Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
- Tuyến trùng Meloidogyne sp được thu trên vườn hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông;
- Các vườn hồ tiêu thời kỳ kinh doanh;
- Một số chế phẩm bảo vệ thực vật sử dụng trong thí nghiệm thử thuốc.
3.1.2.1 Dụng cụ sử dụng tách lọc và đếm tuyến trùng:
- Hệ thống phễu Baermann, rây lọc tuyến trùng;
Bình xịt, bình tia, máy xay, rây lọc, giấy thấm, ống tuýp nhỏ đường kính 1,2 cm và cao 75 mm, đĩa petri kẻ ô, cùng với đồng hồ đếm là những dụng cụ thiết yếu trong quá trình làm tiêu bản tuyến trùng.
- Lam kính, lamen, desicator, đèn cồn;
- Chén lõm,kim gắp tuyến trùng, ống đồng, đèn cồn;
3.1.2.3 Vật dụng sử dụng trong thử thuốc
- Chậu nhựa, đất sạch (hấp khử trùng);
- Cốc đong, đĩa petri nhựa đường kính 5cm;
- Chế phẩm sinh học, thuốc hóa học.
- Formalin 4- 6%, Glycerin, kháng sinh Steptomycine;
- Hóa chất dùng trong tách DNA và chạy PCR.
- Kính lúp soi nổi (Nikon SMZ1500);
- Kính hiển vi quang học;
- Máy chạy điện di, máy chụp băng điện di.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu thành phần loài tuyến trùng chính hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
3.2.2 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái chủ yếu và đặc điểm phân tử của loài tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne incognita) 3.2.3 Nghiên cứu diễn biến phát sinh gây hại của quần thể tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne incognita) hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
3.2.4 Thử nghiệm hiệu lực phòng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu của một số chế phẩm bảo vệ thực vật
3.3.1 Nghiên cứu thành phần loài tuyến trùng chính hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
3.3.1.1 Thu thập mẫu đất và mẫu rễ hồ tiêu
Chúng tôi đã chọn 5 vườn tiêu tiêu biểu từ các địa phương sản xuất hồ tiêu tập trung tại huyện Đăk Song, Đắk Nông Mỗi vườn sẽ được thu thập 6 cây, bao gồm 3 cây khỏe mạnh và 3 cây có biểu hiện vàng lá Những vườn có ít cây bệnh và nhiều cây khỏe sẽ được lấy mẫu cây khỏe và cây bệnh để phục vụ cho việc phân tích mẫu trong khu vực đó.
Chúng tôi thu thập mẫu rễ và mẫu đất dưới tán cây hồ tiêu, bao gồm cả cây có biểu hiện bệnh vàng lá (chết chậm) và cây khỏe mạnh, ở độ sâu từ 15-20 cm Mỗi cây được điều tra tại 3 điểm theo hình tam giác đều, lấy gốc cây làm trung tâm Mỗi mẫu rễ có trọng lượng từ 20-30 g, trong khi mỗi mẫu đất nặng khoảng 500 g.
Hình 3.1 Vị trí lấy mẫu
Mẫu đất và rễ cần được bảo quản trong túi nilon, ghi rõ ngày tháng và địa điểm lấy mẫu Sau khi thu thập, mẫu phải được mang về phòng thí nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ từ 5-10 độ C để tiến hành phân tích sau.
+ Địa điểm điều tra: tại Đăk Song, Đăk Nông.
Thời gian điều tra diễn ra hai lần mỗi năm, vào đầu mùa mưa vào tháng 5 và cuối mùa mưa vào tháng 9, khi có sự đa dạng loài phong phú nhất trong vườn hồ tiêu.
+ Tách tuyến trùng trong đất và rễ theo phương pháp của Kirjanova and Krall, 1969; Nguyễn Vũ Thanh và Nguyễn Ngọc Châu, 1992.
Để phân tích mức độ gây hại và số lượng tuyến trùng ở rễ, từ mỗi mẫu thu được, cần lấy trung bình 5g rễ và 250g đất Tuyến trùng sẽ được tách lọc từ mẫu đất bằng phương pháp lọc tĩnh, trong khi tuyến trùng từ rễ sẽ được tách theo phương pháp của Nguyễn Ngọc Châu (2003).
- Lọc tuyến trùng từ đất
Hình 3.2 Phân loại mẫu và tiến hành lọc mẫu đất
Hệ thống lọc tuyến trùng được thiết kế dựa trên phương pháp Baermann, bao gồm một phễu thủy tinh có đường kính 13,5 cm và cuống dài 8 cm Phần dưới cuống phễu kết nối với ống silicon đường kính khoảng 1,5 cm, dài 9,5 cm, và tiếp theo là ống tuýp đường kính 1,2 cm, cao 7,5 cm Cốc đựng đất bằng nhựa có đường kính 7,6 cm và cao 5 cm, với đáy cốc là lưới rất mịn đặt trên phễu Hệ thống lọc được đặt trên các giá sắt cao 30 cm và trên mặt đá để đảm bảo ổn định và tránh rung động.
+ Lắc đều túi mẫu đất, mỗi mẫu lấy ra 250 g cho vào các cốc đựng đất như mô tả ở trên.
