Mở Ðầu
Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh Cúm gia cầm (CGC) xuất hiện lần đầu tại Việt Nam vào cuối năm 2003 và đầu năm 2004, do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI) gây ra Virus này không chỉ gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi mà còn đe dọa sức khỏe con người Từ năm 2003 đến tháng 6 năm 2017, đã có 856 ca bệnh cúm A/H5N1 ở 16 quốc gia, dẫn đến 452 trường hợp tử vong, trong đó Việt Nam cũng ghi nhận nhiều ca mắc.
Tính đến năm 2017, đã ghi nhận 127 trường hợp mắc bệnh cúm A/H5N1, trong đó có 64 ca tử vong (WHO) Virus cúm A/H5N1 có khả năng biến đổi nhanh chóng, dẫn đến sự xuất hiện của nhiều biến chủng khác nhau trên toàn cầu, từ châu Á đến châu Âu Việt Nam cũng đã phát hiện nhiều biến chủng A/H5N1, được phân loại thành các nhánh (clade) và phân nhánh (subclade) khác nhau.
Nghiên cứu của các tác giả trong nước chỉ ra rằng nhiều biến chủng virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 mới đã xuất hiện tại Việt Nam Sự tiến hóa của các chủng virus địa phương và lây nhiễm từ các quốc gia khác thông qua buôn bán gia cầm, sản phẩm gia cầm, hoặc chim di cư đã làm giảm hiệu quả của các chiến dịch phòng bệnh bằng vacxin, thậm chí có thể vô hiệu hóa chúng.
Giám sát virus CGC mới là cần thiết để phát hiện các biến chủng và xây dựng chiến lược phòng chống hiệu quả Việc thực hiện giám sát tại các chợ gia cầm sống là quan trọng, vì đây là nơi tập trung nhiều động vật từ nhiều nguồn khác nhau, tạo điều kiện cho virus CGC độc lực cao phát triển và lây lan Ở Việt Nam, với phương thức chăn nuôi gia cầm nhỏ lẻ, việc phát hiện virus cúm qua các chợ buôn bán gia cầm sống là giải pháp tối ưu.
Quảng Nam là tỉnh có quy mô chăn nuôi lớn, đặc biệt trong lĩnh vực gia cầm, nhưng đối mặt với nguy cơ bùng phát dịch cúm gia cầm (CGC) và lây sang người, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng Để chủ động phòng chống dịch CGC, giảm thiểu tổn thất cho nông dân và ngăn chặn lây lan, chúng tôi thực hiện đề tài “Tình hình nhiễm và một số đặc tính sinh học của virus cúm gia cầm A/H5N1 và H5N6 tại một số chợ buôn bán gia cầm thuộc tỉnh Quảng Nam năm 2016 – 2017” Công việc này nằm trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng (clade) mới của virus cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt Nam”, được cấp kinh phí bởi Bộ Khoa học và Công nghệ với mã số ĐTĐL.CN-10/15.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 tại các chợ buôn bán gia cầm sống ở tỉnh Quảng Nam.
- Xác định nhánh của các chủng virus cúm A/H5N1, A/H5N6 thu được tại tỉnh Quảng Nam.
- Xác định một số đặc tính sinh học của các chủng virus cúmA/H5N1, A/H5N6 thu được tại tỉnh Quảng Nam.
Ý nghĩa khoa học của đề tài
Nghiên cứu đã xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 trên gà, vịt tại một số chợ ở Quảng Nam Kết quả này sẽ giúp đề xuất các biện pháp quản lý hiệu quả đối với việc buôn bán gia cầm sống tại các chợ, nhằm đảm bảo an toàn cho sức khỏe cộng đồng.
Virus CGC độc lực cao đã được phân lập thành công, phục vụ cho công tác chẩn đoán và lưu giữ giống virus Việc này tạo điều kiện cho việc phát hiện sớm những nguy cơ dịch CGC, từ đó nâng cao hiệu quả trong công tác phòng và chống bệnh CGC.
Giải trình tự gen các chủng virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 được thực hiện để xác định clade của virus cúm đang lưu hành tại tỉnh Quảng Nam Việc này không chỉ giúp theo dõi sự biến đổi của virus mà còn hỗ trợ trong công tác quản lý dịch bệnh và đánh giá hiệu quả của vacxin tại khu vực này.
Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu
Đối tượng - vật liệu nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, mẫu dịch ngoáy hầu họng của gà và vịt được thu thập tại các chợ gia cầm ở tỉnh Quảng Nam trong khoảng thời gian 6 tháng cuối năm 2016 và 6 tháng đầu năm 2017 Mỗi tháng, 90 mẫu swab hầu họng được lấy, bao gồm 30 mẫu từ gà và 60 mẫu từ vịt, tại 3 chợ thuộc 3 huyện khác nhau.
Phôi trứng gà 8-10 ngày tuổi (lấy từ gà khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vacxin cúm gia cầm).
Tế bào xơ phôi gà (tế bào xơ phôi được làm từ trứng gà có phôi 8-10 ngày tuổi).
