Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu
Thịt gà tươi sống được thu thập ngẫu nhiên từ các chợ Đồng Xa (quận Cầu Giấy), chợ Phùng Khoang (quận Thanh Xuân), chợ Đại Từ (quận Hoàng Mai) và chợ Hôm (quận Hai Bà Trưng) tại Thành phố.
Hà Nội là nơi mà người dân thường ưa chuộng thực phẩm tươi sống, đặc biệt là tại các chợ thay vì siêu thị Do đó, mẫu nghiên cứu được thu thập từ các chợ ở những khu vực đông dân cư của các quận lớn.
Hình 3.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội
Hình 3.2 Thịt gà bày bán tại chợ sau khi giết mổ
Trong đó số lượng mẫu thu thập tại mỗi chợ là 25 mẫu Tổng số mẫu phân tích là 100 mẫu
Các mẫu sau khi thu thập sẽ được phân tích tại phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2005 của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.
Khoảng thời gian thu thập mẫu từ tháng 7 đến tháng 9 năm 2016 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu này nhằm phát hiện và phân lập các chủng Salmonella có trong mẫu thịt gà thu thập từ các chợ ở Thành phố Hà Nội, từ đó xác định tỉ lệ lưu hành của Salmonella trên thịt gà tại khu vực này.
Thử khả năng kháng kháng sinh thuộc nhóm β-lactam (thế hệ 1, 2, 3 và β-lactam phổ rộng) của các chủng Salmonella đã phân lập được
Tìm gen mã hóa enzyme β-lactamase của các chủng Salmonella kháng thuốc.
Dựa trên mục đích nghiên cứu, chúng tôi đã chọn phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân lập Salmonella trên thịt gia cầm Phương pháp sử dụng khoanh giấy kháng sinh giúp phát hiện nhanh tính kháng kháng sinh của vi sinh vật và kiểm chứng khả năng sinh enzyme β-lactamase của chủng Salmonella đã thu thập Các gen kháng kháng sinh của vi khuẩn được phát hiện ban đầu bằng kỹ thuật khuếch đại gen PCR Các mẫu dương tính sẽ được lưu giữ để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn, như phát hiện đột biến điểm và các gen kháng kháng sinh khác.
- Túi ghép mí đựng mẫu vô trùng;
- Tủ mát (Aucma, Nhật Bản);
- Tủ lạnh đông -80 0 C (Daire, Đan Mạch)
Số lượng 100 mẫu thịt gia cầm được thu thập tại 4 chợ, mỗi chợ
5 mẫu cho 1 lần thu thập, mỗi mẫu khoảng 1/4 con gà (hoặc 1 kg)
Mẫu thịt gà được đựng trong túi nilon ghép mí vô trùng, bảo quản trong thùng đựng mẫu có kèm đá khô đảm bảo nhiệt độ 4 0 C –
8 0 C Mẫu được vận chuyển ngay trong ngày về phòng thí nghiệm
Bảo quản mẫu riêng rẽ trong tủ mát ở nhiệt độ 4 0 C – 8 0 C tại phòng thí nghiệm nếu phân tích trong ngày, hoặc ở tủ đông sâu (-
20 o C) nếu phân tích vào ngày hôm sau Mẫu đã thu thập từ các chợ sẽ được phân tích trong vòng 24h sau khi thu thập
3.3.2 Phương pháp phân lập Salmonella
- Nồi hấp (Hyrayama, Nhật Bản)
- Cân kỹ thuật ML802 (Metler, Thụy Sĩ)
- Đồng hồ hẹn giờ (Extech 365535 Mỹ)
- Tủ ấm Sanyo (Nhật Bản)
- Tủ lạnh đông (Daire, Đan Mạch)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Telstar, Tây Ban Nha)
- Bể cách thủy (Memmert, Đức)
- pH Meter, có độ chính xác ± 0.1 0 C đơn vị pH ở 20 0 C hoặc 25 0 C (Thụy Sĩ)
- Micropipett có dung tích 10 ml và 1 ml (Eppendorf, Đức)
- Que cấy vũng vụ trựng, cú đường kớnh 3 mm hoặc 10àl
- Ống nghiệm, đĩa petri vô trùng
- Túi ghép mí đựng mẫu vô trùng (cỡ 3, cỡ 7, xuất xứ Việt Nam
- Buffer Peptone water (xuất xứ: Đức)
- XLD agar, HE agar (Merck, Đức)
- TSI, LDC, Ure broth, (Merck, Đức)
- Poly O antisera, Poly H antisera (BD, Pháp)
Chúng tôi áp dụng phương pháp TCVN 4829:2005 (ISO/IEC 6579:2005) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Phương pháp này được thực hiện tại phòng thử nghiệm Khoa Vi sinh vật, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia và đã được Văn phòng công nhận chất lượng (BOA) đánh giá và công nhận.