+ Làm ẩm đất bằng cách dung bình phun tay phun nhẹ đều lên mặt
+ Cho nước vào phễu, ước lượng mực nước sao cho khi cho cốc chứa đất vào thì lớp nước sẽ ngập bề mặt của đất.
+ Nhẹ nhàng đặt cốc đất vào phễu, bổ sung thêm nước vào phễu nếu cần
+ Thời gian lọc là 48 giờ.
+ Khi thu mẫu, nhẹ nhàng tháo ống nghiệm ra khỏi ống silicon, ghi nhãn, đậy nắp và giữ trong tủ lạnh.
Cho mẫu tuyến trùng đã lọc vào hộp petri chia ô, sau đó đặt lên kính hiển vi soi nổi Tiến hành đếm số lượng tuyến trùng theo số lượng bình quân trên mỗi ô hoặc đếm toàn bộ mẫu.
- Lọc tuyến trùng từ rễ
Theo phương pháp xay rễ được mô tả trong “Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ” của Nguyễn Ngọc Châu (2003), gồm các bước:
+ Mẫu rễ rửa sạch, lau khô, mỗi mẫu cân lấy 5 g, dùng kéo cắt nhỏ (chiều dài khoảng 5 mm).
Để thu tuyến trùng, cho mẫu đã cắt vào cối xay sinh tố và thêm nước ngập lưỡi dao Xay trong 10 giây, nghỉ 10 giây, tiếp tục xay 10 giây, nghỉ 5 giây và xay thêm 5 giây Sau khi xay, mở nắp và xả nước vào để làm sạch các phần rễ bám vào nắp và thành cối, giúp thu được tuyến trùng ở đáy cối Lọc qua lưới để loại bỏ gỗ và cặn bã thô, sau đó xả nước mạnh để tuyến trùng trong hỗn hợp lắng xuống dưới Cuối cùng, tiến hành lọc bằng lưới 38.
+ Thu mẫu vào hộp nhựa nhỏ bằng cách dùng bình phun tia gạn tuyến trùng vào trong lọ.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Đếm số lượng tuyến trùng trên 5g rễ bằng kính lúp soi nổi (Nikon SMZ1500).
Tuyến trùng kí sinh thực vật được thu thập từ các phương pháp tách lọc sẽ được cố định và bảo quản trong dung dịch TAF, theo phương pháp của Courtney, Polley và Miller (1955).
+ Theo các tài liệu phân loại của Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn
Vũ Thanh (2000), Siddiqi (2000) Castillo and Vovlas (2007), Perry and Moens (2009), Ryss (2002).
3.3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và phân tử của loài tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne incognita) hại hồ tiêu
- Xác định một số đặc điểm hình thái cơ bản của loài tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita.
Nghiên cứu mô tả các đặc điểm hình thái cơ bản của các loài tuyến trùng gây nốt sưng bằng kính kính lúp Nikon SMZ1500, dựa trên phương pháp của các tác giả Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1999), Loof P.A.A (1991), Nguyễn Ngọc Châu (2003), cùng với Castillo và Vovlas (2007).
Làm tiêu bản tuyến trùng và phân loại theo phương pháp của Franklin and Goodey (1949).
Để chuẩn bị mẫu tuyến trùng, gắp khoảng 5-10 tuyến trùng lên lam lõm, nhỏ một lượng Lactophenon hoặc glycerol vừa đủ, sau đó đậy lamen và cố định bằng bông Canada Nếu không có bông Canada, có thể sử dụng lớp paraphin mỏng quanh vết lõm và hơ trên ngọn lửa nhẹ để gắn kín Để làm tiêu bản mẫu cutin vùng chậu con cái của Meloidogyne, đưa con cái vào môi trường axit lactic 45%, sau đó cắt phần đầu bằng dao mổ Nhấn nhẹ từ đuôi đến vết cắt để đẩy dịch bên trong ra ngoài, cắt 1/3 phía sau cơ thể thành một tấm chứa vulva và anus Cuối cùng, lật úp các tấm đã cắt và làm sạch bằng đầu kim gắp, rồi đưa vào giọt glycerin để hoàn thiện tiêu bản (David et al., 2009).
Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái
Trước khi phân loại, tuyến trùng sẽ được làm tiêu bản cố định ở giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm để quan sát dưới kính hiển vi quang học Phương pháp này cho phép phân biệt nhanh chóng các giống qua các đặc trưng hình thái quan trọng, bao gồm cấu trúc vùng đầu, vị trí lỗ bài tiết, đường bên, và cấu trúc dạng đuôi ở ấu trùng Ngoài ra, cần chú ý đến số lượng và vị trí nhú sinh dục, hình dạng gai giao cấu và gai đệm ở con đực, cũng như hình dạng, cấu trúc vulva và đuôi của con cái.
