Vật liệu và phương pháp
Môi trường nuôi cấy và chủng vi sinh vật
3.1 LỰA CHỌN THIẾT KẾ TỐI ƯU CHO HỆ THỐNG BES VÀ ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Thiết kế hệ thống BES
Hệ thống BES được nghiên cứu dựa trên tài liệu tham khảo, với mục tiêu thiết kế hiệu quả cao nhưng chi phí hợp lý Hệ thống này được tối ưu hóa để ưu tiên dòng điện thấp, và chúng tôi giả định rằng cường độ dòng điện có ảnh hưởng đến kích thước hạt.
Thí nghiệm gồm 5 hệ thống BES được tiến hành trong điều kiện anot yếm khí và các điều kiện catot khác nhau:
(1) Hệ thống BES1có catot kị khí
(2) Hệ thống BES2 có catot hiếu khí và khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút
(3) Hệ thống BES3 có catot kị khí, được với nối thêm pin AA 1.5 V thông qua một điện cực than chì phụ
(4) Hệ thống BES4 có catot hiếu khí
(5) Hệ thống BES5 có catot hiếu khí được nối thêm pin AA 1.5 V tương tự hệ thống BES3
(6) Hệ thống BESĐC: Hệ thống BES đối chứng, được đặt giống hệ thống BES1 với khoang anot không bổ sung vi khuẩn
3.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ CHỦNG VI SINH VẬT
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn chủng vi khuẩn Shewanella sp HN-41 để phát triển các hệ thống BES Chủng vi khuẩn này được phân lập từ đá phiến dầu kỷ Phấn trắng tại các bãi triều ở Haenam, Hàn Quốc, và nổi bật với hoạt tính khử sắt cao, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong các nghiên cứu sinh học và công nghệ môi trường.
Shewanella oneidensis MR-1 và Shewanella saccharophilus GC-29 là hai chủng vi khuẩn quan trọng được nghiên cứu bởi Ji-Hoon Lee và cộng sự vào năm 2007 Các chủng vi khuẩn này hiện đang được bảo quản và lưu trữ tại phòng Vi sinh vật Môi trường thuộc Viện Công nghệ Môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.
Trước khi tiến hành bổ sung vi khuẩn vào các hệ thống BES, vi khuẩn
Shewanella sp HN-41 được nuôi cấy ở điều kiện yếm khí, 30 o C, trên môi trường Luria – Bertani (LB) Agar trong vòng 24h để thu sinh khối tế bào
3.2.2 Môi trường trong khoang Anot
Môi trường trong khoang điện cực âm được thiết lập là môi trường khoáng kị khí, với sự bổ sung sodium lactate 10 mM (Ji-Hoon Lee et al., 2007b) Các dung dịch khoáng gốc và dung dịch khoáng vi lượng được chuẩn bị theo nồng độ đã nêu trong bảng 3.1 và bảng 3.2.
Bảng 3.1 Các dung dịch khoáng gốc dùng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn trong khoang Anot
Thành phần khoáng Nồng độ (g/L)
Bảng 3.2 Thành phần dung dịch khoáng vi lượng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn trong khoang Anot
Hợp chất Nồng độ (mg/L)
Pha chế môi trường khoáng trong khoang anot theo tỷ lệ trong bảng 3.3, sau đó thêm nước cất đến thể tích yêu cầu và điều chỉnh pH về 7,6 bằng dung dịch KOH Tiến hành đun sôi và sục khí nitơ để loại bỏ oxy Sau khi khử trùng, môi trường khoáng sẽ được chia đều vào các khoang anot với thể tích 100 ml, và tiếp tục sục khí nitơ trong 3 phút cho mỗi khoang anot.
Bảng 3.3: Thành phần môi trường lỏng dùng cho khoang Anot
Dung dịch, hợp chất Hàm lượng/môi trường lỏng
Dung dịch khoáng vi lượng (bảng
3.2.3 Môi trường trong khoang Catot
Dung dịch điện cực dương bao gồm 1 mM Cadimi clorua (CdCl2) và 5 mM Natri thiosulfate (Na2S2O3) được pha trong nước cất Tổng thể 100 ml dung dịch này được chia đều vào các khoang catot trong thí nghiệm Đối với hệ thống điện cực dương kị khí, dung dịch catot sẽ được sục khí nitơ để loại bỏ oxy trong khoảng 3 phút.
