Đối tượng, nội dung, nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
- 100 mẫu phân nền chuồng lợn được thu thập từ 50 hộ chăn nuôi lợn ở Thái Bình và 50 hộ tạihuyện Sóc Sơn – Hà Nội (mỗi hộ thu thập 1 mẫu).
- Các dụng cụ, hóa chất, môi trường dùng để nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn E.coli, bao gồm môi trường có tính đặc hiệu cao
Brilliance TM E.coli/coliform selective medium, Macconkey,…
- Các loại khoanh giấy kháng sinhdo hãng Oxoid cung cấp, gồm cúcefoperazone, (CFP, 3 rd , 75 àg), ceftriaxone (CRO, 3 rd , 30àg), cefuroxime
(CXM, 2 nd , 30 àg), ceftazidime (CAZ, 3 rd , 30 àg), cefamandole (MA, 2 nd , 30 àg), và ACM (amoxicillin 20àg /clavulanic acid 10àg).
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli kháng cefotaxime trong chất thải lợn tại chuồng nuôi, đồng thời phân tích mối tương quan giữa mức độ kháng thuốc nhóm cephalosporin và khả năng sinh enzyme beta-lactamase mở rộng (ESBL) của các chủng E coli Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng tiến hành phát hiện các gen kháng kháng sinh nhóm cephalosporin, bao gồm CTX, TEM và SHV, ở các chủng E coli sản sinh ESBL được phân lập.
Địa điểm nghiên cứu và số mẫu nghiên cứu
Nghiên cứu sẽ tiến hành thu thập 100 mẫu chất thải lợn từ nền chuồng nuôi, lấy từ 50 hộ chăn nuôi tại Thái Bình và 50 hộ tại Sóc Sơn, Hà Nội, với mỗi hộ thu thập một mẫu.
Danh sách các hộ chăn nuôi lợn sẽ được lựa chọn ngẫu nhiên từ danh mục do cán bộ địa phương cung cấp Nghiên cứu sẽ được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Vệ sinh thú y thuộc Viện thú y.
3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu phân lợn tại nền chuồng nuôi (ISO 13485)Tại mỗi hộ chăn nuôi, mẫu phân lợn được thu thập từ 5 vị trí trên nền chuồng(gồm 4 góc và 1 vị trí ở giữa chuồng) Mỗi vị trí thu thập khoảng 5 –10 gram sau đó trộn đều thành mẫu đại diện cho hộ và cho vào trong túi nilon vô trùng Mẫu được đánh số và bảo quản lạnh trong thùng đá khô sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm ngay trong ngày.
3.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli kháng cefotaxime (ISO 16649-2:2001)
Pha loãng mẫu phân lợn với tỷ lệ 1/10 bằng cách cho 10g mẫu vào túi dập chứa 90ml dung dịch Buffer Pepton water Tiếp tục thực hiện pha loãng theo dãy nồng độ từ 10^-1 đến 10^-8 bằng nước muối sinh lý Sử dụng pipet hút 100µl dung dịch từ mỗi ống pha loãng và nhỏ lên bề mặt đĩa thạch Macconkey có bổ sung kháng sinh cefotaxime (2mg/lit) (Hansen et al., 2013) Láng đều mặt thạch bằng que cấy thủy tinh hình tam giác, với mỗi nồng độ pha loãng cấy trên 2 đĩa Nuôi cấy vi khuẩn ở nhiệt độ 37°C trong 24h Sau khi giám định bằng KIT sinh hóa, chọn tối đa 5 khuẩn lạc E.coli có màu hồng cánh sen từ các đĩa thạch Macconkey đại diện cho từng mẫu để thử tính mẫn cảm kháng sinh.
3.4.3 Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli kháng cefotaxime phân lập được (Theo phương pháp Kirby-Bauer Disk Susceptibility Test)
Sử dụng môi trường Mueller Hinton (MH) và khoanh giấy tẩm kháng sinh (Oxoid),bao gồm cefoperazone, (CFP, 3 rd , 75 àg), ceftriaxone (CRO,
Chúng tôi đã kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E coli phân lập được đối với cefuroxime (CXM, 2nd, 30 àg), ceftazidime (CAZ, 3rd, 30 àg) và cefamandole (MA, 2nd, 30 àg) bằng phương pháp Kirby-Bauer.