Salmonella thường xuất hiện với số lượng nhỏ, thường đi kèm với nhiều vi sinh vật khác thuộc họ Enterobacteria Để đảm bảo phát hiện được lượng nhỏ Salmonella hoặc Salmonella có hoạt tính suy giảm, cần thực hiện quá trình tăng sinh sơ bộ theo tiêu chuẩn TCVN 4829:2005.
Sau khi tăng sinh sơ bộ, số lượng và hoạt tính của vi khuẩn Salmonella tăng lên, giúp ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác Các khuẩn lạc Salmonella điển hình được thử nghiệm qua các phản ứng sinh hóa và kháng huyết thanh thông qua phương pháp ngưng kết trên phiến kính Ngoài ra, việc sử dụng chủng chuẩn đối chứng trong quá trình phân tích là rất quan trọng.
− Đối chứng dương: Salmonella Enteritidis ATCC 13076
− Đối chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 c/ Các bước tiến hành
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc
- Cân 25 g thịt gà từ khối thịt gà đã đồng nhất trong túi ghép mí vô trùng
- Rót 225 ml đệm pepton (pH = 7) vào túi đựng mẫu gà đã cân, bóp đều trong 1 phút, để yên trong 30 phút, sau đó ủ ở nhiệt độ
37 0 C ± 1 0 C trong 18h ± 2h Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Sau khi ủ ở nhiệt độ 37°C ± 1°C trong 18 giờ ± 2 giờ, chuyển 0.1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml RV broth (nuôi ở 41.5°C ± 1°C trong 24 giờ ± 3 giờ) và 1 ml sang 10 ml MKTTn broth (ủ ở 37°C ± 1°C trong 24 giờ ± 3 giờ) Tiếp theo, rải dịch đã tăng sinh lên môi trường thạch XLD agar, để yên 30 phút và ủ ở 37°C ± 1°C trong 24 giờ ± 3 giờ Lặp lại quy trình tương tự với môi trường thạch HE agar.
30 phút rồi ủ ở nhiệt độ 37 0 C ± 1 0 C trong 24h ± 3h
Bước 4: Để bắt khuẩn lạc điển hình, quan sát khuẩn lạc rìa hồng, tâm đen, nhẵn bóng, lồi, tròn trên môi trường XLD agar, cùng với khuẩn lạc rìa không màu, tâm đen, nhẵn bóng, lồi tròn trên HE agar Tiến hành nuôi chúng trên môi trường thạch dinh dưỡng (TSA) ở nhiệt độ 37 ± 1 độ C trong khoảng thời gian 24 ± 3 giờ.
Hình 3.3 Khuẩn lạc khi ria lên thạch XLD Bước 5: Thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định
Để thực hiện thí nghiệm Thạch TSI, trước tiên sử dụng que cấy vô trùng để chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng Sau đó, tiến hành cấy đường cấy trích sâu vào thạch TSI và cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch Cuối cùng, nuôi mẫu ở nhiệt độ thích hợp để quan sát sự phát triển của vi khuẩn.
Nhiệt độ 37°C ± 1°C qua đêm, thạch TSI cho thấy các đặc điểm điển hình của Salmonella, bao gồm sự thể hiện tính kiềm với màu đỏ trên bề mặt nghiêng và tính axit với màu vàng khi cấy đâm sâu, kèm theo sự sinh khí (bọt khí) và trong khoảng 90% trường hợp, có sự sinh hydrosunfua khiến thạch bị đen.
Cấy đâm sâu cho kết quả với màu vàng biểu thị glucoza dương tính, trong khi màu đỏ hoặc không đổi màu cho thấy glucoza âm tính Màu đen cho biết sự hiện diện của sinh khí hydro sunfua, và sự xuất hiện của bọt hoặc vết rạn cho thấy sự sản sinh khí từ glucoza.
