Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là một số vi khuẩn gây ô nhiễm trong thịt đông lạnh nhập khẩu (quy định trong QCVN 8-3/ BYT) và các tiêu chuẩn sử dụng để xét nghiệm
- Salmonella spp – TCCS 03/TYV2/2016-CĐ
Phòng Vi sinh thực phẩm - Tổ Vệ sinh thú y - Trạm Chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật, Cơ quan Thú y vùng II
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 8/2016 đến tháng 6/2017.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp
- Thẩm định phương pháp đinh lượng tổng số VSVHK trong thịt theo TCVN 9977-2013
- Thẩm định phương pháp đinh lượng vi khuẩn E.coli trong thịt theo TCVN 9975-2013
Thẩm định phương pháp phát hiện Salmonella spp trong thịt theo tiêu chuẩn TCCS 03/2016/TYV2-CĐ 3.2.2 là cần thiết để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp này Việc ứng dụng kiểm nghiệm các mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu giúp đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
- Kiểm nghiệm các lô thịt bò đông lạnh
- Kiểm nghiệm các lô thịt đùi gà đông lạnh
- Kiểm nghiệm các lô thịt gà nguyên con đông lạnh
Nguyên liệu
3.3.1 Chủng chuẩn vi sinh vật
- Salmonella enterica subsp enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™*,
- Staphylococus aureus subsp aureus ATCC ® 29213 TM
3.3.2 Các mâũ thịt đông lạnh:
Các mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu đủ điều kiện xét nghiệm cần được đóng gói và niêm phong cẩn thận, bảo quản ở nhiệt độ âm 20 độ C khi tiếp nhận tại phòng xét nghiệm vi sinh Những mẫu này bao gồm thịt gà xay, thịt bò, gà nguyên con và đùi gà.
3.3.3 Các thiết bị trong phòng thí nghiệm
- Tủ âm sâu(-20 0 C), tủ ấm các loại, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp cách thủy, cân, buồng cấy an toàn sinh học, máy dập mẫu stomatcher
Ống lưu giữ chủng chuẩn thương mại Microbank, đèn cồn, que cấy nhựa vô trùng dùng một lần, hộp lồng thủy tinh, khay men, cốc đong, ống nghiệm, dao mổ và kéo cong là những dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm Những sản phẩm này đảm bảo quy trình nghiên cứu và thí nghiệm diễn ra an toàn và hiệu quả.
- Hệ thống định danh Vitek 2 compact
3.3.4 Môi trường chính nuôi cấy vi sinh vật
Bảng 3.1 Môi trường chính dùng để thẩm định phương pháp và phân tích các chỉ tiêu VSV
TT Chỉ tiêu phân Môi trường chính tích/Phương pháp
4 TCVN 4884:2015 Đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí 3M Petrifilm TM Aerobic count plate Đĩa đếm 3M Petrifilm TM E coli/coliform count plate
Buffer peptone water (BPW), Iris Salmonella supplement(BS 07708), Iris Salmonella agar, confirm’ Salmonella (BT01108)
MKTTn - Tetrathionat/novobioxin Muller kauffman, RVS - Rappaport Vassiliadis, thạch XLD -
Deoxycholat lyzin xyloza, HE - Hektoen enteric agar,
TSA (Tryp Soy agar) và KHT O, H là các loại đĩa đếm vi sinh vật hiếu khí Petrifilm TM Đĩa này có màng nền chứa thạch và chất tạo đông tan trong nước lạnh, trong khi màng phủ chứa chất tạo đông, giúp quá trình phân tích vi sinh vật hiệu quả hơn.
Đĩa đếm E coli/coliform Petrifilm TM được thiết kế với các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím, chất tạo đông tan trong nước lạnh, và chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua, giúp tăng khả năng quan sát sự phát triển của khuẩn lạc Mỗi đĩa có vùng sinh trưởng được khoanh tròn, chứa khoảng hai mươi ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm² trên màng nền Chất chỉ thị hoạt độ glucuronidase 5-brom-4-clo-3-indolyl-ò-D-glucuronid cho phép đếm coliform và E coli trên cùng một đĩa, mang lại hiệu quả cao trong việc phân tích vi sinh vật.
Iris Salmonella agar là môi trường chọn lọc với độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện hầu hết các loài Salmonella, bao gồm cả những biến chủng huyết thanh không điển hình Môi trường này đảm bảo phát hiện Salmonella typhi, paratyphi, cũng như các loài dương tính với lactose như Salmonella Senftenberg và các phân loài S arizonae, S diarizonae Ngoài ra, nó còn cho phép phát hiện các serovar bất động như S Pullorum và S Gallinarum, cũng như các chủng đơn IRIS ® Salmonella Agar cũng có khả năng phát hiện các dòng có ít hoặc không có hoạt tính esterase trên các môi trường khác, bao gồm Salmonella bongori, Salmonella Dublin và Atento, cùng một số phân loài S và S houtenae diarizonae.
