Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được nghiên cứu từ tháng 11/2015 đến tháng 4/2016
- Phòng thí nghiệm Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương (TTCĐ)
- Khu nuôi động vật ATSH của TTCĐ
- Phòng thí nghiệm ATSH củaTTCĐ.
Nguyên liệu, đối tượng dùng trong nghiên cứu
- Gà và vịt 1 ngày tuổi
Vacxin CGC là loại vacxin vô hoạt tái tổ hợp Cúm H5 nhị giá, bao gồm hai chủng Re-6 và Re-8, được nhập khẩu từ Trung Quốc Vacxin này được phát triển từ virus H5N1 clade 2.3.2.1 (chủng Re-6) và virus H5N6 clade 2.3.4.4 (chủng Re-8).
- Virus cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4B phân lập từ mẫu gà ở Lạng Sơn ngày 08/01/2016 (A/Ck/Vietnam/LangSon/16A10/2016(H5N6)
- Kháng nguyên chuẩn H5N1 dùng cho phản ứng HI: A/ck/VN1203/2004 (clade 1), A/Hubei/1/2010 (clade 2.3.2.1) và A/ck/VN/LangSon(TrangDinh)- NCVD140450(14A324)/2014 (H5N6 clade 2.3.4.4)
3.2.2 Các loại dung dịch, môi trường
- Môi trưởng bảo quản swabs
- Bộ kit chiết tách ARN, kit nhân gen qRT-PCR
- Prime, Probe, đối chứng dương H5N6.
Trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm
Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh, và tủ lạnh âm sâu -80°C cùng tủ lạnh âm -20°C là những thiết bị thiết yếu trong nghiên cứu sinh học phân tử Hệ thống bơm hút chân không được sử dụng hiệu quả trong quá trình chiết tách RNA, trong khi máy Real time PCR (RT-PCR) đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích và phát hiện gen.
- Phòng thí nghiệm ATSH cấp 2 để phân lập virus
- Phòng nuôi động vật ATSH cấp 2+ để công cường độc.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Tình hình dịch bệnh cúm trên đàn gia cầm tại Việt Nam
- Nghiên cứu sự phân bố và lưu hành các chủng virus cúm gia cầm trên địa bàn cả nước
- Đánh giá hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 + Re-8 khi tiêm cho đàn gà, vịt thí nghiệm
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và mức độ bài thải virus của gà thí nghiệm sau khi công cường độc
+ Nghiên cứu các triệu chứng lâm sàng của gia cầm sau công cường độc + Xét nghiệm virus bài thải
+ So sánh hiệu giá kháng thể trung bình và tỉ lệ bảo hộ lâm sàng của lô gà và vịt
+ Bệnh tích đại thể của đàn gà, vịt sau khi công cường độc
Gà và vịt được lựa chọn từ đàn sạch bệnh, chưa tiêm phòng vacxin CGC và không có kháng thể kháng nguyên cúm H5 Trước khi tiêm vacxin, khoảng 30% tổng đàn sẽ được lấy máu để kiểm tra kháng thể kháng cúm gia cầm bằng phương pháp HI với kháng nguyên H5N1.
Bố trí tiêm vacxin cho gà được thực hiện như sau: Trong tổng số 50 con gà, có 30 con thuộc lô Vacxin và 20 con thuộc lô Đối chứng Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, 30 con gà trong lô Vacxin sẽ được tiêm một mũi vacxin khi chúng đạt 3 tuần tuổi, trong khi lô Đối chứng sẽ không được tiêm vacxin.