Phương pháp làm tiêu bản bằng glycerol – ethanol (Seinhorst, 1959)
Tuyến trùng sau khi được xử lý bằng nước nóng ở nhiệt độ 50-60 độ C sẽ được bảo quản trong lọ thủy tinh chứa dung dịch cố định TAF Sau một tuần, chúng sẽ được chuyển sang đĩa thủy tinh sâu với 0,5ml dung dịch I và đặt trong bình thủy tinh kín có chứa khoảng 1/10 thể tích cồn 96% với áp suất bão hòa Bình thủy tinh này cần được đặt trong tủ ấm ở 40 độ C ít nhất 12 giờ Sau thời gian này, các đĩa thủy tinh sẽ được lấy ra và tiếp tục để trong tủ ấm, bổ sung dung dịch II sau mỗi 2-3 giờ khoảng 3-4 lần, và tiếp tục ủ trong tủ ấm tối thiểu 12 giờ Cuối cùng, tuyến trùng sẽ sẵn sàng để sử dụng làm tiêu bản.
Trong phân loại tuyến trùng, các số đo đóng vai trò quan trọng, với công thức số đo là hệ thống các chỉ số để đo kích thước các phần cơ thể và tỷ lệ giữa chúng Công thức này không chỉ được áp dụng rộng rãi trong phân loại mà còn là yêu cầu bắt buộc khi mô tả một loài tuyến trùng Nhiều công thức số đo khác nhau tồn tại, trong đó có công thức theo de Man (1880) Các chỉ số theo de Man được xác định với n là số lượng mẫu vật cần đo và L là chiều dài cơ thể.
EP: Chiều dài từ đỉnh đầu đến lỗ bài tiết
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2015 đến tháng 12/2016;
+ Bộ môn Côn Trùng, Viện Bảo vệ thực vật.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Tình hình sản xuất hồ tiêu tại Đăk Nông và thành phần loài tuyến trùng chính gây hại trên hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
PHẦN LOÀI TUYẾN TRÙNG CHÍNH GÂY HẠI TRÊN HỒ TIÊU TẠI ĐĂK
4.1.1 Tình hình sản xuất hồ tiêu tại Đăk Nông Đăk Nông là một tỉnh vùng Tây Nguyên có điều kiện tự nhiên rất phù hợp để phát triển nhiều loại cây công nghiệp dài ngày như cà phê, hồ tiêu, điều, cao su Theo Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Đăk Nông, diện tích trồng hồ tiêu của tỉnh năm 2004 là 6,544 ha Năm 2005 diện tích hồ tiêu giảm xuống chỉ còn 5.575 ha do bị dịch bệnh Tuy nhiên đến năm 2015, diện tích hồ tiêu của Đăk Nông tăng rất nhanh lên tới 16.350 ha, đến tháng 9/2016 điện tích hồ tiêu đã đạt 20,579 ha (trồng mới là 4.229 ha, cây thời kỳ kiến thiết cơ bản 6.763 ha và kinh doanh là 9.578 ha) Trong khi đó, theo đinh hướng của của tỉnh Đăk Nông đến năm 2020, diện tích trồng hồ tiêu ổn định là 10.000 ha.
Hiện nay, diện tích trồng hồ tiêu tại Đăk Nông đã vượt quá mục tiêu đề ra, đạt 10.579 ha Các huyện chủ yếu sản xuất tiêu bao gồm Đăk Song, Đăk RLấp, Cư Jut, Đăk Mil và Tuy Đức, trong đó Đăk Song dẫn đầu với diện tích 8.000 ha.
Bảng 4.1 Diện tích, sản lượng hồ tiêu tại tỉnh Đăk Nông năm 2016 Địa điểm Tổng số
Diện tích cho sp (ha)
NS trên DT cho SP
Trong những năm gần đây, giá hạt tiêu tại Đăk Nông luôn duy trì ở mức cao và ổn định, điều này đã thúc đẩy nhiều hộ gia đình chuyển đổi từ trồng cà phê sang trồng hồ tiêu.
Sự gia tăng nhanh chóng diện tích trồng tiêu đang gây khó khăn trong việc kiểm soát, với nhiều hộ trồng áp dụng biện pháp thâm canh không hợp lý như bón phân không cân đối và thừa đạm, trong khi chưa chú trọng đến phân hữu cơ và biện pháp phòng ngừa dịch hại tổng hợp Hệ quả là nhiều loại dịch hại nguy hiểm, đặc biệt là nấm đất và tuyến trùng, đã bùng phát, dẫn đến tình trạng chết hàng loạt ở các vườn tiêu Tính đến tháng 6/2016, toàn tỉnh Đăk Nông ghi nhận 455,8 ha tiêu bị nhiễm bệnh, trong đó 311,2 ha nhiễm nhẹ, 44,25 ha nhiễm nặng và 90,78 ha bị nhiễm tuyến trùng.
57 ha bị chết Nhiều hộ nông dân lâm vào cảnh nghèo đói, mất vốn làm ăn, không có khả năng chi trả ngân hàng.
4.1.2 Thành phần loài tuyến trùng chính gây hại trên hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
Tuyến trùng là một trong những tác nhân gây hại nghiêm trọng cho hồ tiêu, dẫn đến triệu chứng vàng lá chết chậm Khi cây hồ tiêu bị vàng lá, năng suất và chất lượng giảm sút, ảnh hưởng tiêu cực đến thu nhập của người trồng Ngoài việc gây hại trực tiếp, tuyến trùng còn tạo điều kiện cho nấm, vi khuẩn, virus xâm nhập, hình thành các tổ hợp bệnh khác nhau, khiến vườn hồ tiêu bị tàn phá nhanh chóng và khó phục hồi.