MKTTn và RVS là hai môi trường tăng sinh thứ cấp, trong đó có một số thành phần có khả năng ức chế sự phát triển của một số loài vi khuẩn không phải Salmonella.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp thẩm định tiêu chuẩn
Thẩm định, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp thử nghiệm được thực hiện theo:
Theo Trần Cao Sơn (2010) và TCVN 9332:2012, các thông số cần xác định trong phương pháp định lượng bao gồm độ lặp lại, độ tái lặp và độ không đảm bảo đo Đối với phương pháp định tính, cần chú ý đến giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu và độ đúng.
Các bước thẩm định phương pháp:
B1: Đánh giá môi trường được sử dụng trong các phương pháp xét nghiệm.
Với môi trường nuôi cấy dạng đặc tiến hành đánh giá hiệu suất của môi trường theo TCVN 8128: 2015 Hiệu suất môi trường kí hiệu P R %.
P R: Hiệu suất môi trường đánh giá
N S: Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường kiểm tra
N 0 : Số khuẩn lạc trung bình trên môi trường tham chiếu và phải > 100
Để thực hiện quy trình, lấy một hạt giá thể chứa chủng chuẩn Salmonella enteritidis ATCC®49223™ và Escherichia coli ATCC® 11303™ đã được hoạt hóa, bảo quản trong ống Microbank ở -20°C Sau đó, tăng sinh trong môi trường Brain Heart Infusion ở 37°C trong 24 giờ Cuối cùng, ria cấy chủng từ các ống tăng sinh trên môi trường TSA và tiếp tục ủ ở 37°C trong 18 giờ.
24 giờ Thực hiện các bước pha loãng, cấy lên các môi trường:
- Môi trường dùng để kiểm tổng số VSVHK 3M TM Petrifilm TM Aerobic count plate với môi trường dinh dưỡng Plate count agar (PCA)
- Môi trường dùng để kiểm Coliform và E.coli 3M TM Petrifilm TM E.coli/Coliform count plate với môi trường Plate count agar (PCA)
- Môi trường Iris Salmonella agar với môi trường Tryptic Soy agar (TSA)
Đối với các mẫu nhiễm tự nhiên, việc kiểm tra tính ổn định của mẫu là rất quan trọng Các vi sinh vật mục tiêu có trong nền mẫu cần phải đảm bảo ổn định trong suốt quá trình kiểm tra.
Để đảm bảo độ chính xác trong các phương pháp phân tích định tính, các nền mẫu đánh giá cần phải không nhiễm vi sinh vật mục tiêu (mẫu âm tính) Cụ thể, cần lấy riêng 1 kg thịt bò và 1 kg thịt gà xay cắt nhỏ, đồng nhất từng nền mẫu, sau đó rút ra 5 mẫu từ mỗi nền mẫu, mỗi mẫu có trọng lượng 25g.
Kiểm tra tổng VSVHK theo TCVN 4884-1: 2015
Kiểm tra E.coli trong các nền mẫu theo TCVN 7924-2: 2008
Kiểm tra Salmonella trong các nền mẫu theo TCVN 4829: 2005 B3: Kiểm tra chủng chuẩn phục vụ cho việc gây nhiễm
Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng gây nhiễm là cần thiết để đảm bảo các chủng chuẩn không bị biến đổi trong quá trình lưu giữ và bảo quản Đề tài này sử dụng hệ thống định danh vi khuẩn Vitek 2 để tiến hành kiểm tra các chủng, với các bước chi tiết được trình bày trong phụ lục 1.
Trước khi tiến hành gây nhiễm chủng vào mẫu, các chủng bao gồm
(Salmonella enterica subsp enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™*, Escherichia coli ATCC® 11303™, Vibrio parahaemolyticus ATCC ® 17802 TM , Staphylococus aureus subsp aureus ATCC ®
29213 TM ) được định danh lại bằng hệ thống định danh Vitek2
Hai chủng vi khuẩn Salmonella enterica subsp enterica serovar Enteritidis ATCC® 49223™ và Escherichia coli ATCC® 11303™ được định danh và so sánh với giấy chứng nhận sinh học từ nhà cung cấp nhằm đánh giá sự tương đồng trong các phản ứng sinh hóa.
Chủng gây nhiễm cần thể hiện các đặc tính nuôi cấy trên môi trường chọn lọc chuyên biệt, bao gồm khả năng sinh hơi, lên men trong môi trường lỏng và khả năng sinh màu trên các môi trường này.
