằng các chủng tụ cầu khuẩn đã được thuần khiết thành công Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn được tổng hợp trong bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn Địa điểm lấy mẫu
Kết quả thuần khiết vi khuẩn Gram âm Gram dương Tụ cầu khuẩn
Trong 63 mẫu dịch hô hấp trên của gà, chúng tôi đã thuần khiết được 88 chủng vi khuẩn Gram dương Đặc biệt, 31 chủng tụ cầu khuẩn đã được thuần khiết để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu về hệ vi sinh vật đường hô hấp của gia cầm do Poorniya và Upadhey thực hiện đã phân lập được 64 loại vi khuẩn, trong đó nhóm vi khuẩn Gram dương chủ yếu là Staphylococcus epidemidis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium, Corynebacterium xerosis và Micrococcus spp.; còn nhóm Gram âm bao gồm Escherichia coli, Citrobacter freundii và Enterobacter aerogenes (Poornima và Upadhye, 1995) Một nghiên cứu khác của Byrum và Slemons cũng cho thấy sự đa dạng của hệ vi sinh vật đường hô hấp trên của gia cầm với các vi khuẩn Gram âm như Flavobacterium spp và Vibrio alginolyticus, cùng với các vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermis và Staphylococcus sciuri (Byrum và Slemons, 1995) Qua hai nghiên cứu này, tụ cầu khuẩn được xác định là loại vi khuẩn phổ biến nhất ở đường hô hấp gia cầm, với tỷ lệ phân lập tụ cầu khuẩn đạt 49,21% trong nghiên cứu của chúng tôi, tuy nhiên, do giới hạn của đề tài, chúng tôi chưa thể đi sâu vào việc định loài các chủng tụ cầu khuẩn đã phân lập.
Kết quả nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng môi trường dinh dưỡng dạng lỏng tryptic soy broth (TSB) với 0,05% yeast extract (Y) để khảo sát sự hình thành biofilm của các chủng tụ cầu khuẩn, kế thừa từ các nghiên cứu trước đó (Stepanovic, 2000; Stepanovic, 2007) Loại môi trường tăng sinh có ảnh hưởng lớn đến khả năng sản xuất màng sinh học của vi khuẩn Để đảm bảo độ chính xác, trước khi định lượng mức sản xuất màng sinh học, chúng tôi đã kiểm tra khả năng phát triển của 31 chủng tụ cầu khuẩn, với kết quả theo dõi sự sinh trưởng được trình bày trong hình 4.4.
(lag phase) Pha lũy thừa
(log phase) Pha cân bằng
Hình 4.4 Đường cong sinh trưởng của tụ cầu khuẩn ở môi trường TSB-Y
Ký hiệu đại diện cho giá trị OD trung bình tại từng thời điểm thu mẫu, trong khi đường giới hạn cận trên và cận dưới phản ánh độ lệch chuẩn của giá trị OD từ 31 mẫu.
Số lượng vi khuẩn trong môi trường TSB-Y tăng dần theo thời gian, với giá trị OD630 tại thời điểm sau lớn hơn trước Đường cong sinh trưởng của 31 chủng tụ cầu khuẩn được chia thành 3 giai đoạn rõ rệt: (i) pha tiềm phát (3 giờ đầu), (ii) pha lũy thừa (từ 3 - 9 giờ) với mức tăng cao nhất 2,5 lần so với thời điểm 0 giờ, và (iii) pha cân bằng (từ 15 - 30 giờ) Nghiên cứu dừng lại ở 30 giờ, do đó không quan sát được pha suy vong Kết quả cho thấy TSB-Y là môi trường phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả định lượng khả năng sản sinh màng sinh học
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học của 31 chủng tụ cầu khuẩn và thu được kết quả định lượng khả năng sản sinh biofilm được trình bày chi tiết ở hình 4.5.
Hình 4.5 Kết quả kiểm tra khả năng tạo màng sinh học
Mỗi chủng tụ cầu được nuôi trên bốn giếng, với các giếng đối chứng âm được đánh dấu Các mẫu được phân loại theo khả năng sinh biofilm thành bốn nhóm: mạnh (M), trung bình (TB), yếu (Y) và không sản sinh biofilm (-).