Triệu chứng của tuyến trùng ký sinh rễ cà phê bao gồm nốt sưng trên rễ, gây tổn thương và biến dạng bộ rễ, dẫn đến hiện tượng thối rễ và chết cây Khi bộ rễ bị phá hủy, cây sẽ còi cọc, kém phát triển, lá vàng, và quả nhỏ với chất lượng kém Nếu tổn thương nặng, cây có thể chết hoàn toàn Tác hại do tuyến trùng thường ít được chú ý vì chúng gây hại ở dưới mặt đất, và khi triệu chứng xuất hiện trên bề mặt, cây đã bị tổn thương nghiêm trọng, làm giảm hiệu quả biện pháp phòng trừ.
Hình 4.1 Vườn hồ tiêu vàng lá, rễ tiêu bị tuyến trùng nốt sưng gây hại
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Năm 2015, nghiên cứu đã tiến hành thu thập mẫu rễ và đất từ các cây hồ tiêu bị vàng lá tại xã Thuận Hà, huyện Đăk Song, Đăk Nông vào đầu và cuối mùa mưa để xác định thành phần loài tuyến trùng gây hại Thời điểm này được cho là có sự phong phú nhất về loài trên đồng ruộng Các mẫu thu thập được đã được tách lọc và giám định, với kết quả số lượng loài tuyến trùng tại Đăk Song, Đăk Nông trong năm 2015 được trình bày trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2.Thành phần loài tuyến trùng gây hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông, 2015
Kết quả từ Bảng 4.2 cho thấy rằng thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên hồ tiêu tại Đăk Song – Đăk Nông rất đa dạng, với 7 loài thuộc 6 họ và 3 bộ khác nhau, bao gồm Tylenchida, Triplonchida và Dorylaimida Trong số các họ đã xác định, họ Heteroderidae có số loài phong phú nhất với 2 loài, trong khi các họ khác chỉ có một loài mỗi họ.
So với kết quả điều tra năm 2013, nghiên cứu năm 2015 đã phát hiện thêm loài Pratylenchus sp trong mẫu thu thập từ vườn tiêu tại Đak Song – Đăk Nông Loài này gây hại chủ yếu trên cà phê, nhưng cũng ảnh hưởng đến hồ tiêu Để đánh giá mức độ gây hại của các loài tuyến trùng tại Đăk Song – Đăk Nông, chúng tôi đã tính toán tần suất xuất hiện và mật độ trung bình của chúng trong mẫu đất và rễ hồ tiêu.
Bảng 4.3 Tần suất xuất hiện và mật độ tuyến trùng ký sinh hồ tiêu tại Đăk Song – Đăk Nông, 2015
Ghi chú: Số liệu mật độ của các loài tuyến trùng được thể hiện qua giá trị
Kết quả từ Bảng 4.3 cho thấy, trong mẫu đất và mẫu rễ hồ tiêu, chủ yếu phát hiện sự xuất hiện của tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita Loài tuyến trùng này xuất hiện trong 88,5% các mẫu đất và 62,8% các mẫu rễ hồ tiêu.
% trong các mẫu rễ với mật độ tương đối cao (560,6 con/100 gr đất và 81,6 con/5g rễ).
Loài Rotylenchulus reniformis được phát hiện với tần suất cao, chiếm 30,5% mẫu đất và 3,5% mẫu rễ, với mật độ 229,1 con/100 gr đất và 6,2 con/5 gr rễ Trong khi đó, Meloidogyne spp xuất hiện ở 5,6% mẫu đất và 4,7% mẫu rễ, với mật độ lần lượt là 15 con/100 gr đất và 22 con/5 gr rễ Các loài khác có mặt ít hơn và mật độ cũng tương đối thấp.
Kết quả điều tra cho thấy trong mẫu rễ hồ tiêu có sự hiện diện của các loài tuyến trùng như Meloidogyne incognita, Meloidogyne spp và Rotylenchulus reniformis, với Meloidogyne incognita chiếm ưu thế (tần suất 62,8% và mật độ trung bình 81,6 con/5 gr rễ) Điều này khẳng định rằng Meloidogyne incognita là loài tuyến trùng gây hại chủ yếu trên hồ tiêu, phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh.
Nghiên cứu về loài Meloidogyne incognita đã được thực hiện sâu sắc, tập trung vào các đặc điểm hình thái và phân tử của loài này, dựa trên các ghi nhận từ các tác giả như Trịnh T T Thủy (1993), Lê Đức Khánh (2005) và các cộng sự (2014).
Một số đặc điểm hình thái và phân tử của loài tuyến trùng gây nốt sưng
4.2.1 Một số đặc điểm hình thái cơ bản của loài tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita
Giống Meloidogyne có đặc điểm lưỡng hình sinh dục, với ấu trùng có hình dạng giống giun và con cái trưởng thành có hình dạng quả lê hoặc hình cầu, thường nằm sâu trong mô rễ Đường kính cơ thể từ 0,5 - 0,7 mm, với cổ cân đối và vulva nằm gần hậu môn Vỏ cutin màu trắng nhạt, mỏng và phân đốt, trong khi kim hút ngắn và có sự phân hóa trung bình Vùng đầu kitin hóa không mạnh và lỗ bài tiết nằm gần gốc stylet Hai nhánh sinh dục cuộn lại và trứng được đẻ bên ngoài cơ thể vào túi gelatin.