+ Bề mặt thạch nghiêng: Màu vàng (lactoza và/hoặc sucroza dương tính), màu đỏ hoặc không đổi màu (lactoza và sucroza âm tính)
Hình 3.4 Kết quả phản ứng trên thạch TSI
Ure broth là một môi trường nuôi cấy vi sinh vật, trong đó que cấy vô trùng được dùng để chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng, sau đó hòa vào dung dịch Ure broth trong ống nghiệm Mẫu được nuôi ở nhiệt độ 37°C ± 1°C qua đêm Nếu phản ứng dương tính, urê sẽ được phân giải thành amoniac, khiến phenol chuyển từ màu đỏ sang hồng và cuối cùng là đỏ hồng Phản ứng này thường xuất hiện sau khoảng 2 đến 4 giờ.
Dương tính Salmonella Âm tính
Hình 3.5 Phản ứng trên Urea broth
- LDC: dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng ở Bước 4, hòa vào dung dịch LDC trong ống nghiệm, nuôi ở nhiệt độ
37 0 C ± 1 0 C qua đêm Màu đục và đỏ tía sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính,
; màu vàng là phản ứng âm tính
Hình 3.6 Phản ứng trên LDC broth
Bước 6: Khẳng định bằng huyết thanh học các chủng Salmonella phân lập được
34 các chủng tự ngưng kết bằng cách thực hiện phản ứng ngưng kết với nước muối.
Sau đó kiểm tra kháng nguyên O, kháng nguyên H Để tiến hành phân typ các chủng thì cần ria các chủng phân lập được lên thạch dinh dưỡng, ủ 37 0 C trong 18 giờ
+ Nhỏ một giọt nước muối sinh lý 0.85% làm đối chứng lên phiến kính bằng cách sử dụng vòng que cấy
+ Lấy khuẩn lạc đã ria trên thạch dinh dưỡng lên phiến kính và trộn đều với giọt nước muối sinh lý
Đợi 30 giây để kiểm tra tính tự ngưng kết của chủng Nếu chủng tự ngưng kết, không cần thực hiện các bước định typ tiếp theo Ngược lại, với những chủng không tự ngưng kết, tiếp tục thực hiện các phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể.
Phương pháp nghiên cứu
Dựa trên mục đích nghiên cứu, chúng tôi đã chọn phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân lập Salmonella trên thịt gia cầm Để phát hiện nhanh tính kháng kháng sinh của vi sinh vật, chúng tôi sử dụng khoanh giấy kháng sinh và kiểm chứng khả năng sinh enzyme β-lactamase của chủng Salmonella đã thu thập Các gen kháng kháng sinh của vi khuẩn được phát hiện ban đầu bằng kỹ thuật khuếch đại gen PCR Các mẫu dương tính sẽ được lưu lại để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn như phát hiện các đột biến điểm và các gen kháng kháng sinh khác.
- Túi ghép mí đựng mẫu vô trùng;
- Tủ mát (Aucma, Nhật Bản);
- Tủ lạnh đông -80 0 C (Daire, Đan Mạch)
Số lượng 100 mẫu thịt gia cầm được thu thập tại 4 chợ, mỗi chợ
5 mẫu cho 1 lần thu thập, mỗi mẫu khoảng 1/4 con gà (hoặc 1 kg)
Mẫu thịt gà được đựng trong túi nilon ghép mí vô trùng, bảo quản trong thùng đựng mẫu có kèm đá khô đảm bảo nhiệt độ 4 0 C –
8 0 C Mẫu được vận chuyển ngay trong ngày về phòng thí nghiệm
Bảo quản mẫu riêng rẽ trong tủ mát ở nhiệt độ 4 0 C – 8 0 C tại phòng thí nghiệm nếu phân tích trong ngày, hoặc ở tủ đông sâu (-
20 o C) nếu phân tích vào ngày hôm sau Mẫu đã thu thập từ các chợ sẽ được phân tích trong vòng 24h sau khi thu thập
3.3.2 Phương pháp phân lập Salmonella
- Nồi hấp (Hyrayama, Nhật Bản)
- Cân kỹ thuật ML802 (Metler, Thụy Sĩ)
- Đồng hồ hẹn giờ (Extech 365535 Mỹ)
- Tủ ấm Sanyo (Nhật Bản)
- Tủ lạnh đông (Daire, Đan Mạch)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Telstar, Tây Ban Nha)
- Bể cách thủy (Memmert, Đức)
- pH Meter, có độ chính xác ± 0.1 0 C đơn vị pH ở 20 0 C hoặc 25 0 C (Thụy Sĩ)
- Micropipett có dung tích 10 ml và 1 ml (Eppendorf, Đức)
- Que cấy vũng vụ trựng, cú đường kớnh 3 mm hoặc 10àl
- Ống nghiệm, đĩa petri vô trùng
- Túi ghép mí đựng mẫu vô trùng (cỡ 3, cỡ 7, xuất xứ Việt Nam
- Buffer Peptone water (xuất xứ: Đức)
- XLD agar, HE agar (Merck, Đức)
- TSI, LDC, Ure broth, (Merck, Đức)
- Poly O antisera, Poly H antisera (BD, Pháp)
Chúng tôi áp dụng phương pháp TCVN 4829:2005 (ISO/IEC 6579:2005) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Phương pháp này sử dụng đĩa thạch để phân tích và phân lập chủng Salmonella, được thực hiện tại phòng thử nghiệm Khoa Vi sinh vật, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia Phương pháp này đã được đánh giá và công nhận bởi Văn phòng công nhận chất lượng (BOA).