Trong nghiên cứu, 8 giếng đối chứng âm chỉ sử dụng môi trường TSB-Y mà không có vi khuẩn không cho thấy hiện tượng giữ màu của thuốc nhuộm Ngược lại, các mẫu nuôi vi khuẩn cho thấy sự giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh với các mức độ khác nhau Một số mẫu có màu sắc tương tự như đối chứng âm và được đánh giá là âm tính, không hình thành biofilm Trong khi đó, các mẫu ký hiệu Y, TB và M thể hiện hiện tượng giữ màu thuốc nhuộm và được đánh giá dương tính với các mức độ khác nhau Hình ảnh minh họa lớp biofilm hình thành được trình bày trong hình 4.6.
Hình 4.6 Màng sinh học nhuộm bằng tím kết tinh 1% (200X)
Sự hình thành biofilm được đánh giá ở mức mạnh (A), trung bình (B) và yếu (C) so với đối chứng (D) không hình thành biofilm
Hình 4.6 cho thấy giếng đối chứng âm không có sự phát triển của vi khuẩn và không giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh Ngược lại, ở các giếng nuôi cấy vi khuẩn, sự hình thành biofilm được quan sát với mức độ mạnh, trung bình và yếu, kèm theo hiện tượng giữ màu thuốc nhuộm trong lớp biofilm Giếng có biofilm mạnh cho thấy lớp vi khuẩn bám chặt trên bề mặt, trong khi giếng có biofilm yếu có ít lớp vi khuẩn hơn Để xác định mức độ hình thành biofilm, mật độ quang của thuốc nhuộm được đo và so sánh với các giá trị ODc, 2ODc, 4ODc của đối chứng âm.
(+ ) M ạn h (+ ) T ru ng b ìn h (+ ) Y ếu  m tín h
Hình 4.7 Mức tạo màng sinh học của tụ cầu khuẩn
Kết quả tính giá trị ngưỡng của đối chứng âm cho giá trị ODc = 0,350 cho thấy có 16/31 mẫu (chiếm 51,61%) có khả năng hình thành màng sinh học ở 3 mức độ: mạnh, trung bình và yếu, trong khi 15/31 mẫu không sản sinh màng sinh học Tụ cầu khuẩn, loại vi khuẩn phổ biến trong môi trường và trên cơ thể động vật, có khả năng sản xuất biofilm với tỷ lệ từ 37,5% đến 57% theo các nghiên cứu toàn cầu (Mirani, 2013; Oliveira, 2006) Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sản sinh màng sinh học là đặc trưng phổ biến của các chủng tụ cầu khuẩn.
Dựa trên kết quả nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học, chúng tôi đã lựa chọn 7 chủng vi khuẩn với khả năng sản sinh biofilm khác nhau để khảo sát đặc điểm của quá trình hình thành màng sinh học theo thời gian Hình 4.8 thể hiện kết quả phân tích sự biến động của lớp biofilm hình thành trong khoảng thời gian từ 4 giờ đến 40 giờ.
Hình 4.8 Biến động về lượng biofilm sản sinh theo thời gian
Chiều cao của các cột tại mỗi thời điểm tương ứng với giá trị OD 595, với mẫu hình thành biofilm được biểu thị bằng màu hồng và mẫu không hình thành biofilm bằng màu xanh Đối với mẫu M12, không có sự hình thành lớp biofilm, với giá trị OD luôn thấp hơn ngưỡng ODc và không có biến động trong suốt thời gian theo dõi Trong khi đó, mẫu M49.1 và M24.2 sản sinh biofilm ở mức yếu, cho thấy giá trị OD giữ lại trong giếng ít biến động Ngược lại, các mẫu M47.1, M54.3 và M49.2, với mức hình thành biofilm trung bình và mạnh, cho thấy giá trị OD tăng dần từ 4 giờ đến 20 giờ, sau đó giảm từ 24 giờ đến 40 giờ Sự biến động của lượng biofilm theo thời gian được minh họa qua màu thuốc nhuộm tím gentian giữ lại trong giếng.
Hình 4.9 Biến động màu thuốc nhuộm giữ lại bởi lớp biofilm
Hình 4.9 trình bày sự phát triển của biofilm qua thời gian ở các chủng vi khuẩn với mức độ sản sinh khác nhau Các mẫu ở giếng đối chứng (Đ.c) và M12 không giữ màu thuốc nhuộm trong suốt thời gian lấy mẫu từ 4 đến 40 giờ Trong khi đó, mẫu M49.2, với khả năng hình thành biofilm mạnh, cho thấy sự gia tăng rõ rệt về màu tím gentian từ 4 giờ đến 20 giờ, sau đó giảm dần từ 24 giờ đến 40 giờ.
