Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa diểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú Y – Bệnh viện thú y – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Các hộ, trang trại chăn nuôi gia cầm trên địa bàn huyện Yên Phong và Quế Võ, tỉnh Bắc Ninh.
- Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2017 đến tháng 8/2018.
Đối tượng/ vật liệu nghiên cứu
- Đàn gia cầm tại các hộ, trang trại chăn nuôi tại một số xã trên địa bàn huyện Yên Phong và Quế Võ, tỉnh Bắc Ninh.
- Vi khuẩn E coli và Salmonella phân lập từ mẫu phân gà khỏe mạnh tại một số hộ chăn nuôi gia cầm tại các địa bàn trên.
- Mẫu phân gà khỏe mạnh tại một số hộ chăn nuôi gia cầm trên địa bàn huyện Yên Phong và Quế Võ, tỉnh Bắc Ninh.
3.3.2.2 Các môi trường chuyên dụng dùng để phân lập, giám định vi khuẩn
Các môi trường được sử dụng để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn đường ruột bao gồm thạch MacConkey, thạch SS, thạch XLD, thạch TSI, thạch EMB và môi trường tăng sinh BHB.
3.3.2.3 Các kháng sinh được sử dụng trong đề tài
- Một số loại kháng sinh khác: Cephalexin, Doxycillin, Streptomycin, Norfloxacin, Ofloxacin, và Trimethoprim.
- Khoanh giấy tẩm kháng sinh được bảo quản lạnh Kết quả được đánh giá theo quy định của nhà sản xuất.
Trong nghiên cứu vi khuẩn, các dụng cụ phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng, bao gồm tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, nồi hấp, buồng cấy, cân điện tử, đĩa lồng, ống nghiệm, đèn cồn, bếp điện, bình tam giác, ống đong và giấy đo pH Những thiết bị này giúp đảm bảo môi trường nghiên cứu chính xác và hiệu quả.
- Hoá chất: Dung dịch NaOH 10%, cồn sát trùng 70%, muối tinh, pepton,
Nội dung nghiên cứu
- Điều tra tình hình chăn nuôi gia cầm, tình hình sử dụng kháng sinh trên địa bàn huyện Yên Phong và Quế Võ, tỉnh Bắc Ninh.
- Phân lập vi khuẩn E coli và Salmonella.
- Đánh giá sự kháng kháng sinh của các chủng E coli và Salmonella phân lập được từ phân của gia cầm khỏe mạnh.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Điều tra, đánh giá thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm tại huyện Yên Phong và Quế Võ, tỉnh Bắc Ninh
- Dùng phiếu điều tra ngẫu nhiên 150 hộ chăn nuôi gia cầm đại diện trên 3 xã tại huyện Yên Phong và 3 xã tại huyện Quế Võ, tỉnh Bắc Ninh.
- Phỏng vấn cán bộ kỹ thuật, cán bộ Thú y và người chăn nuôi về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm.
3.5.2 Phân lập vi khuẩn E coli và Salmonella
- Lấy 38 mẫu/10 hộ chăn nuôi gia cầm tại huyện Yên Phong và 42 mẫu/10 hộ chăn nuôi gia cầm tại huyện Quế Võ để xét nghiệm vi khuẩn E Coli,
- Lấy khoảng 1g mẫu phân bằng tăm bông vô trùng lấy phân từ hậu môn của gà khỏe mạnh.Tăm bông phải được làm ẩm bằng nước muối vô khuẩn.
-Đưa chóp tăm bông vào qua cơ thắt hậu môn rồi xoay nhẹ nhàng.
-Lấy tăm bông ra và kiểm tra chắc chắn đầu tăm bông đã có dính phân.
- Đưa tăm bông vào tuýp vô khuẩn hoặc hộp bảo quản có chứa môi trường thích hợp cho vận chuyển vi khuẩn.
- Bẻ gẫy phần trên cùng của cán tăm bông không chạm vào tuýp, sau đó vặn chặt nắp lại.
- Mẫu phân lấy được bảo quản trong lọ thuỷ tinh vô trùng có nắp được bảo quản lạnh ngay và vận chuyển ở nhiệt độ 4 - 8 o C.
Hình 3.1 Cách đóng gói khi lấy mẫu bệnh phẩm
- Mẫu phân thu thập về cần được xử lí và xét nghiệm ngay để cho kết quả định lượng số lượng vi khuẩn chính xác.
- Mẫu được cấy truyền ngay vào môi trường nước thịt, đặt trong tủ ấm
37 o C/24 h Sau đó dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc để chuyển sang các loại môi trường phân lập.
3.5.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩm E.coli và Salmonella
Mẫu phân được tăng sinh trong môi trường BHB và sau đó được cấy trên các môi trường thạch MacConkey, thạch SS, thạch EMB, ủ ở 37 o C trong 24 giờ Sau thời gian nuôi cấy, các dạng khuẩn lạc trên đĩa thạch cho phép xác định loại vi khuẩn đường ruột dựa vào màu sắc và hình dạng Việc phân lập vi khuẩn E coli và Salmonella được thực hiện thông qua việc phiết kính kiểm tra hình thái khuẩn lạc.
Các chỉ tiêu kiểm tra bao gồm chuuyển hóa đường, phản ứng sinh indol, phản ứng H 2 S, phản ứng oxidase, phản ứng catalase, phản ứng lên men các loại đường.
3.5.3 Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của E coli và Salmonella phân lập từ phân gia cầm khỏe mạnh với một số thuốc kháng sinh và hoá học trị liệu
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch theo nguyên lý Kirby – Bauer Kết quả được đánh giá dựa trên tiêu chuẩn của Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (NCCLS, 1999).
Phương pháp được tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp ở
Để đạt được độ đục 0,5 trong dãy màu McFarland, lấy một khuẩn lạc hòa vào 1,5 ml nước sinh lý Sau đó, sử dụng tăm bông vô trùng để tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên môi trường thạch.
+ Bước 3: Dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) lên mặt đĩa thạch.
Bước 4: Để bồi dưỡng đĩa thạch, cần duy trì nhiệt độ ở 37 độ C trong khoảng 18 đến 24 giờ Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn, từ đó đánh giá mức độ mẫn cảm hoặc kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn được kiểm tra.
- Các loại kháng sinh được kiểm tra bao gồm: Amoxycillin, Cephalexin, Doxycillin, Colistin, Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin, Norfloxacin, Ofloxacin, và Trimethoprim /Sulfamethoxazol.
Bảng 3.1 Đo đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (NCCLS, 1999)
+ Bước 3: Giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid được đặt khoảng cách đều nhau trong đĩa.
+ Bước 4: Bồi dưỡng ở 37 0 C trong 18 – 24h, đo đường kính vòng vô khuẩn để đánh giá mức độ nhạy cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Kết quả được xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn, nhằm đánh giá tính mẫn cảm hoặc đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh tương ứng.
3.5.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2010.