Hình 4.3 Con cái trong mô rễ hồ tiêu (A) và bọc trứng (B)
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Con cái có hình dạng cơ thể từ quả lê đến hình cầu không cân đối, với cổ ngắn và mấu đuôi rất nhỏ gần như không thấy Stylet có núm gốc tròn và phần chóp cong về phía lưng, trong khi vị trí lỗ bài tiết nằm ngay sau gốc stylet Diều giữa có kích thước từ 30 - 32 x 23 – 27 μm, với perineal pattern có hình oval, hơi kéo dài về phía bụng, có vòm lưng cao và không bị bóp lại ở hai bên Các đường vân không liên tục, và nếu không bị cắt gần phía vulva, các vân luôn gấp khúc mạnh mẽ, tạo thành những làn sóng dồn Vùng bên có thể không có hoặc chỉ thể hiện dạng fork tại chỗ nối giữa các vân vùng lưng và bụng.
Hình 4.4 Phần đầu của con cái Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.5 Tiêu bản mẫu cutin vùng chậu con cái của Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Con đực có hình dạng giống như giun, sống tự do trong đất và có chiều dài từ 1-2 mm Khi được cố định trong dung dịch nóng, cơ thể thường xoắn vặn 180 độ quanh trục Đặc điểm nổi bật bao gồm stylet khỏe, vùng đầu kitin hóa mạnh và đuôi ngắn hình cầu Gai giao cấu phát triển mạnh, trong khi không có cánh đuôi.
Hỡnh 4.6 Phần đầu con đực Meloidogyne incognita với kim hỳt (thước 10 àm)
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.7 Phần đuôi con đực với gai giao cấu
Ấu trùng có hình dạng cân đối giống như giun, dài từ 0,3 đến 0,5 mm Phần đầu của ấu trùng có stylet và vùng kitin hóa yếu, trong khi đuôi có hình chóp với phần cuối thường là khoảng trống có chiều dài khác nhau.
Hình 4.8 Hình thái của ấu trùng Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.9 Phần đầu của ấu trùng Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.10 Phần đuôi của ấu trùng Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.11 Con đực (trên) và con cái (dưới)
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.12 Hình thái của trưởng thành đực Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Hình 4.13 Hình thái của trưởng thành cái Meloidogyne incognita
Nguồn: Nguyễn Thị Mai Lương
Chúng tôi đã tiến hành làm mẫu tiêu bản cho ấu trùng tuổi 2 và trưởng thành của Meloidogyne incognita, sau đó sử dụng kính hiển vi quang học kết hợp với hệ thống camera và phần mềm đo ảnh để thu thập dữ liệu Kết quả được trình bày trong Bảng 4.4.
Bảng 4.4 Các chỉ số đo của ấu trùng tuổi 2, con cái và con đực loài
2 Chiều dài kim hút (stylet)
3 chiều rộng gốc kim hút
4 chiều dài từ đỉnh đầu đến giữa thực quản
5 chiều dài từ giữa thực quản đến lỗ bài tiết
6 chiều rộng cơ thể vị trí lỗ bài tiết
Kết quả theo dõi các chỉ tiêu hình thái ở ấu trùng tuổi 2, trưởng thành cái và trưởng thành đực của Meloidogyne incognita cho thấy sự phù hợp với nghiên cứu của Kaur & Attri (2013).
4.2.2 Đặc điểm phân tử của loài tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita Để khẳng định lại nhận dạng và những mô tả về đặc điểm hình thái loài Meloidogyne incognita ở trên,chúng tôi tiến hành làm mẫu DNA của loài tuyến trùng nốt sưng thu thập được tại Đăk Song, Đăk Nông Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR trên agarose gel thể hiện trên Hình 18 Kết quả cho thấy sản phẩm điện di có băng gọn, rõ, không có sản phẩm không đặc hiệu.
Hình 4.14 trình bày kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS trên gel agarose của hai mẫu tuyến trùng nốt sưng trên hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông (Viện Bảo vệ thực vật, 2015).
Chúng tôi đã thành công trong việc tách chiết và nhân gen (PCR) đoạn gen ITS từ hai mẫu tuyến trùng M incognita hại hồ tiêu thu thập tại Đăk Song, Đăk Nông Phân tích trình tự gen ITS cho thấy hai mẫu này gần nhất với chủng M incognita KU356192 trên hồ tiêu tại Tây Nguyên (Linh, L.T.M và Phap, T.Q., 2015) Cây phả hệ maximum likelihood (ML) được thiết lập từ kết quả trình tự vùng ITS của nghiên cứu sử dụng phần mềm MEGA 6 Phân tích cho thấy đoạn gen ITS của hai chủng tuyến trùng M incognita có mối liên hệ chặt chẽ với các chủng trên GenBank.
M incognita 2 trong nghiên cứu của chúng tôi đồng nhất với nhau và gần tương đồng, cùng nhóm với chủng M.incognita KU356192 trên hồ tiêu thu thập tại Tây Nguyên (Linh,L.T.M and Phap,T.Q., 2015).