Bố trí tiêm vaccine cho 50 vịt được chia thành hai lô: lô Vacxin gồm 30 con và lô Đối chứng gồm 20 con Lô Vacxin sẽ được tiêm 1 mũi vaccine lúc 3 tuần tuổi và nhắc lại lúc 6 tuần tuổi theo khuyến cáo của nhà sản xuất, trong khi đó lô Đối chứng không được tiêm vaccine.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin
Nhóm Số lượng Liều vacxin
Gà Tiêm vacxin 30 0,3 ml/con Đối chứng 20 Không tiêm
Vịt Tiêm vacxin 30 0,3 ml/con Đối chứng 20 Không tiêm
Sau khi hoàn tất liệu trình vacxin, cần lấy mẫu máu từ gà và vịt sau ba tuần để xác định hiệu giá kháng thể kháng H5 của virus CGC Phương pháp sử dụng là HI với kháng nguyên H5N1 đồng chủng vacxin hoặc kháng nguyên gần nhất với chủng virus vacxin, kết hợp với kháng nguyên virus dùng để công cường độc.
Công cường độc cho gà nên thực hiện khi chúng đạt 6 tuần tuổi, trong khi vịt cần được công cường độc ở 9 tuần tuổi, tức là 3 tuần sau khi hoàn tất liệu trình vacxin Việc lựa chọn gà và vịt để công cường độc cần dựa trên tỷ lệ phân bố hiệu giá kháng thể đối với kháng nguyên đồng chủng vacxin Mỗi loài nên bao gồm 10 con từ lô vacxin và 5 con từ lô đối chứng để đảm bảo tính chính xác trong quá trình nghiên cứu.
Số còn lại để dự phòng
- Theo dõi trong vòng 10 ngày sau công cường độc, chấm điểm lâm sàng hằng ngày theo quy trình của OIE Đánh giá theo các mức độ sau: Điểm Ý nghĩa
Không chấm điểm Khoẻ mạnh
- Mổ khám gia cầm chết, đánh giá bệnh tích đại thể Mổ khám gia cầm sống sót để so sánh bệnh tích với những con chết
Lấy mẫu swab hầu họng vào các ngày thứ 3, thứ 10 và vào ngày phát hiện gia cầm chết sau khi tiêm công cường độc để xét nghiệm virus bài thải bằng phương pháp Real-time RT-PCR.
- Lấy mẫu huyết thanh gia cầm sống sót vào ngày thứ 10 để đánh giá đáp ứng miễn dịch đối với virus cường độc
3.4.2.2 Phương pháp điều tra hồi cứu
Bài viết tổng hợp thông tin từ Cục Thú y về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm (CGC), kết quả tiêm phòng vacxin và kết quả xét nghiệm giám sát huyết thanh sau tiêm phòng qua các năm Qua đó, bài viết đánh giá hiệu quả của việc tiêm phòng vacxin cúm trên thực địa.
3.4.2.3 Chuẩn đoán phòng thí nghiệm
Sơ đồ chẩn đoán bệnh cúm gia cầm yêu cầu tất cả các thao tác liên quan đến xử lý mẫu, chiết tách ARN và phân lập virus phải được thực hiện trong buồng an toàn sinh học cấp 2 trở lên Việc lấy mẫu bệnh phẩm là bước đầu tiên trong quy trình này.
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên
Mẫu xét nghiệm kháng nguyên cần lấy từ 3 gam đến 5 gam bệnh phẩm của gia cầm bị bệnh, bao gồm não, phổi, khí quản, lách hoặc ruột Nếu gia cầm còn sống, sử dụng tăm bông để lấy dịch ổ nhớp, họng hoặc phân tươi, sau đó cho vào dung dịch PBS với pH 7,2 đến 7,4, có bổ sung dung dịch kháng sinh theo tỉ lệ 1:10.
Dung dịch muối đệm phosphat (PBS):
+ Natri clorua (NaCl) 8 g + Natri hydro photphat dihydrat (Na 2 HPO 4 2H 2 O) 2,9 g + Kali dihydro photphat (KH 2 PO 4 ) 0,2 g + Kali clorua (KCl) 0,2 g
Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N Hấp vô trùng ở 121 o C trong 30 giây
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
Chỉ thực hiện lấy máu từ gia cầm nghi mắc cúm gia cầm chưa tiêm vacxin Sử dụng xy lanh 5 ml để thu thập 1 ml máu, rút cán xy lanh lên mức cao nhất nhằm tạo nhiều khoảng trống bên trong, và đặt xy lanh nằm nghiêng.