Kết quả từ hình 4.8 và 4.9 cho thấy sự hình thành biofilm là một quá trình động, phụ thuộc vào thời gian Lượng biofilm sản sinh không luôn tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy tĩnh vi khuẩn, với lượng biofilm đạt cực đại rồi giảm xuống Nguyên nhân là do (i) sự giảm dần các chất dinh dưỡng trong giếng nuôi vi khuẩn theo thời gian và (ii) hiện tượng phá vỡ một phần cấu trúc biofilm để giải phóng vi khuẩn.
Nghiên cứu năm 2006 của Holá cho thấy rằng nhiệt độ, thời gian và chất dinh dưỡng có ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành biofilm Cụ thể, ở nhiệt độ 25 độ C, vi khuẩn Staphylococcus epidermidis hình thành màng sinh học rất chậm, trong khi ở 37 độ C, quá trình này diễn ra nhanh chóng, chỉ sau 2-4 giờ nuôi cấy Màng sinh học này đạt độ hoàn chỉnh sau 12-14 giờ, nhưng sẽ giảm dần nếu tiếp tục nuôi cấy sau 34 giờ.
42 giờ Như vậy, kết quả của chúng tôi là tương đồng khi cũng chỉ ra sự biến động của lớp biofilm được hình thành theo thời gian
Nghiên cứu về sự biến động của biofilm theo thời gian cho thấy sự cần thiết phải hiểu rõ đặc điểm hình thành biofilm của các chủng tụ cầu khuẩn Điều này rất quan trọng trước khi tiến hành các nghiên cứu như định lượng biofilm hay thử nghiệm khả năng đề kháng kháng sinh của lớp biofilm, vì lớp biofilm có khả năng hình thành mạnh mẽ.
Nghiên cứu về sự sản sinh biofilm cho thấy rằng vi khuẩn có thể yếu ở các thời điểm khác nhau Nhận xét này phù hợp với khuyến cáo trước đây về thời gian nuôi vi khuẩn, như được chỉ ra bởi Stepanovic (2007).
4.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC Để nghiên cứu ảnh hưởng của biofilm tới khả năng đề kháng kháng sinh, trước hết cần phải tìm được loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm Tham khảo cơ sở dữ liệu của EUCAST về các loại kháng sinh mà tụ cầu khuẩn mẫn cảm (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, 2017), chúng tôi đã tiến hành thử tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh Kết quả được trình bày tóm tắt ở hình 4.10
Hình 4.10 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh
Trong nghiên cứu, 31 chủng tụ cầu khuẩn đã được thử nghiệm tính mẫn cảm với 8 loại kháng sinh: Neomicin (Ne), Doxycycline (Dx), Penicillin (Pn), Tetracycline (Te), Kanamycin (Kn), Gentamicin (Ge), Norfloxacin (Nr) và Trimethprime/sulfamethoxazol (Bt) Trục Ox thể hiện đường kính vòng vô khuẩn (mm), trong khi trục Oy biểu thị số lượng chủng thử kháng sinh đồ Đường nét đứt màu đỏ cho biết mức độ kháng của từng loại kháng sinh.
(phía bên trái) và mẫn cảm (phía bên phải)
Kết quả nghiên cứu cho thấy 31/31 chủng tụ cầu khuẩn đều kháng penicillin với đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn 26 mm, phù hợp với tiêu chuẩn EUCAST, do các chủng này sản sinh enzyme penicillinase Ngoài ra, tất cả các chủng này cũng kháng tetracycline Đối với 6 loại kháng sinh còn lại, mức độ mẫn cảm và kháng của các chủng tụ cầu khuẩn có sự khác biệt Tuy nhiên, đáng chú ý là đa số các chủng tụ cầu khuẩn (22/31 chủng) cho thấy tính mẫn cảm với norfloxacin.
