Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Chủng virus KTY - PRRS - 04 được phân lập tại ổ dịch tại Bắc Giang năm
2014 và lưu trữ tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y – Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Chủng virus KTY - PRRS - 04 đã được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của lợn mắc hội chứng suy giảm miễn dịch ở lợn (PRRS) tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y thuộc Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
* Dụng cụ, máy móc, thiết bị
- Chai nuôi cấy tế bào, khay 24 giếng, khay 96 giếng, pipet
- Tủ ấm 37 0 C/ 5% C02, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh các loại: -4 0 C, -20 0 C, -80 0 C, bình nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh tế bào
- Buồng cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, máy spin, vortex, máy lắc ấm, máy PCR
The Beckman Coulter CEQ 8000 automated sequencer from the USA, along with data processing software such as CEQ 8000 (version 9.0), Genetyx (version 5.0.4), and MEGA5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10), offers advanced solutions for genetic analysis.
- Tế bào Marc-145 được nuôi cấy trong bình nuôi (T25 hoặc T75) và trên khay 24 giếng
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEM, FCS, khỏng sinh (penicillin (100 U/àl), Streptomycin (100 àg/ml), EDTA, Trypsin, DMSO…
- Các chất dùng để tách chiết RNA của virus: Trizol (1ml Trizol/2ml hỗn dịch), PCS, Chloroform, Iso-propy alcohol, Ethanol 70%
- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Mồi xuôi, mồi ngược, enzyme…
- Bộ môn Bệnh lý Thú y – Khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam
- Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y - Khoa Thú Y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam
Từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016.
đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145
Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY -
- Giải trình tự gen ORF5 của chủng virus KTY - PRRS - 04;
- So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS - 04 qua các đời cấy chuyển
- So sánh trình tự axit amin của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS - 04 qua các đời cấy chuyển
- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của chủng virus KTY - PRRS - 04.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc - 145
* Chuẩn bị tế bào Marc 145
- Gọi tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 37 0 C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào
Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FCS, sau đó chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM + 5% FCS Đảm bảo đóng chặt bình nuôi cấy và ghi rõ tên tế bào cùng ngày gọi dậy lên nắp bình.
Giữ tế bào trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 và theo dõi sự phát triển hàng ngày Khi tế bào phát triển dày và che kín bề mặt đáy bình, có thể thu hoạch tế bào để bảo quản hoặc chuyển sang bình nuôi cấy mới.
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm
Bước 3: Loại bỏ Trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào bằng cách hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ Tiến hành đếm tế bào và pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) Sử dụng buồng đếm để xác định số lượng tế bào trên kính hiển vi và tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Tiến hành cấy chuyển tế bào bằng cách pha loãng tế bào đến nồng độ 2x10^5 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ và chia huyễn dịch tế bào vào các bình nuôi, cụ thể là 6ml cho bình T25 và 15ml cho bình T75.
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37 0 C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào
* Gây nhiễm virus KTY - PRRS - 04
Khi tế bào Marc-145 đã phủ kín bề mặt giếng nuôi cấy mà không chồng chéo, tiến hành hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100µl mẫu virus Hỗn dịch virus được ủ ở 37 độ C với 5% CO2 trong 60 phút.
Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và ủ ở 37 0 C với 5% CO2
Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổi vào các thời điểm 24, 36, 48, 60 và 72 giờ sau khi gây nhiễm
Hằng ngày, việc theo dõi sự phát triển của bệnh tích tế bào được thực hiện bằng kính hiển vi soi nổi Quá trình này bao gồm chụp ảnh tế bào và thu virus khi chúng gây hủy hoại từ 80-90% số tế bào nhiễm.
- Chủng virus được bảo quản trong tủ -80°C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo
3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID 50
Tế bào Marc-145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng với mỗi giếng chứa 2,0 x 10^4 tế bào Sau khi hút bỏ dịch môi trường, huyễn dịch chứa bệnh phẩm được ly tâm để loại bỏ cặn, sau đó pha loãng với tỷ lệ 1:10 và ủ trên bề mặt tế bào theo thứ tự đánh dấu (25 µl/giếng), mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần Sau 1 giờ ủ, dung dịch DMEM có chứa 5% FBS được bổ sung vào các giếng tế bào để gây nhiễm virus (100 µl/giếng).