Kít tách chiết ARN: bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat #
Mastermix: Sử dụng kít rRT-PCR Invitrogen superscriptIII qRT-PCR PCR superMix (Cat No 11306-016, Invitrogen)
Primer và probe matrix thiết kế đặc hiệu cho virus cúm
A/H5N1, H5N6 Primer và kít để giải trình tự gen
Nội dung nghiên cứu
3.4.1 Xác định được tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1,
A/H5N6 Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A trên gà, vịt.
Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5 trên gà, vịt.
Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 trên gà và vịt là rất quan trọng Nghiên cứu cũng sẽ theo dõi sự lưu hành của các virus này theo tháng để hiểu rõ hơn về xu hướng lây lan Đồng thời, việc xác định nhánh của các chủng virus A/H5N1 và A/H5N6 thông qua giải trình tự gen HA sẽ giúp nâng cao hiểu biết về đặc điểm di truyền và sự biến đổi của virus.
3.4.2 Xác định được một số đặc tính sinh học của virus cúm
Tính thích ứng trên phôi gà.
Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà.
3.5.1 Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1, A/H5N6
3.5.1.1 Phương pháp tách chiết ARN
Các mẫu swab trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và chiết tách ARN bằng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #
74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất dưới đây:
- Nhỏ 200 l mẫu vào ống ly tâm loại 1,5 ml cùng với 600 l Qiagen buffer RLT có 1 % -ME, lắc đều trên máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.
- Thêm 500 l etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.
- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ
10000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 700 l dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc.
- Nhỏ 500 l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở
10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.
- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ ống thu.
Để chuẩn bị ống thu ARN, đầu tiên, đặt cột lọc vào ống và thêm 50 μl nước sạch nuclease vào cột Sau đó, ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút, sau đó loại bỏ cột lọc và giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.
- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 o C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR Nếu để sau 24 giờ, nên bảo quản mẫu ở âm
20 o C hoặc nhiệt độ thấp hơn.
3.5.1.2 Phương pháp Real time RT-PCR (rRT-PCR) xác định virus cúm A/H5N1, A/H5N6
Thực hiện phản ứng Real time RT-PCR (rRT-PCR) với các cặp mồi và probe thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo quy trình chẩn đoán TCVN 8400-26:2014 Bảng 3.1 liệt kê các primer và probe cần thiết để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1, A/H5N6.
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T
Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì
- Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng Real time RT-PCR Hỗn hợp phản ứng
- Chu trình nhiệt của phản ứng:
+ Chu trình 40 vòng: 95 o C trong 10 giây + 58 o C trong 50 giây. 3.5.2 Phương pháp giải trình tự gen
3.5.2.1 Phương pháp nhân gen HA
- Nhân đoạn gen HA bằng phản ứng RT-PCR (PCR phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu (Bảng 3.3).
Bảng 3.3 Trình tự primer để nhân gen HA Tên primer
- Pha master mix để chạy phản ứng PCR: Sử dụng kít PCR superMix (Cat No 11306-016, Invitrogen) và các thành phần phản ứng khác (Bảng 3.4)
+ 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 61 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút
+ 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 59 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút
+ 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 57 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút
+ Chu trình 35 vòng: 95 °C trong 10 giây + 55 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút.
Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng RT-PCR
3.5.2.2 Phương pháp xây dựng cây phả hệ
- Sử dụng phần mềm Bioedit 7 để thực hiện việc so sánh các chuỗi trình tự (Alignment).
Sử dụng phần mềm MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) để lập cây phả hệ cho virus cúm thông qua chuỗi gen HA, áp dụng phương pháp Neighbor-joining (NJ) Cây phả hệ này so sánh các virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 thuộc các clade khác nhau, với gốc là virus clade 2.3.2.1c A/Hong_Kong/6841/2010 (H5N1) và A/chicken/Jiangxi/NCDZT1126/2014 (H5N6).
3.5.3 Phương pháp phân lập virus trên tế bào xơ phôi và trứng gà có phôi
Bệnh phẩm là dịch swab từ gà được thu thập từ ba chợ ở tỉnh Quảng Nam Quy trình xử lý bao gồm lắc ống dịch swab có tăm bông, ly tâm, và chuyển dịch nổi sang ống 1,5ml Cuối cùng, dịch được vô khuẩn bằng kháng sinh.
Sử dụng phôi trứng gà 8-10 ngày tuổi.
Tiêm 0,2 ml dịch bệnh phẩm vào xoang niệu mô của phôi trứng gà và ấp ở nhiệt độ 37°C trong 96 giờ Hàng ngày soi trứng, thu trứng chết và kiểm tra bằng phản ứng HA để xác định khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà Đồng thời, thực hiện phản ứng HI với kháng thể chuẩn chống virus cúm gia cầm và virus Newcastle nhằm giám định virus phân lập được.
Phôi trứng cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8 độ C ít nhất 2 giờ trước khi thu hoạch dịch niệu mô Sử dụng syring 5ml hoặc 10ml để thu thập dịch niệu mô bằng cách đâm xuyên qua nắp buồng hơi Sau đó, dịch niệu mô được chia thành nhiều ống nhỏ với dung tích 0,5ml mỗi ống và được lưu trữ ở nhiệt độ -70 độ C.