Tiến hành thí nghiệm và phân tích
Thí nghiệm được tiến hành lấy mẫu như sau: Đối với các hệ thống BES1, BES2 và BES3
Tại điện cực âm (Anot): lấy mẫu theo ngày 0, 2, 4, và 6, mỗi lần 2 ml để đo hàm lượng lactate, OD tại bước sóng 600 nm và pH môi trường
Tại điện cực dương (Catot): lấy mẫu theo ngày 0, 2, 4, và 6 để phân tích hàm lượng ion Cd (II) trong dung dịch
Hệ thống BES4 và BES5
Các hệ BES4 và BES5 được chuẩn bị và theo dõi tương tự như hệ BES1, tuy nhiên, điện cực dương hoạt động trong điều kiện hiếu khí để đảm bảo khí.
Việc thu mẫu H2S ở điện cực âm được thực hiện tại thời điểm 0, 7 và 14 ngày để đo OD và pH, trong khi mẫu dung dịch điện cực dương của hai hệ BES được lấy vào các ngày 0, 7, 14 và 21 để xác định nồng độ Cd Vào ngày 21 của thí nghiệm, mẫu kết tủa được thu thập để phân tích hình thái và cấu trúc vật liệu thông qua các phương pháp như hiển vi điện tử quét (SEM), hiển vi điện tử truyền qua (TEM), phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX), phổ nhiễu xạ tia X (XRD) và phổ hấp thụ tử ngoại (UV-Vis) Kết quả cũng cho thấy hàm lượng lactate tại điện cực âm giảm đáng kể.
Sau 5 đến 6 ngày thí nghiệm, mẫu đã được phân tủy hoàn toàn Do đó, lactate được bổ sung để đạt hàm lượng 10 mM trong khoang điện cực âm, và việc phân tích hàm lượng lactate đã được dừng lại.
Phân tích mẫu
3.4.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào, pH môi trường và nồng độ lactat còn lại trong môi trường nuôi cấy
Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trong khoang điện cực âm được xác định qua mật độ quang tế bào (OD) ở bước sóng 600 nm bằng máy quang phổ UV-vis 2450 (Shizuma, Nhật Bản) pH của môi trường nuôi cấy được kiểm tra bằng máy đo pH HQ40d (Hach, Mỹ) Hàm lượng lactat còn lại trong khoang cực âm được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC, Agilent Infinity 1260, Mỹ) với đầu dò SPD-10A UV (Shizuma, Tokyo, Nhật Bản) và cột Shodex RSpack KC-811 (8.0 mm ID × 300 nm) (Shodex, Tokyo, Nhật Bản) Pha động sử dụng là 5 mM H2SO4 với tốc độ 0.5 ml/phút, và phổ UV được phát hiện ở bước sóng 210 nm Trước khi phân tích, mẫu được ly tâm ở 12000 rpm để loại bỏ sinh khối tế bào, sau đó chuẩn bị 0.5 ml mẫu cho vào ống chứa mẫu để tiến hành phân tích.
3.4.2 Phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) xác định nồng độ ion Cd trong mẫu
Nguyên tắc: Mẫu phân tích được chuyển thành trạng thái hơi tự do Chiếu
Khi một chùm tia sáng với bước sóng xác định chiếu vào đám mây nguyên tử tự do, các nguyên tử này sẽ hấp thụ năng lượng từ tia sáng và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử đặc trưng Việc đo phổ hấp thụ này cho phép xác định nguyên tố cần phân tích (Phạm Luận và cs., 1990; Trần Tứ Hiếu và cs., 2003) Để thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố, cần tiến hành các bước cụ thể.
Chọn lựa các điều kiện và loại trang bị phù hợp là bước quan trọng để chuyển đổi mẫu phân tích ban đầu, có thể ở dạng rắn hoặc dung dịch, thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do.
Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích vào đám hơi nguyên tử tự do sẽ khiến các nguyên tử hấp thụ những tia bức xạ nhất định, tạo ra phổ hấp thụ đặc trưng Trong một giới hạn nồng độ nhất định, cường độ hấp thụ này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của nguyên tố cần phân tích, theo một phương trình cụ thể.
Trong đó: A : Cường độ vạch phổ hấp thụ
K: hằng số thực nghiệm l: chiều dài chùm sáng đi qua
C: nồng độ nguyên tố cần phân tích
Bằng cách sử dụng hệ thống máy quang phổ, người ta có thể thu thập toàn bộ chùm sáng và phân tích để chọn ra vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần nghiên cứu Cường độ của vạch phổ hấp thụ này chính là tín hiệu hấp thụ của nguyên tử, cho phép đo lường chính xác các đặc tính của nguyên tố.