Salmonella thường xuất hiện với số lượng nhỏ, thường đi kèm với nhiều vi sinh vật khác thuộc họ Enterobacteria hoặc các họ khác Để phát hiện chính xác lượng nhỏ Salmonella hoặc các chủng Salmonella bị suy giảm hoạt tính, cần thực hiện quá trình tăng sinh sơ bộ theo tiêu chuẩn TCVN 4829:2005.
Sau khi tăng sinh sơ bộ, vi khuẩn Salmonella sẽ tăng về số lượng và hoạt tính, đồng thời tiến hành tăng sinh chọn lọc để ức chế các vi khuẩn khác Các khuẩn lạc Salmonella điển hình sẽ được thử nghiệm các phản ứng sinh hóa và kháng huyết thanh thông qua phương pháp ngưng kết trên phiến kính Bên cạnh đó, việc sử dụng chủng chuẩn đối chứng là cần thiết trong quá trình phân tích.
− Đối chứng dương: Salmonella Enteritidis ATCC 13076
− Đối chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 c/ Các bước tiến hành
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc
- Cân 25 g thịt gà từ khối thịt gà đã đồng nhất trong túi ghép mí vô trùng
- Rót 225 ml đệm pepton (pH = 7) vào túi đựng mẫu gà đã cân, bóp đều trong 1 phút, để yên trong 30 phút, sau đó ủ ở nhiệt độ
37 0 C ± 1 0 C trong 18h ± 2h Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Sau khi ủ dịch ở nhiệt độ 37°C ± 1°C trong 18h ± 2h, chuyển 0.1 ml vào 10 ml môi trường RV broth và 1 ml vào 10 ml môi trường MKTTn broth, ủ ở 41.5°C ± 1°C trong 24h ± 3h và 37°C ± 1°C trong 24h ± 3h tương ứng Cuối cùng, rải dịch đã tăng sinh lên môi trường thạch XLD agar, để yên 30 phút và ủ ở 37°C ± 1°C trong 24h ± 3h, sau đó lặp lại quy trình với môi trường thạch HE agar.
30 phút rồi ủ ở nhiệt độ 37 0 C ± 1 0 C trong 24h ± 3h
Bước 4: Để bắt khuẩn lạc điển hình, quan sát khuẩn lạc trên XLD agar với đặc điểm rìa hồng, tâm đen, nhẵn bóng, lồi và tròn, cũng như khuẩn lạc trên HE agar có rìa không màu, tâm đen, nhẵn bóng, lồi tròn Sau đó, nuôi cấy chúng trên môi trường thạch dinh dưỡng (TSA) ở nhiệt độ 37 ± 1 độ C trong khoảng thời gian 24 ± 3 giờ.
Hình 3.3 Khuẩn lạc khi ria lên thạch XLD Bước 5: Thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định
Để thực hiện thí nghiệm với thạch TSI, đầu tiên, sử dụng que cấy vô trùng để chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng Tiếp theo, cấy đường cấy trích sâu vào thạch TSI và cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch Cuối cùng, nuôi mẫu ở nhiệt độ thích hợp để quan sát kết quả.
Nhiệt độ 37 ± 1 độ C qua đêm, thạch TSI cho thấy các đặc điểm điển hình của Salmonella, bao gồm sự kiềm hóa (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng và phản ứng axit (màu vàng) khi cấy đâm sâu, kèm theo sự phát sinh khí (bọt khí) và trong khoảng 90% trường hợp, sinh ra hydrosunfua khiến thạch bị đen.