Kết quả nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học
Để nghiên cứu ảnh hưởng của biofilm đến khả năng đề kháng kháng sinh, trước tiên cần xác định loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm Dựa vào cơ sở dữ liệu của EUCAST về các loại kháng sinh mà tụ cầu khuẩn mẫn cảm (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, 2017), chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh, và kết quả được trình bày tóm tắt trong hình 4.10.
Hình 4.10 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh
Trong nghiên cứu, 31 chủng tụ cầu khuẩn đã được thử nghiệm tính mẫn cảm với 8 loại kháng sinh, bao gồm Neomicin (Ne), Doxycycline (Dx), Penicillin (Pn), Tetracycline (Te), Kanamycin (Kn), Gentamicin (Ge), Norfloxacin (Nr) và Trimethoprim/sulfamethoxazol (Bt) Trục Ox biểu thị đường kính vòng vô khuẩn (mm), trong khi trục Oy thể hiện số lượng chủng thử kháng sinh đồ Đường nét đứt màu đỏ trên biểu đồ đánh dấu mức độ kháng của từng loại kháng sinh.
(phía bên trái) và mẫn cảm (phía bên phải)
Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả 31/31 chủng tụ cầu khuẩn đều kháng penicillin với đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn 26 mm, phù hợp với tiêu chuẩn của EUCAST, do các chủng này sản sinh enzyme penicillinase Ngoài ra, tất cả các chủng này cũng kháng tetracycline Đối với 6 loại kháng sinh còn lại, mức độ mẫn cảm và kháng của các chủng tụ cầu khuẩn khác nhau Tuy nhiên, tổng hợp kết quả cho thấy đa số các chủng (22/31) mẫn cảm với norfloxacin.
Chúng tôi đã chọn norfloxacin để chứng minh khả năng đề kháng kháng sinh, sử dụng nồng độ cao gấp 10 lần và 100 lần nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) để tác động lên vi khuẩn trong lớp màng sinh học trong vòng 12 giờ Sau đó, môi trường TSB-Y được bổ sung để tiếp tục nuôi vi khuẩn trong 24 giờ Kết quả xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trong màng sinh học sau khi chịu tác động của kháng sinh được trình bày trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả xác định khả năng đề kháng kháng sinh
Nồng độ kháng sinh gấp x lần MIC Đối chứng môi trường
Các mẫu đối chứng không chứa vi khuẩn cho thấy môi trường nuôi không bị vẩn đục, với giá trị OD630 từ 0,032 đến 0,044 Ngược lại, các mẫu nuôi vi khuẩn trong lớp biofilm sau khi tiếp xúc với kháng sinh xuất hiện hiện tượng vẩn đục, với giá trị OD630 tăng tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng sinh Cụ thể, ở nồng độ kháng sinh 100x, 10x và 1x, mật độ vi khuẩn giảm lần lượt khoảng 7,4 lần, 6,2 lần và 3,4 lần so với mật độ vi khuẩn ở giếng không có kháng sinh Kết quả cho thấy vi khuẩn vẫn sống sót trong lớp màng sinh học sau khi tiếp xúc với kháng sinh, chứng tỏ rằng vi khuẩn trong màng sinh học có khả năng kháng lại nồng độ kháng sinh cao gấp 10 lần và 100 lần nồng độ MIC.
Trong nghiên cứu của Urish về khả năng đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus, đã chỉ ra rằng kháng sinh cefazolin, ngay cả ở nồng độ cao gấp 2, 20 và 200 lần, chỉ làm giảm lượng biofilm mà không loại bỏ hoàn toàn được lớp biofilm Tỷ lệ vi khuẩn sống sót trong biofilm dao động từ 2,0% đến 57,9% sau khi tiếp xúc với ba loại kháng sinh: cefazolin, gentamicin và vancomycin ở nồng độ gấp 10 lần nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy khả năng đề kháng kháng sinh cao của vi khuẩn sản sinh biofilm, phù hợp với những phát hiện trước đó.
Nghiên cứu cho thấy các chủng tụ cầu khuẩn có khả năng sản sinh biofilm với mức độ khác nhau, và lớp biofilm này giúp vi khuẩn kháng lại nồng độ kháng sinh cao gấp 100 lần nồng độ MIC Tuy nhiên, do giới hạn của đề tài, chúng tôi chưa thể khảo sát giới hạn kháng thuốc của vi khuẩn trong lớp biofilm với nồng độ kháng sinh lớn nhất.