Để chuẩn bị mẫu phân tích, 1 ml mẫu thu được từ khoang điện cực dương tại các thời điểm khác nhau được ly tâm ở tốc độ 12000 rpm Sau đó, thu dịch nổi để xác định nồng độ ion trong mẫu Nồng độ Cd 2+ trong dung dịch ở điện cực dương được xác định bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng máy AAS (PinAAcle 900T, Perkin Elmer).
3.4.3 Phương pháp nghiên cứu cấu trúc, hình thái học và tính chất của vật liệu
Sau khi hoàn thành thí nghiệm vào ngày thứ 21, toàn bộ mẫu trong khoang catot đã được rửa ba lần bằng nước cất đề ion thông qua quá trình ly tâm ở tốc độ 12000 rpm trong 10 phút, sử dụng máy K-5418R của Effendorf, Hamburg, Đức Mục đích là để chuẩn bị cho các phân tích nhằm đặc trưng hóa vật liệu, bao gồm phân tích hình thái và cấu trúc hạt bằng kính hiển vi điện tử quét và truyền qua, phân tích thành phần cấu trúc hạt qua phổ tán sắc năng lượng, phân tích dạng tinh thể dựa trên phổ nhiễu xạ tia X, và cuối cùng là phân tích hấp thụ tử ngoại - khả kiến để xác định các tính chất vật lý của hạt nghiên cứu.
3.4.3.1 Kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope) được dùng để khảo sát hình thái bề mặt và cấu trúc lớp mỏng dưới bề mặt
Nguyên lý của phương pháp quét điện tử là sử dụng một chùm điện tử hẹp để quét bề mặt mẫu vật nghiên cứu, từ đó phát ra các bức xạ thứ cấp như điện tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngược, điện tử Auger và tia X Việc tạo ảnh mẫu vật dựa vào việc ghi nhận và phân tích các bức xạ này Chùm điện tử bị tán xạ mạnh khi đi vào các trường thế biến thiên do đám mây điện tử mang điện tích âm và hạt nhân mang điện tích dương, với mỗi nguyên tử trở thành tâm tán xạ cho chùm điện tử Nhiễu xạ chùm điện tử có đặc điểm phù hợp cho việc nghiên cứu cấu trúc màng mỏng, và phương pháp SEM có ưu điểm là xử lý đơn giản mà không cần phá hủy mẫu.
Chuẩn bị mẫu chụp ảnh SEM bao gồm việc nhỏ mẫu vật lên các tấm silicon wafer và để khô, nhằm phục vụ cho phân tích dưới kính hiển vi điện tử quét Hitachi S4800 của Nhật Bản.
3.4.3.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope - TEM) là thiết bị quan trọng trong nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, hoạt động bằng cách chiếu chùm electron năng lượng cao xuyên qua mẫu vật rắn mỏng Thiết bị này sử dụng các thấu từ để tạo ra hình ảnh với độ phóng đại cực lớn, có thể đạt đến hàng triệu lần, và hình ảnh được hiển thị trên màn huỳnh quang, phim quang học hoặc thiết bị kỹ thuật số.
Nguyên lý của ảnh TEM dựa vào các cơ chế quang học, nhưng tính chất ảnh lại phụ thuộc vào từng chế độ ghi ảnh Điểm khác biệt chính giữa ảnh TEM và ảnh quang học là độ tương phản Trong khi độ tương phản của ảnh trong kính hiển vi quang học chủ yếu do hiệu ứng hấp thụ ánh sáng, thì ở ảnh TEM, độ tương phản chủ yếu xuất phát từ khả năng tán xạ điện tử Các chế độ tương phản trong TEM đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích hình ảnh.
Tương phản biên độ là hiệu ứng hấp thụ điện tử của mẫu vật, chịu ảnh hưởng bởi độ dày và thành phần hóa học Kiểu tương phản này bao gồm tương phản độ dày và tương phản nguyên tử khối, đặc biệt trong phương pháp STEM.
Tương phản pha xuất phát từ sự tán xạ của các điện tử ở các góc khác nhau, đóng vai trò quan trọng trong các hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao (HRTEM) và các Lorentz TEM được sử dụng để chụp ảnh cấu trúc từ.
Để chuẩn bị mẫu chụp ảnh TEM, nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên lưới đồng đã được phủ màng cácbon, sau đó để khô trong không khí trước khi quan sát dưới kính hiển vi TEM (JEOL JEM-1010, Nhật Bản).
3.4.3.3 Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng kỹ thuật đo phổ tán sắc năng lượng (EDS) hoặc phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) để xác định thành phần nguyên tử của các nguyên tố có trong vật liệu nano.