Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Huyện Ba Vì - Hà Nội
Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH – Thú Y cụm 2 – Khoa Thú Y – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Đối tượng nghiên cứu
Gà thả vườn Ba Vì ở các nhóm tuổi khác nhau nghi nhiễm ORT nuôi tại các hộ, trang trại chăn nuôi ở huyện Ba Vì – Hà Nội.
Thời gian nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Một số đặc điểm bệnh lý của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT
- Chẩn đoán vi khuẩn ORT bằng kỹ thuật PCR
- Các triệu chứng lâm sàng của đàn gà mắc bệnh do ORT
- Những biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc bệnh do ORT
Đặc điểm dịch tễ của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT được xác định qua việc điều tra tình hình mắc bệnh theo lứa tuổi, mùa vụ và thói quen chăn nuôi truyền thống Việc phân tích này giúp hiểu rõ hơn về sự lây lan và ảnh hưởng của bệnh ORT trong đàn gà.
Biện pháp phòng và trị bệnh
- Phân lập vi khuẩn ORT từ gà mắc bệnh
- Xác định tính mẫn cảm của chủng ORT phân lập được với kháng sinh và thử nghiệm điều trị
- Xây dựng biện pháp phòng và trị bệnh.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Chúng tôi đã tiến hành theo dõi và lấy mẫu gà từ các đàn nghi nhiễm ORT tại các hộ chăn nuôi gà ở Ba Vì, Hà Nội Trong quá trình này, chúng tôi ghi chép các triệu chứng lâm sàng của những con gà còn sống, bao gồm các dấu hiệu như ủ rũ, khó thở, hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm và đau mắt.
Chúng tôi thực hiện mổ khám đối với những con gà có triệu chứng rõ ràng để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan, tuân thủ quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y.
Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…)
Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại kí sinh trùng và các tổn thương…
Mổ khám kiểm tra nội tạng bên trong
Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm
Xử lý tiêu độc xác gia cầm
3.5.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành
Để mẫu cơ quan tổ chức đạt yêu cầu, cần đảm bảo lấy đúng cơ quan và vùng tổn thương điển hình, đồng thời thu thập đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và lượng mẫu cần thiết.
Mẫu bệnh phẩm có thể bao gồm dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi Để lấy mẫu, sử dụng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào lỗ mũi hoặc hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70 độ, sau đó cho tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển như Stuart Transport Medium hoặc dung dịch PBS, ghi nhãn và đưa về phòng thí nghiệm trong thời gian 2-8 giờ Nếu khoảng cách đến phòng thí nghiệm xa, cần bảo quản mẫu trong tủ lạnh Sau khi vận chuyển, mẫu bệnh phẩm cần được cấy vào môi trường phân lập thích hợp Đối với dịch khí quản hay phế quản, sử dụng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hoặc phế quản, rồi dùng tăm bông vô trùng để lấy dịch và thực hiện các bước tương tự như trên.
Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm
Với mẫu là tổ chức phổi bệnh: chỉ lấy mẫu đối với phổi có bệnh tích quan sát được bằng mắt thường, cách lấy như trên
3.5.4 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu để thu được vi khuẩn ở dạng thuần khiết, được tạo ra từ một tế bào duy nhất Đây là một bước quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật, giúp xác định các đặc điểm sinh vật và hóa học gây bệnh của vi khuẩn thông qua các phương pháp phân lập.
Sau khi lấy mẫu, chúng được xử lý và nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia có bổ sung 5 µg/ml Gentamycin ở nhiệt độ 37°C với 5-10% CO2 trong 48 giờ Dựa vào đặc điểm phát triển trên các môi trường, chúng tôi chọn lựa các khuẩn lạc riêng biệt.
Khuẩn lạc ORT được nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia có 5% Gentamycin ở 37°C tạo thành những khuẩn lạc nhỏ, không có hiện tượng dung huyết xung quanh, có màu xám đến xám trắng, bề mặt lồi và bờ rìa rõ ràng Khuẩn lạc này không phát triển trên môi trường Macconkey.
Trong quá trình nhuộm Gram, sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm là yếu tố quyết định Vi khuẩn Gram dương giữ lại phức hợp tím gentians mà không bị tẩy màu bởi ancolhol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này Kết quả là vi khuẩn Gram dương vẫn có màu tím gentians, còn vi khuẩn Gram âm chuyển sang màu hồng của fucshin.
Bước 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản:
Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy
Để cố định tiêu bản vi khuẩn, cho 1 – 3 khuẩn lạc từ đĩa thạch vào giọt nước và để khô tự nhiên Sau đó, hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần giúp vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính và cải thiện khả năng bắt màu.
Nhỏ dung dịch tím Gentians để yên trong vòng 1 phút, rửa nước
Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước
Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, để khô
Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khô Quan sát hình thái vi khuẩn được nhuộm ở vật kính dầu với độ phóng đại 100
PCR là phương pháp được áp dụng để xác định sự hiện diện của ORT trong mẫu dịch khí quản từ gà bệnh Thành phần chính của PCR bao gồm đoạn DNA mục tiêu, các mồi tương ứng với DNA mục tiêu, hỗn hợp bốn loại base và một DNA polymerase thích hợp.
3.5.6.1 Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20àl Proteinase K vào ống Eppendorf Thờm 180 àl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56 o C trong 3 giờ
Bước 2: Thờm 4àl ARNase và 200 àl Buffer AL Ủ ở 70 o C trong 30 phỳt Bước 3: Thờm 200 àl Ethanol (96 - 100%), trộn đều
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong
1 phút Loại bỏ dịch ở dưới
Bước 5: Thờm 500àl Buffer AW1, rồi ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phút, bỏ dịch dưới
Bước 6: Thờm 500àl Buffer AW2, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 2 phỳt, bỏ dịch dưới Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên
Chuyển cột lọc chứa ADN vi khuẩn vào ống Eppendorf 1,5ml, thêm 100 µl Buffer AE và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó, tiến hành ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu hồi dịch lỏng phía dưới và bảo quản ở -20°C.