Vi khuẩn được lấy từ ống giống bằng que cấy vô trùng và được cấy trên bề mặt môi trường thạch Plate Count Agar (PCA), sau đó nuôi ở tủ ấm 37°C trong 20-24 giờ Một khuẩn lạc được lấy và hòa tan vào ống nghiệm chứa 2ml nước muối sinh lý tiệt trùng Sử dụng máy Vontex để trộn đều vi khuẩn trong ống nghiệm, sau đó điều chỉnh nồng độ huyễn dịch vi khuẩn đạt chuẩn 0,5 McFarland (10^8 cfu/ml) Cuối cùng, dung dịch này được pha loãng 100 lần bằng cách sử dụng pipet hút 20µl vào ống nghiệm chứa 2ml nước muối sinh lý để đạt nồng độ 10^6 CFU/ml.
Sử dụng tăm bông vô trùng để thấm canh khuẩn đã chuẩn bị, ria cấy ba đường lệch nhau 60 độ trên toàn bộ mặt đĩa thạch Muller Hinton (MH) Ria đều để đảm bảo vi khuẩn mọc kín mặt thạch, sau đó để khô trong 10 phút Tiếp theo, dùng kẹp nhọn vô trùng để gắp các khoanh giấy kháng sinh có ký hiệu riêng và đặt lên bề mặt thạch MH, đảm bảo các khoanh giấy cách đều nhau.
* Chú ý: đặt phần có chữ của khoanh giấy kháng sinh áp xuống bề mặt thạch, tuyệt đối không nhấc lên đặt lại.
- Lật ngược đĩa thạch và đem nuôi ở tủ ấm
Để đo đường kính vòng vô khuẩn, cần sử dụng thước có chia vạch chính xác nhằm xác định kích thước vòng vô khuẩn tương ứng với từng loại giấy tẩm kháng sinh trên bề mặt thạch Sau khi thực hiện đo lường, hãy ghi lại kết quả một cách cẩn thận.
+ So sánh với bảng tiêu chuẩn 3.1 để kết luận:
Bảng 3.1 Bảng đánh giá đường kính vòng vô khuẩn
Ceftazidime Cefoperazone Cefuroxime Ceftriaxone Cefamandole
Kết quả được đánh giá theo tiêu chuẩn M100-S24 (Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing, 2014).
3.4.4 Phương pháp khoanh giấy đôi phát hiện các chủng E.coli sản sinh ESBL (Theo phương pháp Doulble-disks test)
Hình 3.1 Vi khuẩn E coli có khả năng sinh ESBL
Các chủng E.coli kháng cephalosporin nghi ngờ có khả năng sản sinh enzyme beta-lactam cao, theo Livemore và Brown (2001) cùng MacKenzie và cộng sự (2002) Để kiểm tra, phương pháp khoanh giấy đôi có cải tiến đã được áp dụng (Cabrera, 2004).
Trong nghiên cứu, môi trường Mueller-Hinton được cấy đều với vi khuẩn E coli (10^6 CFU/ml) và để khô ở nhiệt độ phòng Một khoanh giấy AMC (amoxicillin 20 µg/clavulanic acid 10 µg) được đặt chính giữa đĩa thạch, trong khi khoanh giấy kháng sinh Cephalosporin được đặt cách khoanh AMC 20 mm Nếu vùng ức chế xung quanh khoanh Cephalosporin mở rộng về phía khoanh AMC, tạo thành vùng ức chế hình elip, điều này cho thấy chủng E coli có khả năng sản sinh ESBL, theo tiêu chuẩn NCCLS (2007).
3.4.5 Phương pháp PCR phát hiện gen kháng cephalosporin (TEM, CTX, và SHV) của các chủng E coli sản sinh ESBL (Hasman et al.,
3.4.5.1 Tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn E coli: Sử dụng bộ Kit QIAamp DNA minikit (Qiagen, Hilden, Germany)
3.4.5.2 PCR các mẫu đã tách được DNA
Lấy 1 àl ADN tổng số của từng chủng được sử dụng cho phản ứng PCR
Phương pháp PCR đa mồi phát hiện genTEM và SHV
Các cặp gen mồi dùng cho nghiên cứu được trình bày ở bảng 2
Phản ứng PCR thực hiện với nguyên lý cơ bản trên hệ thống luân nhiệt với thành phần các chất có trong phản ứng PCR (bảng 3.2).