Diễn biến phát sinh gây hại của quần thể tuyến trùng gây nốt sưng
4.3.1 Diễn biến mật độ quần thể tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita tại Đăk Song, Đăk Nông
Tuyến trùng Meloidogyne incognita là loài gây hại quan trọng cho hồ tiêu tại Tây Nguyên, đặc biệt ở Đăk Song, Đăk Nông Nhiều nghiên cứu cho thấy mật độ quần thể tuyến trùng liên quan chặt chẽ đến các yếu tố ngoại cảnh, đặc biệt là lượng mưa Để theo dõi mật độ loài tuyến trùng này, vào năm 2015, chúng tôi đã thu thập mẫu đất và mẫu rễ từ các vườn hồ tiêu bị vàng lá tại Đăk Song, Đăk Nông và phân tích tại Viện Bảo vệ thực vật Kết quả nghiên cứu được trình bày trong Bảng 4.5 và minh họa bằng đồ thị trong Hình 21.
Nghiên cứu cho thấy tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại cho cây hồ tiêu xuất hiện quanh năm, với mật độ cao ngay từ tháng 1 (173 con/100 gam đất, 54,5 con/5 gam rễ) Mật độ này giảm dần trong mùa xuân và đạt đỉnh vào đầu mùa mưa, cụ thể là tháng 4 (42,5 con) và tháng 5 (23 con/100 gam đất), trong khi cây hồ tiêu đang ra hoa Sau đỉnh cao vào tháng 4, mật độ tuyến trùng giảm trong tháng 6 và tháng 7, nhưng lại tăng mạnh vào tháng 9.
164,2 con/100 gam đất Sau đỉnh cao về mật độ trong tháng 9, mật độ tuyến trùng giảm dần trong các tháng mùa khô.
Vườn hồ tiêu tại Đăk Song - Đăk Nông đã tiến hành thu thập mẫu đất và rễ vào năm 2015 Kết quả nghiên cứu cho thấy mật độ tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita trong đất và rễ hồ tiêu tại khu vực này.
Mật độ quần thể tuyến trùng trong rễ có xu hướng tăng nhanh hơn so với trong đất, đặc biệt vào đầu năm, thời điểm mùa khô tại Đăk Nông Mật độ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong rễ bắt đầu cao từ tháng 3 với 203 con/5 gam rễ, sau đó giảm từ tháng 4 đến tháng 8 Tuy nhiên, mật độ này lại tăng trở lại vào tháng 9, đạt 223,3 con/5 gam rễ, khi quả đang ở giai đoạn vào chắc Sau đỉnh cao tháng 9, mật độ tuyến trùng trong rễ giảm dần nhưng lại đạt đỉnh cao một lần nữa vào tháng 11, thời điểm hồ tiêu chuẩn bị thu hoạch.
Hình 4.17 Diễn biến mật độ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong đất và rễ hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk
Hình 4.18 Diễn biến nhiệt độ và lượng mưa tại Đăk Nông năm 2015
Nghiên cứu về khả năng sinh sản của tuyến trùng Meloidogyne incognita trên hồ tiêu cho thấy, vào năm 2015, số lượng trứng trung bình trong bọc trứng được tách từ mô rễ bị sưng là 420 trứng/bọc trong tháng 7, cao hơn nhiều so với 193,5 trứng/bọc trong tháng 9 Sự chênh lệch này có thể liên quan đến mật độ tuyến trùng trong đất, thường đạt cao nhất vào tháng 8 và tháng 9.
Bảng 4.6 Số trứng trung bình/bọc của loài Meloidogyne incognita trong rễ hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông, năm 2015
Ghi chú: Số liệu số lượng trứng/ổ của tuyến trùng được thể hiện qua giá trị Mean ± STDEV (min – max)
4.3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến mật độ quần thể tuyến trùng gây nốt sưng hại hồ tiêu hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
4.3.2.1 Ảnh hưởng của đất trồng đến mật độ của tuyến trùng Meloidogyne incognita trong đất và rễ hồ tiêu
Yếu tố đất đai đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến mật độ tuyến trùng, đặc biệt là trong canh tác hồ tiêu tại Tây Nguyên Mặc dù phần lớn đất trồng hồ tiêu là đất bazan màu mỡ, nhưng cũng tồn tại một số diện tích đất xám Năm 2015, chúng tôi đã tiến hành theo dõi mật độ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong hai loại đất này trong các giai đoạn sinh trưởng và phát triển quan trọng của cây hồ tiêu, với kết quả được trình bày trong Bảng 4.7.
Bảng 4.7 Đặc điểm đất và mật độ tuyến trùng gây hại trong đất, rễ hồ tiêu tại Đăk Song - Đăk Nông, 2015
Ghi chú: *Mật độ tuyến trùng bình quân ở các thời kỳ:
Ra hoa rộ, quả phát triển, quả vào chắc và quả chín
Kết quả trình bày trong bảng 4.7.cho thấy tuyến trùng Meloidogyne incognita đều có khả năng phát triển trên cả hai loại đất trên.