5 o ở nhiệt độ 20 đến 30 o C trong thời gian 30 min để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh Chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để dùng cho xét nghiệm
Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2 o C đến 8 o C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24h b Phát hiện kháng nguyên
- Mẫu bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột)
+ Nghiền 1 gam bệnh phẩm bằng cối chày sứ với dung dịch PBS pH 7,2 theo tỉ lệ 1:10 thành huyễn dịch 10 %
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm Ly tâm ở tốc độ 8 000 r/min trong 15 s
Chia mẫu bệnh phẩm thành hai ống 1,5 ml; một ống để thực hiện xét nghiệm Realtime RT-PCR (rRT-PCR), phân lập virus trên tế bào và trứng, trong khi ống còn lại được lưu trữ ở nhiệt độ -80°C để bảo quản.
- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản, phân tươi
+ Lắc ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc trong 15 s, ly tâm ống ở tốc độ 8000 g/min trong 15 giây
Sử dụng pipet để chuyển dịch từ ống sang hai ống 1,5 ml; một ống dành cho xét nghiệm Realtime RT-PCR, phân lập virus trên tế bào hoặc trên trứng, trong khi ống còn lại được lưu trữ mẫu ở nhiệt độ -80 độ C.
*) Phương pháp Realtime PCR (phụ lục 4)
Tất cả các quy trình tiêm truyền trứng và thu hoạch dịch niệu mô sau khi phân lập cần được thực hiện trong môi trường an toàn sinh học cấp 3.
+ Mỗi mẫu bệnh phẩm cần được tiêm truyền lên 3 trứng
+ Chọn trứng gà có phôi 9 ngày đến 10 ngày tuổi khoẻ mạnh không có kháng thể cúm
+ Lau trứng bằng cồn 70 % và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi
+ Dùng xi lanh 1 ml với kim 23G và hút dịch bệnh phẩm tiêm phía trên buồng hơi thẳng xuống xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng
+ Bịt lỗ tiêm trên vỏ trứng bằng keo dán
+ Đặt trứng trong tủ ấp trứng 37 o C và theo dõi trong vòng 72 h
+ Soi trứng mỗi ngày 2 lần, nếu phát hiện trứng chết, giữ trứng trong tủ lạnh (4 o C) cho đến khi thu hoạch dịch niệu mô để giám định virus
+ Đối với trứng không chết sau 72 h, cất vào tủ lạnh (4 o C) qua đêm hoặc ít nhất 4 h trước khi thu hoạch dịch niệu mô cho giám định virus
- Thu hoạch dịch niệu mô
+ Dùng panh và kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên
+ Thu hoạch dịch niệu mô từ 5 ml đến 10 ml/trứng vào các ống nghiệm riêng rẽ để giám định virus
Trước khi thực hiện giám định, cần áp dụng phương pháp HA để phát hiện virus cúm gia cầm (Newcastle, vi rút gây hội chứng giảm đẻ) trong dịch niệu mô thông qua khả năng gây ngưng kết hồng cầu Nếu kết quả HA cho thấy dương tính, điều này xác nhận sự hiện diện của virus trong dịch niệu mô.
+ Giám định virus trong dịch niệu mô bằng phương pháp HI sử dụng kháng huyết thanh chuẩn H5 hoặc bằng phương pháp Realtime RT-PCR
+ Kết quả giám định (bằng HI hoặc phản ứng realtime RT- PCR hoặc RT- PCR) dương tính, dịch niệu mô có virus cúm gia cầm H5N1
Kết quả giám định cho thấy dịch niệu mô không có virus cúm gia cầm H5N1 Trong trường hợp âm tính, dịch niệu mô thu hoạch lần đầu sẽ được sử dụng để tiêm truyền trứng lần hai, sau đó tiếp tục theo dõi và thu hoạch dịch niệu mô như lần đầu Nếu kết quả giám định lần hai vẫn âm tính, mẫu sẽ được kết luận là âm tính với virus cúm gia cầm H5N1.