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR Các bước của phản ứng PCR
Kiểm tra hiệu quả khuếch đại và kích thước sản phẩm PCR được thực hiện trên gel agarose 1% và nhuộm bằng Ethidium bromide Phương pháp PCR đơn mồi được sử dụng để phát hiện gen CTX-M, như mô tả trong bảng 3.3.
Các bước thực hiện tương tự như quy trình đã nêu, chỉ khác ở một chi tiết là cần thực hiện 30 chu kỳ với các điều kiện nhiệt độ là 94°C trong 1 phút, 58°C trong 1 phút và 72°C trong 1 phút Dưới đây là Bảng 3.3, trình bày các cặp gen mồi dùng để phát hiện các gen kháng kháng sinh.
TEM, SHV and CTX-M (Hasman et al 2005)
3.4.6 Phương pháp điện di kiểm tra kết quả
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1 Thành phần gel agarose 1%: Dung dịch TAE 1X (40 mM Tris pH=8, 20mM EDTA): 100 ml và Agarose: 1g
Chạy điện di ở 100V/ 250mA/ 30-40p trong bể điện di có dung dịch TAE 1X, nhuộm gel bằng Ethidium Bromide trong 5 phút Đọc kết quả trên máy soi UV
3.4.7 Phương pháp sử lý số liệu
Các kết quả thu được trong các thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel.
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VI KHUẨN E COLI KHÁNG CEFOTAXIME Ở CHẤT THẢI LỢN THU THẬP TẠI NỀN CHUỒNG
4.1.1 Một số thông tin chính liên quan đến sử dụng kháng sinh cho lợn tại Thái Bình và Sóc Sơn
Việc quản lý kháng sinh trong chăn nuôi hiện nay còn nhiều bất cập, dẫn đến tình trạng người chăn nuôi tự ý mua thuốc điều trị mà không có kiến thức đầy đủ Hầu hết các hộ chăn nuôi lợn kết hợp nhiều loại kháng sinh và sử dụng liều cao hơn khuyến cáo, gây nguy cơ kháng thuốc vi khuẩn Khi phát hiện lợn có biểu hiện bất thường, họ thường tự mua thuốc tại cửa hàng mà không tham khảo ý kiến chuyên gia, dẫn đến một số trường hợp điều trị thành công nhưng cũng có nhiều trường hợp không hiệu quả và phải nhờ đến sự can thiệp của cán bộ thú y Kết quả khảo sát về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi tại Thái Bình và Sóc Sơn cho thấy tình trạng này đang phổ biến và cần được quản lý chặt chẽ hơn.
Bảng 4.1 Một số loại thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho lợn tại các hộ chăn nuôi thuộc tỉnh Thái Bình
Nhóm thuốc Kháng sinh Aminoglycosid
Macrolid Tetracycline Polypeptide β-lactam Chloramphenicol Quinolon
Tổng số hộ sử dụng thuốc kháng sinh 40/50
Bảng 4.2 Một số loại thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho lợn tại các hộ chăn nuôi thuộc huyện Sóc
Tổng số hộ sử dụng thuốc kháng sinh
Tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh tại Thái Bình và Sóc Sơn rất phổ biến, với đa dạng loại thuốc và phương pháp sử dụng như tiêm, trộn thức ăn và nước uống Đặc biệt, tại Thái Bình, 80% hộ chăn nuôi lợn đã sử dụng kháng sinh để điều trị và phòng bệnh, trong khi Sóc Sơn là 56% Việc này có thể dẫn đến nguy cơ nhờn thuốc và kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, cũng như tồn dư kháng sinh trong thịt lợn, đặc biệt là khi lợn gần đến ngày xuất chuồng vẫn được dùng kháng sinh.
4.1.2 Kết quả thu thập mẫu phân nền chuồng lợn
Chúng tôi đã thu thập 100 mẫu nền chuồng lợn từ Thái Bình và Sóc Sơn - Hà Nội, mỗi địa phương 50 mẫu, nhằm phân lập vi khuẩn E coli kháng Cephalosporin và xác định mối liên hệ giữa chúng.
Bảng 4.3 Số lượng mẫu phân nền chuồng lợn thu thập được Tên địa phương thu thập mẫu