3.5.6.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR
Thành phẩn của phản ứng PCR:
Nội dung Thể tớch (àl)
Utilize specific primers to amplify the rnn gene segment: OR16S - F1: GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G; OR16S - R1: TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT (Charlton et al., 1993).
Tên mồi Trình tự nucleotide 5 ’ -3 ’ Kích thước
Mồi xuôi GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G
Mồi ngược TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu trình nhiệt: Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3.5.6.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Để chuẩn bị thạch Agarose 1,2%, bạn cần cân 1,2g Agarose và hòa tan vào 10ml dung dịch TBE 1X Sau đó, đun sôi hỗn hợp trong lò vi sóng và để nguội đến khoảng 40°C Khi thạch đã nguội, bổ sung 10µl Syber green và đổ thạch vào các giếng tương ứng với số mẫu cần điện di.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Thờm 2àl loading dye vào 8àl sản phẩm RT-PCR
Bước 3: Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch
Bước 4: Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tớch 6àl marker 100bp và 10àl sản phẩm PCR mỗi giếng
Bước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút
Bước 6: Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh
3.5.7 Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được
Tính mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được xác định bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên thạch
Chủng vi khuẩn cần kiểm tra được tăng sinh trong môi trường BHI và nuôi trong tủ ấm ở 37°C với 5% CO2 trong 24 – 48 giờ Trước khi sử dụng, chuẩn bị đĩa thạch máu và ủ trong 10 – 20 phút Tiếp theo, nhỏ 0,1ml canh khuẩn lên đĩa thạch và láng đều, để khô trong 3 – 5 phút nhưng không quá 25 phút Sử dụng panh để đặt và ấn nhẹ các khoang giấy đã tẩm kháng sinh cách nhau khoảng 15mm Sau khi đặt khoang giấy, lật úp đĩa thạch và ủ trong tủ ấm CO2 ở 37°C Kết quả sẽ được đọc sau 24 – 48 giờ.
Sử dụng thước đo kích thước vòng vô khuẩn từ mặt sau của đĩa mà không mở nắp So sánh kích thước vòng với bảng 3.1 và ghi lại kết quả cho từng loại kháng sinh được thử nghiệm, phân loại là: mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bình (I) và kháng (R).
Nguyên liệu nghiên cứu
Gà và các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm ORT được thu thập từ phổi, khí quản, phế quản, mẫu Swab (dịch ngoáy mũi, mắt, miệng, ổ nhớp, khí quản), lách, ruột, và hạch tại các hộ chăn nuôi gà ở Ba Vì, Hà Nội.
3.6.2 Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn có khả năng sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tuỳ tiện hoặc yếm khí tuỳ tiện, với nhiệt độ tối ưu là 37°C nhưng vẫn có thể phát triển ở 30 – 42°C Sự phát triển của vi khuẩn được tăng cường khi bổ sung 5 – 10% máu cừu hoặc máu thỏ vào môi trường nuôi cấy, và chúng có thể sinh trưởng trên Tryptose soy agar và Chocolate agar Tuy nhiên, vi khuẩn không phát triển trên các môi trường Macconkey agar và Endo agar Các môi trường dạng lỏng như BHI và PB cần được lọc kỹ để đảm bảo sự sinh trưởng của vi khuẩn.
Môi trường lý tưởng cho việc nuôi cấy vi khuẩn ORT là thạch mỏu Columbia Blood Agar, được bổ sung 5% mỏu cừu hoặc mỏu thỏ cùng với 5 mg/ml Gentamycin (Asadpour et al., 2008).
Để pha thạch máu Blood agar, cần cân chính xác 3,9g thạch máu với 100ml nước cất, sau đó hấp ướt ở 121°C trong 30 phút Sau khi để nguội đến 45 – 50°C, bổ sung 5ml máu thỏ và lắc đều cho máu hòa tan trong thạch Màu thạch đạt tiêu chuẩn là đỏ tươi.
Để phân lập các chủng ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm, cần thêm 10 µg Gentamycin cho mỗi ml môi trường thạch màu, vì hầu hết các chủng ORT đều kháng Gentamycin Sau đó, đổ hỗn hợp vào đĩa lồng với thể tích 10 – 15 ml mỗi đĩa.
Hình 3.1 Hình ảnh thạch máu có bổ sung gentamycin
- Hoá chất nhuộm Gram: tím Genxian, đỏ fucxin, cồn axetol 70 độ, dung dịch lugon
- Thử phản ứng oxydase: giấy thử phản ứng oxydase tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p Phenylenediamine hydrochloride
- Thử phản ứng indol: thuốc thử Kovac ’ s, nước trypton
- Thử kháng sinh đồ: môi trường thạch máu thỏ, giấy tẩm kháng sinh
- Kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN để chiết tách DNA 3.6.4 Máy móc
Trong lĩnh vực nghiên cứu và thí nghiệm, các thiết bị như tủ ấm, tủ -80 độ C, kính hiển vi, máy ly tâm, máy vortex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, máy hấp ướt, tủ sấy khô, tủ lạnh bảo quản mẫu và tủ lạnh bảo quản môi trường đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng và độ chính xác của các kết quả thí nghiệm.
Dao, kéo, panh kẹp, khay, đèn cồn, eppendorf, lanmen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, ống nghiệm, đĩa lồng, pipet, dụng cụ bảo hộ….