Cấy đâm sâu cho thấy màu vàng nếu có glucoza dương tính, màu đỏ hoặc không đổi màu nếu glucoza âm tính, và màu đen biểu thị sự sinh khí hydro sunfua Ngoài ra, sự xuất hiện của bọt hoặc vết rạn cho thấy sự sinh khí từ glucoza.
+ Bề mặt thạch nghiêng: Màu vàng (lactoza và/hoặc sucroza dương tính), màu đỏ hoặc không đổi màu (lactoza và sucroza âm tính)
Hình 3.4 Kết quả phản ứng trên thạch TSI
Ure broth là môi trường nuôi cấy vi khuẩn, trong đó que cấy vô trùng được dùng để chấm khuẩn lạc từ thạch dinh dưỡng và hòa vào dung dịch Ure broth trong ống nghiệm Mẫu được nuôi ở nhiệt độ 37°C ± 1°C qua đêm Nếu phản ứng dương tính xảy ra, urê sẽ được phân giải thành amoniac, dẫn đến sự chuyển màu của phenol từ đỏ sang hồng và cuối cùng là đỏ hồng, thường xuất hiện sau 2 đến 4 giờ.
Dương tính Salmonella Âm tính
Hình 3.5 Phản ứng trên Urea broth
- LDC: dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng ở Bước 4, hòa vào dung dịch LDC trong ống nghiệm, nuôi ở nhiệt độ
37 0 C ± 1 0 C qua đêm Màu đục và đỏ tía sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính,
; màu vàng là phản ứng âm tính
Hình 3.6 Phản ứng trên LDC broth
Bước 6: Khẳng định bằng huyết thanh học các chủng Salmonella phân lập được
34 các chủng tự ngưng kết bằng cách thực hiện phản ứng ngưng kết với nước muối.
Sau đó kiểm tra kháng nguyên O, kháng nguyên H Để tiến hành phân typ các chủng thì cần ria các chủng phân lập được lên thạch dinh dưỡng, ủ 37 0 C trong 18 giờ
+ Nhỏ một giọt nước muối sinh lý 0.85% làm đối chứng lên phiến kính bằng cách sử dụng vòng que cấy
+ Lấy khuẩn lạc đã ria trên thạch dinh dưỡng lên phiến kính và trộn đều với giọt nước muối sinh lý
Chờ đợi 30 giây để kiểm tra khả năng tự ngưng kết của chủng Nếu chủng tự ngưng kết, không cần thực hiện các bước định typ tiếp theo Ngược lại, đối với chủng không tự ngưng kết, tiếp tục thực hiện các phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể.
Nhỏ một giọt kháng huyết thanh O của Salmonella vào từng vùng kiểm tra trên phiến kính Tiếp theo, cho chủng từ đĩa thạch dinh dưỡng vào các điểm có kháng huyết thanh Trộn đều kháng huyết thanh và chủng một cách cẩn thận Lắc nhẹ phiến kính trong 30 giây và quan sát phản ứng xảy ra.
Nhỏ một giọt kháng huyết thanh O của Salmonella vào từng vùng kiểm tra trên phiến kính Tiếp theo, cho chủng từ đĩa thạch dinh dưỡng vào các điểm có kháng huyết thanh Trộn đều kháng huyết thanh và chủng một cách cẩn thận, sau đó lắc nhẹ phiến kính trong 30 giây và quan sát phản ứng xảy ra.
Pha chế môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất Môi trường trước khi sử dụng được kiểm soát chất lượng theo TCVN 8128-1,2 : 2009
Trong mọi trường hợp, cần tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất về bảo quản, hạn sử dụng và cách bảo quản sản phẩm Đối với môi trường phòng thí nghiệm, cần giữ ở điều kiện ổn định, tránh ánh sáng, khô và bảo quản ở nhiệt độ 5°C ± 3°C Đối với đĩa môi trường, thời gian bảo quản không quá 2 đến 4 tuần, trong khi ống hoặc lọ nhỏ có thể bảo quản từ 3 đến 6 tháng, trừ khi có quy định khác hoặc kết quả kiểm tra cho thấy thời gian sử dụng lâu hơn.
Môi trường chứa các thành phần không ổn định cần được sử dụng trong ngày, trừ khi có quy định riêng hoặc kết quả kiểm tra cho phép thời hạn sử dụng lâu hơn Đối với môi trường đặc có chứa chất không ổn định và/hoặc chất hoạt hóa, không nên bảo quản với số lượng lớn để tránh việc làm tan chảy lại.