3.5.4 Xác định chỉ số EID 50 Để tính EID 50 , virus được pha loãng thành nhiều nồng độ theo cơ số 10 và tiêm và xoang niệu mô của phôi trứng, mỗi nồng độ 5 phôi, mỗi phôi 0,1ml dịch virus, ấp ở tủ ấp 37 0 C tới 96 giờ.
Kiểm tra trứng hàng ngày để phân loại phôi sống và phôi chết, thu thập trứng sống và trứng chết, cũng như thu hoạch nước trứng Thực hiện phản ứng HA với nước trứng, và những mẫu có phản ứng HA dương tính sẽ được xác định là nhiễm virus A/H5N1 hoặc A/H5N6.
Sử dụng công thức Reed- Meunch để xác định chỉ số EID 50 3.5.5 Xác định chỉ số TCID 50
Sử dụng môi trường tế bào xơ phôi từ phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi là phương pháp hiệu quả để chuẩn độ virus cúm gia cầm Tế bào được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng với mật độ 5 x 10^4 tế bào/100 µl mỗi giếng Virus được pha loãng ở các nồng độ từ 10^-2 đến 10^-8 trong môi trường Eagle's MEM, với mỗi nồng độ được thực hiện trên 5 giếng Sau 2 ngày, quan sát hiện tượng bệnh lý tế bào (CPE) để đánh giá sự nhiễm virus.
Sử dụng công thức Reed- Meunch để xác định chỉ số EID 50 3.5.6 Phương pháp Reed- Meunch
Sử dụng bảng tổng hợp số liệu (bảng 3.5) để tính toán chỉ số EID 50 và TCID 50
Bảng 3.5 tổng hợp số liệu cần thiết để tính toán chỉ số EID 50 và TCID 50 Độ pha loãng bao gồm cả độ pha có 100% số trứng bị nhiễm virus (HA dương tính) và độ pha không có nhiễm (HA âm tính).
Công thức tính như sau:
Số trứng không nhiễm virus (HA âm tính) - - - - -
Số tích lũy (cộng dồn)
Nhiễ Khôn m g Tổng virus nhiễ cộng
Tỷ lệ nhiễm cận trên 50%-50 Chỉ số =
Tỷ lệ nhiễm cận trên 50%- Tỷ lệ nhiễm cận dưới 50%
Giá trị EID 50 và TCID 50 được xác định dựa trên hiệu giá pha loãng cận trên 50% kết hợp với chỉ số tính được Ví dụ, nếu chỉ số tính được là 0,5 và độ pha loãng virus cao nhất đạt tỷ lệ nhiễm 50% là 10^-7, thì chuẩn độ của virus sẽ là 10^-7,5.
3.5.7 Phương pháp HA, HI giám định virus
3.5.7.1 Phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA)
Phương pháp HA được tiến hành phản ứng trên đĩa microtier 96 giếng đỏy chữ v (tổng lượng hỗn dịch là 75àl/ giếng), cỏc bước tiến hành như sau:
- Cho 25 àl dung dịch PBS pH 7,2 vào cỏc giếng của đĩa phản ứng.
- Cho 25 àl dung dịch chứa virus (nước trứng) vào giếng thứ nhất và bắt đầu pha loãng kháng nguyên theo cơ số 2 từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 11
- Nhỏ 25 àl dung dịch PBS vào cỏc giếng từ 1 đến giếng 12.
Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu gà 1% (lấy từ gà khỏe mạnh) vào các giếng từ 1 đến 12 Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 15-30 phút trước khi đọc kết quả ngưng kết.
Hiệu giá ngưng kết hồng cầu gà (HA) là nồng độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ngưng kết toàn phần.
3.5.7.2 Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phương pháp HI được thực hiện trên đĩa microtiter 96 giếng đáy chữ V Sau khi xác định hiệu giá HA của virus, virus được pha chế thành dung dịch kháng nguyên với 4 đơn vị HA Các bước tiến hành phản ứng sẽ được thực hiện theo quy trình đã định.
- Cho 25 àl dung dịch PBS pH 7,2 vào cỏc giếng của đĩa phản ứng.
- Cho 25 àl khỏng huyết thanh chuẩn A/H5N1, A/H5N6 đó biết được pha loãng với PBS theo cơ số 2.
- Sau đú nhỏ vào mỗi giếng 25 àl dung dịch khỏng nguyờn 4 đơn vị HA, để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Tiếp tục nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu gà 1% vào cỏc giếng, để 15-30 phút và đọc kết quả.
Hiệu giá ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) là mức độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà vẫn có khả năng ức chế hoàn toàn quá trình ngưng kết hồng cầu Trong quá trình thực hiện phản ứng HI với kháng huyết thanh được chế từ chồn (ferret), huyết thanh cần được pha loãng ban đầu ở tỷ lệ 1/10, sau đó tiếp tục pha theo tỷ lệ cơ số 2.