Bệnh tích tế bào (CPE - Cyto Pathogenic Effect) được theo dõi hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi nhiễm Phương pháp Behrens-Karber được sử dụng để xác định TCID 50 (Lan NT et al., 2005).
3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển
Virus PRRS được nhiễm vào tế bào với tỷ lệ Multiplicity of Infection (MOI) là 0,01 Sau 1 giờ ủ, huyễn dịch chứa virus được loại bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch bằng 0,5ml PBS, sau đó bổ sung môi trường DMEM có 10% TPB Virus được giải phóng ra ngoài tế bào và trong tế bào được thu thập ở các thời điểm khác nhau sau khi nhiễm virus, cụ thể là 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 và 108 giờ Đường cong nhân lên của virus được xây dựng bằng cách tính log10 của TCID50/25µl tại mỗi thời điểm thu virus.
3.3.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
RNA tổng số là toàn bộ RNA được tách chiết từ mẫu nghiên cứu, bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt động (tRNA, mRNA) của tế bào và virus Để thu được RNA, cần loại bỏ DNA, vì sự hiện diện của DNA trong hỗn hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của RT-PCR.
26 đích là thu nhận được RNA của hệ gen virus PRRS đạt hàm lượng cao, đảm bảo đủ làm khuôn cho RT-PCR
Tách chiết RNA virus bằng Kit QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit
Bước 1: Hỳt 560àl Buffer AVL vào ống Eppendorf loại 1,5ml
Bước 2: Thêm 140 µl dung dịch mẫu vào ống Eppendorf để xử lý hỗn dịch chứa virus và dung dịch PCS, sau đó vortex trong 15 giây.
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
Bước 5: Thờm 560 àl dung dịch Ethanol (96% - 100%) vào ống, vortex 15 giõy và Spin down để loại bỏ các giọt trên nắp
Bước 6: Hỳt 630àl huyễn dịch trờn sang cột QIAamp spin (cột lọc) Ly tõm
8000 vòng/phút, trong 2 phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới ống
Bước 7: Lặp lại bước 6 một lần nữa với phần mẫu còn lại
Bước 8: Thờm 500àl dung dịch AW1, ly tõm 8000 vũng/phỳt, trong 2 phỳt rồi giữ cột, bỏ nước dưới
Bước 9: Ly tâm 500ml dung dịch AW2 ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 3 phút, giữ cột và loại bỏ dung dịch phía dưới Sau đó, thực hiện ly tâm thêm một lần nữa ở 14.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn AW2.
Bước 10: Đặt cột QIA vào ống eppendort 1,5ml mới, thêm 60ml dung dịch
AVE để ở nhiệt độ phòng 1 phút
Sau đó ly tâm 8000 vòng, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -80°C
* Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR
Mẫu ARN sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT-PCR theo bộ Kit one-step Invitrogen với các thành phần được trình bày dưới bảng 3.1
Bảng 3.1 Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR
Thành phần phản ứng Thể tớch cần lấy(àl)
Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR bao gồm mồi xuôi và mồi ngược, được thiết kế để khuếch đại đoạn gen ORF5 dài 603bp của PRRSV, như được thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR
Trình tự nucleotid của đoạn mồi Kích thước
Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC
Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT-PCR Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di
* Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
Kỹ thuật điện di được sử dụng trong phân tích định tính, định lượng, thu nhận, tách các acid nucleic và protein từ một hỗn hợp mẫu
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Trong nghiên cứu này, thạch agarose và dung dịch đệm TAE được sử dụng để tạo bản gel, trong khi hai loại thạch thường được dùng cho điện di là Agarose và Polyacrylamid.
Để chuẩn bị bản gel, hòa tan 1,5 gram agarose trong dung dịch đệm TAE 1x, sau đó đặt vào lò vi sóng ở 100°C trong 5 phút Chờ cho thạch nguội đến khoảng 50°C – 60°C, thêm 3 µl Ethidium Bromide và đổ vào khuôn đã cài sẵn để tạo các giếng kiểm tra mẫu Khi bản gel đông cứng, đặt vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TAE ngập khoảng 3-5mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di