B4: Xác định mật độ vi khuẩn để phục vụ cho việc gây nhiễm vào mẫu thẩm định
Sử dụng phương pháp xác định nồng độ vi sinh vật mục tiêu trong các ống pha loãng từ 10 0 , 10 -1 ….10 -n bằng cách thăm dò từng ống trong dãy pha loãng:
Để thực hiện quy trình, đầu tiên lấy một khuẩn lạc của chủng E.coli hoặc Salmonella đã được kiểm tra đặc tính sinh hóa và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Sau đó, hòa loãng khuẩn lạc trong 9ml buffer peptone water với nồng độ 10^0 Tiếp theo, chuyển 1ml từ dung dịch này sang ống chứa 9ml buffer peptone water để đạt nồng độ 10^-1 Lặp lại quy trình này liên tiếp cho đến khi đạt được nồng độ 10^-7 và 10^-8.
Để xác định nồng độ vi khuẩn trong canh trùng, phương pháp cấy trang trên đĩa thạch theo TCVN 4884-2:2015 được áp dụng Sử dụng Micropipep, lấy 0,1ml cấy lên mặt thạch (môi trường dinh dưỡng TSA hoặc môi trường chọn lọc của vi sinh vật mục tiêu) hoặc 1ml vào đĩa thạch khi áp dụng phương pháp đổ đĩa Mỗi độ pha loãng cần thực hiện lặp lại trên 2 đĩa Sau đó, nuôi cấy trong tủ ấm theo các điều kiện về nhiệt độ và thời gian yêu cầu Kết quả được tính toán dựa trên 2 nồng độ liên tiếp và theo tiêu chuẩn TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).
B5 Gây nhiễm vi sinh vật vào các mẫu
Với phương pháp định lượng:
Sử dụng vi sinh vật hoặc các mẫu nhiễm tự nhiên là phương pháp hiệu quả để phát hiện và phân tích trong phòng thí nghiệm Việc lựa chọn nền mẫu xét nghiệm phù hợp sẽ đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong quá trình kiểm tra.
Thực hiện thí nghiệm gây nhiễm cho ít nhất 10 mẫu nghiên cứu từ mỗi loại thịt, bao gồm 10 mẫu thịt gà xay và 10 mẫu thịt bò Mỗi mẫu có trọng lượng 50g sẽ được nhiễm với một lượng vi khuẩn E.coli trong khoảng nồng độ từ 10^2 đến 10^4 CFU/g.
Phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí (VSVHK) được thực hiện theo tiêu chuẩn TCVN 9977:2013 và TCVN 4884:2015 trên 10 mẫu thịt xay nhiễm tự nhiên và 10 mẫu thịt bò nhiễm chủng E.coli Đối với mẫu thịt bò, do số lượng vi sinh vật thấp, cần phải gây nhiễm thêm vi khuẩn vào các mẫu phân tích Sử dụng chủng E.coli, mức gây nhiễm đạt khoảng 7*10^2 CFU/g cho 50g mẫu, tương đương với 2ml dịch canh khuẩn từ ống pha loãng 10^-4 Quá trình này được thực hiện 10 lần với 10 mẫu lặp lại trong 2 ngày liên tiếp.
Thực hiện thẩm định phương pháp định lượng E.coli theo TCVN 9975: 2013 trên mẫu thịt bò và thịt gà bằng cách cân 50 g mẫu với số lần lặp n Sử dụng chủng chuẩn E.coli để nhiễm vào 2 nền mẫu với nồng độ 1,6*10^3 CFU/g, tương đương với việc bổ sung 0,5ml dịch canh khuẩn có nồng độ 10^-3 Xét nghiệm song song 2 phương pháp TCVN 9975: 2013 và TCVN 7924-2: 2008 trong 2 ngày để so sánh kết quả.
Bố trí thí nghiệm được thực hiện trên mỗi nền mẫu với việc gây nhiễm từ 3-5 mức khác nhau, bắt đầu từ nồng độ vi khuẩn gần bằng 0 và tăng dần theo các mức tiếp theo Quá trình này bao gồm việc pha loãng vi khuẩn Salmonella enterica bằng hệ số pha loãng nhị phân để xác định nồng độ vi khuẩn ở từng mức.
Mức 1: 1-3cfu/25g/ mẫu: lặp lại 10 lần
Mức 2: 3-6cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
Mức 3: 6-10cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
Mức 4: 10-20cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
Mức 5: > 20cfu/25g/mẫu: lặp lại 10 lần
… đến mức n sao cho kết quả đạt được ở mức gây nhiễm nồng độ vi khuẩn thấp nhất đạt được 100% cho kết quả dương tính
Mẫu âm tính, sử dụng 3 nền mẫu âm tính, mỗi nền mẫu lặp lại
The study involved ten trials using a white sound model and negative sound model, employing various microorganisms including Vibrio parahaemolyticus ATCC ® 17802 TM, E coli ATCC ® 11303 TM, and Staphylococcus aureus subsp aureus ATCC ® 29213 TM to induce infection.