Mật độ tuyến trùng trong rễ hồ tiêu trồng trên đất bazan (160,92 con/5 gam rễ) cao hơn đáng kể so với rễ hồ tiêu trên đất xám (81,5 con/5 gam rễ) với độ tin cậy 95% Trong khi đó, mật độ tuyến trùng trung bình trong đất hồ tiêu trồng trên đất đỏ bazan là 70,96 con/100 gam đất, cũng cao hơn so với đất xám (17,92 con/100 gam đất) Tuy nhiên, kết quả phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về mật độ tuyến trùng giữa hai loại đất này.
4.3.2.2 Ảnh hưởng của bón phân hữu cơ đến mật độ quần thể tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita trong đất và rễ hồ tiêu
Tại Tây Nguyên, nông dân trồng hồ tiêu đang áp dụng đa dạng loại phân bón, bao gồm cả phân vô cơ và hữu cơ Việc tăng cường sử dụng phân bón hữu cơ cùng với các sản phẩm bổ sung vi sinh vật có ích giúp kích thích sự phát triển của bộ rễ cây, gia tăng số lượng vi sinh vật có lợi trong đất và giảm thiểu sự xuất hiện của tuyến trùng gây hại.
Kết quả theo dõi mật độ quần thể tuyến trùng nốt sưng được thực hiện trên các vườn sử dụng phân hữu cơ và ít phân hữu cơ, tại các thời điểm quan trọng như cây ra hoa rộ, quả phát triển, quả vào chắc và khi quả chín, được trình bày trong Bảng 4.8.
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của phân hữu cơ tới mật độ tuyến trùng gây hại trong đất và rễ hồ tiêu tại Đăk Song – Đăk
Ghi chú: *Mật độ tuyến trùng bình quân ở các thời kỳ:
Kết quả theo dõi cho thấy mật độ quần thể tuyến trùng trung bình trong đất và rễ hồ tiêu tại vườn bón ít phân hữu cơ cao hơn so với vườn bón nhiều phân hữu cơ, với 145 con/5 gam rễ so với 99,95 con/5 gam rễ Tuy nhiên, không có sự khác biệt thống kê giữa hai phương pháp bón phân, có thể do lượng phân hữu cơ chưa đủ và chất lượng phân bón khác nhau Để cải thiện tình hình, cần nâng cao chất lượng phân bón hữu cơ và bổ sung các loài vi sinh vật có ích nhằm tăng cường sức đề kháng cho cây và hạn chế mật độ quần thể tuyến trùng.
4.3.2.3 Ảnh hưởng của các giống hồ tiêu đến mật độ quần thể tuyến trùng trên vườn hồ tiêu
Tại Tây Nguyên, đặc biệt là Đăk Nông, hiện nay có nhiều giống hồ tiêu được trồng, bao gồm tiêu Vĩnh Linh, tiêu Trâu, tiêu Phú Quốc và một số ít giống Lộc Ninh, trong đó tiêu Vĩnh Linh và tiêu Trâu là hai giống chủ yếu.
Năm 2015, chúng tôi điều tra mật độ tuyến trùng trên hai giống
Kết quả từ bảng 4.9 cho thấy tuyến trùng gây nốt sưng gây hại cho cả giống tiêu Vĩnh Linh và Tiêu Trâu ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây Cụ thể, mật độ tuyến trùng trong rễ của giống tiêu Vĩnh Linh là 162 con, cao hơn 91,17 con so với giống Tiêu Trâu với độ tin cậy 95%, cho thấy giống Vĩnh Linh bị hại nặng hơn Tuy nhiên, mật độ tuyến trùng trong đất trồng hai giống này không có sự khác biệt rõ rệt như trong rễ.
Bảng 4.9 Mật độ tuyến trùng gây hại trên các vườn hồ tiêu kinh doanh trồng các giống phổ biến tại Đăk Song – Đăk Nông, 2015
Ghi chú: *Mật độ tuyến trùng bình quân ở các thời kỳ:
Ra hoa rộ, quả phát triển, quả vào chắc và quả chín
4.3.2.4 Ảnh hưởng của cây ký chủ đến khả năng tồn tại của tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita Để tìm hiểu về khả năng tồn tại của tuyến trùng trong điều kiện không có thức ăn, năm 2015 chúng tôi tiến hành lấy đất ở các vườn hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng nặng và để hoang (không trồng bất cứ loại cây nào) và thường xuyên dọn sạch cỏ dại Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 4.10.
Bảng 4.10 Khả năng suy thoái mật độ quần thể tuyến trùng trong đất trồng hồ tiêu trong điều kiện không có nguồn thức ăn, Viện Bảo vệ thực vật, 2015
Trồng hồ tiêu Vĩnh Linh
Sau thí nghiệm 9 tháng (con/100g đất) 4,25 ± 2,2
Sau 6 tháng thí nghiệm, mật độ tuyến trùng gây nốt sưng đã giảm 88,58% và sau 9 tháng, giảm 92,12% Tuy nhiên, trứng của tuyến trùng này được bao bọc bởi lớp gelatin, cho phép chúng tồn tại lâu trong đất và nở nhanh khi gặp điều kiện thuận lợi, tiếp tục gây hại cho cây Do đó, để phòng trừ hiệu quả tuyến trùng gây nốt sưng, cần áp dụng biện pháp cắt nguồn thức ăn kết hợp với các biện pháp phòng trừ tổng hợp.
4.3.2.5 Ảnh hưởng của cây trồng xen đến khả năng tích lũy quần thể của tuyến trùng gây nốt sưng Meloidogyne incognita Để đánh giá khả năng tích lũy quần thể của tuyến trùng nốt sưng khi trồng xen cây ký chủ và một số loại cây trồng có khả năng ức chế hoặc dẫn dụ, năm 2015 chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trồng xen cây cúc vạn thọ và cây thì là trong các chậu đất trồng hồ tiêu có nhiễm tuyến trùng Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 4.11.
Bảng 4.11 Khả năng ức chế, dẫn dụ của cúc vạn thọ và cây thì là đối với tuyến trùng hại hồ tiêu tại Đăk Nông, 2015
Trồng hồ tiêu xen cúc
3 Trồng hồ tiêu xen thì là LSD 05
Mật độ Meloidogyne sp.(con/100 g đất)
Phòng trừ tuyến trùng nốt sưng bằng một só chế phẩm bảo vệ thực vật 52 1 Hiệu lực của các loại thuốc trừ tuyến trùng trong điều kiện phòng thí nghiệm
4.4.1 Hiệu lực của các loại thuốc trừ tuyến trùng trong điều kiện phòng thí nghiệm
Tuyến trùng là một loại dịch hại khó phòng trừ, tương tự như nhiều loại dịch hại khác trong đất Mặc dù một số thuốc hóa học như Furadan, Mocap và Nemacur có hiệu quả cao, nhưng chúng thường chỉ được sử dụng hạn chế trong vườn ươm do giá thành cao và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường khi sử dụng với lượng lớn Vì lý do này, việc sử dụng chế phẩm sinh học để phòng trừ tuyến trùng được khuyến khích, không chỉ bảo vệ môi trường mà còn giúp cây trồng phát triển cân đối và mang lại hiệu quả kinh tế.
Năm 2016, nghiên cứu đã thực hiện thử nghiệm với 6 loại thuốc, bao gồm 5 loại có nguồn gốc sinh học và 1 loại hóa học Kết quả của các thí nghiệm này được trình bày chi tiết trong Bảng 4.12.
Kết quả thử nghiệm hiệu lực của 6 sản phẩm phòng trừ tuyến trùng trong phòng thí nghiệm cho thấy chế phẩm Sông Lam 333 50 ND, AH No6, SH – BV1 và Marshal 5G đạt hiệu lực 100% chỉ sau 1 ngày xử lý Tiếp theo, chế phẩm Tervigo có hiệu lực 82,19%, trong khi chế phẩm AT đạt 80,82% sau 7 ngày xử lý.
Bảng 4.12 Hiệu lực của một số sản phẩm trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong phòng thí nghiệm, Viện Bảo vệ thực vật, 2016
4.4.2 Hiệu lực trừ tuyến trùng nốt sưng của một số chế phẩm bảo vệ thực vật trong điều kiện nhà lưới
Năm 2016, dựa trên kết quả đánh giá hiệu lực trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đã giới thiệu 4 loại chế phẩm bảo vệ thực vật để tiến hành đánh giá trong nhà lưới, bao gồm Sông Lam 333 50 ND, AH No6, SH – BV1 và Marshal 5 G Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng 4.13 và 4.14.
Bảng 4.13 Kết quả đánh giá hiệu lực của một số sản phẩm phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong đất ở điều kiện nhà lưới, Viện Bảo vệ thực vật, 2016
SH -BV1 Sông Lam 333 50ND
AH No6Marshal 5 G Đối chứng (nước
Kết quả đánh giá hiệu lực phòng trừ tuyến trùng gây nốt sưng trong điều kiện nhà lưới cho thấy thuốc hóa học Marshal 5 G đạt hiệu lực trừ tuyến trùng trong đất cao nhất với tỷ lệ 75,01% Ngoài ra, chế phẩm SH – BV1 cũng cho hiệu quả tương đối tốt trong việc kiểm soát tuyến trùng.
Sau một tháng xử lý, chế phẩm có hiệu lực cao nhất là Marshal, đạt 47,53% trong việc trừ tuyến trùng trong rễ Các chế phẩm Sông Lam 333 50 ND và AH No6 có hiệu lực trung bình thấp, lần lượt đạt 50,77% và 42,20% Còn SH – BV1 cho hiệu lực 41,90%, trong khi hai chế phẩm Sông Lam 333 50 ND và AH No6 chỉ đạt hiệu lực rất thấp, với 32,23% và 22,43%.
Bảng 4.14 Kết quả đánh giá hiệu lực của một số sản phẩm phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong rễ ở điều kiện nhà lưới, Viện Bảo vệ thực vật, 2016
SH -BV1 Sông Lam 333 50ND
Marshal 5 G Đối chứng (nước lã)
Trong điều kiện vườn ươm, thuốc hóa học Marshal 5G có thể được sử dụng để phòng trừ tuyến trùng hiệu quả Đối với sản xuất, các chế phẩm như SH – BV1, Sông Lam 333 50 ND hoặc AH No6 là lựa chọn tối ưu trong việc kiểm soát tổng hợp tuyến trùng trong đất.