Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu
Nghıên cứu được tıến hành từ 9/2018 đến 04/2019
Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý khoa Thú Y, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Một số cơ sở chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Hưng Yên.
3.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Lợn siêu nạc các lứa tuổi, gồm các giống lợn: Landrace, Yorshire mắc nhóm bệnh phổi tại Văn Giang_ Hưng Yên.
3.4 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Khảo sát tỷ lệ mắc bệnh phổi ở lợn siêu nạc.
-Tổng hợp và so sánh đặc điểm bệnh lý chủ yếu nhóm bệnh phổi ở lợn siêu nạc
- Khảo sát một số chỉ tiêu huyết học của lợn siêu nạc mắc bệnh phổi.
3.4.2.1 Phương pháp xác định tỷ lệ lợn mắc bệnh phổi
Để xác định lợn mắc bệnh phổi, cần dựa vào triệu chứng lâm sàng và các bệnh tích đặc trưng Việc theo dõi thường xuyên, quan sát từng ô chuồng và kiểm tra từng cá thể lợn là rất quan trọng để phát hiện sớm bệnh phổi cũng như các bệnh khác.
Để nhận biết lợn mắc bệnh phổi, bạn có thể dựa vào các dấu hiệu như: con vật có biểu hiện ủ rũ, mệt mỏi, ăn uống kém, da có màu xanh, khịt mũi, thở khò khè, khó thở, hắt hơi và ho khan.
Sau khi ghi chép chi tiết vào nhật ký về số lượng tai, số lượng nái, nhóm tuổi và ô chuồng cùng với ngày tháng xảy ra bệnh, chúng ta có thể dự đoán các nguyên nhân gây bệnh Điều này giúp xác định những vấn đề quan trọng cần lưu ý khi kết thúc thí nghiệm.
Tỷ lệ mắc bệnh phổi 3.4.2.2 Phương pháp mổ khám
Xác lợn chết được mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Công nghệ, 2010).
Mổ khám lợn mắc bệnh phổi là cần thiết để xác định các biến đổi đại thể của cơ quan Cần tiến hành mổ trên những con lợn có triệu chứng lâm sàng rõ ràng Sau khi cố định lợn bệnh, lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, tiếp theo là lột da và bộc lộ xoang ngực cùng xoang bụng Các cơ quan nội tạng được tách ra để quan sát và chụp ảnh Mẫu các cơ quan như phổi, tim, gan, lách, thận, ruột và hạch sẽ được thu thập cho các nghiên cứu khác nhau, trong đó một số mẫu sẽ được bảo quản trong formol 10% ít nhất một thời gian nhất định.
1 tuần) để làm tiêu bản vi thể (Cao Xuân Ngọc, 1997).
Phương pháp lấy bệnh phẩm
Sử dụng kéo để cắt lấy một số bộ phận có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng ở lợn mắc bệnh phổi, bao gồm mẫu phổi, gan và ruột với kích thước khoảng 3cm, sau đó cho vào lọ chứa dung dịch formol 10%.
3.4.2.3 Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Các mẫu bệnh phẩm có biến đổi đại thể được ngâm trong dung dịch formol 10% để tạo tiêu bản, từ đó xác định các bệnh tích vi thể chính của bệnh.
Tiêu bản vi thể được thực hiện theo phương pháp của Prophet (1992) bao gồm các bước sau: lấy mẫu, khử nước và làm trong, tẩm parafin, đúc block, cắt dán mảnh, nhuộm Hematoxilin và Eosin, gắn lamen, dán nhãn và cuối cùng là đọc kết quả bằng kính hiển vi.
* Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Các mẫu bệnh phẩm có biến đổi đại thể được ngâm trong formol 10% để tạo tiêu bản vi thể Việc làm tiêu bản này giúp xác định các bệnh tích vi thể chính của bệnh Quy trình làm tiêu bản vi thể bao gồm tẩm đúc bằng paraffin và nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE).
Khi tiến hành kiểm tra lợn bệnh, mỗi cơ quan sẽ được lấy hai miếng bệnh phẩm và đúc thành hai block Các block này sẽ được cắt và nhuộm để tạo ra tiêu bản, từ đó chọn ra những tiêu bản đẹp nhất Sau khi soi dưới kính hiển vi, chúng tôi sẽ đọc kết quả bệnh tích vi thể Nếu một block có hai tiêu bản thể hiện bệnh tích, nó sẽ được xác định là dương tính.
Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Để tiến hành thí nghiệm, cần chuẩn bị đầy đủ dụng cụ và hóa chất, bao gồm: lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37 độ C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm từ 48 – 52 độ C, xylem, paraffin, cùng với thuốc nhuộm hematoxylin và eosin.
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách…
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trọng 24h.
Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn
Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức.
Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen
Mục đích: khử hết cồn ra khỏi rổ chức
Yêu cầu: khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được, nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
Khử Xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, không lẫn tạp chất, không bọt, có từ 3 – 5% sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ.
Paraffin II: 6h trong tủ ấm 56 o C
Paraffin III: 12h trong tủ ấm 56 o C
Mục đích của quá trình này là loại bỏ hoàn toàn xylen trong tổ chức, để lại chỉ paraffin thấm vào các kẽ mô bào Cần lưu ý rằng nếu nhiệt độ vượt quá 56 độ C, tổ chức sẽ trở nên giòn, dễ vỡ và khó cắt.
22 Đúc block: Mục đích: đưa mẫu bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: máy đúc block, paraffin.
Để tiến hành, đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang vào giữa khuôn block, sau đó nhanh chóng đổ paraffin lỏng vào khuôn Tiếp theo, chuyển khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy đúc khuôn block và để nguội cho đến khi block đông cứng hoàn toàn.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Để chuẩn bị cho quá trình cắt mẫu, bạn cần các dụng cụ như máy cắt, dao cắt, nước ấm ở nhiệt độ 48 – 52 độ C, phiến kính và pank kẹp Khi cắt mảnh mẫu bằng máy cắt microtom, hãy đảm bảo độ dài từ 3 – 5 mm để mảnh cắt không bị rách hay nát ở phần tổ chức.
Để xử lý mảnh cắt hiệu quả, hãy sử dụng pank kẹp để đặt mảnh cắt vào nước lạnh, nhẹ nhàng dàn đều sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt hoàn toàn Sau đó, dùng phiến kính để chuyển mảnh cắt sang nước ấm.
48 - 52 o C rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính Sau đó để ở tủ ấm 37 o C trong vòng 24h.
Nhuộm tiêu bản: Các bước tiến hành:
Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Lưu ý: có thể để tiêu bản cần nhuộm vào xylen từ sáng, đến chiều nhuộm để tiêu bản sạch hết paraffin.
Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ:
Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 10 phút.
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước, lau sạch quanh tiêu bản, kiểm tra màu sắc thấy tiêu bản xanh tím là được.
Sau đó cho tiêu bản rửa nước 5 phút loại bỏ hết haematoxylin thừa:
Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương): Nhỏ eosin ngập tiêu bản khoảng 5 –
10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa.
Tẩy nước: Cho tiêu bản qua 3 lọ cồn 100 o mỗi lọ 1 phút.
Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản đi qua 3 lọ xylen, mỗi lọ 3 – 5 phút.
Gắn Baume canada: Nhỏ một giọt Baume Canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản.
Kiểm tra tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với vật kính 10 Nếu quan sát thấy màu xanh tím, bào tương có màu đỏ tươi và tiêu bản trong sáng, đồng thời không có nước hay bọt khí, thì tiêu bản đạt yêu cầu.
3.4.2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm microsoft excel 2010 và phần mềm thống kê EpiTools Epidemiological Calculators (Ausvet, Australia).
Sau khi thu thập số liệu, tổng kết sơ bộ được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học với các tham số và công thức sau.
- Sai số của số trung bình: mx Trong đó: X
: số trung bình xi: số hạng thứ i n: dung lượng mẫu.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Khảo sát tỷ lệ mắc bệnh phổi ở lợn siêu nạc.
-Tổng hợp và so sánh đặc điểm bệnh lý chủ yếu nhóm bệnh phổi ở lợn siêu nạc
- Khảo sát một số chỉ tiêu huyết học của lợn siêu nạc mắc bệnh phổi.
3.4.2.1 Phương pháp xác định tỷ lệ lợn mắc bệnh phổi
Để xác định lợn mắc bệnh phổi, cần dựa vào triệu chứng lâm sàng và các bệnh tích đặc trưng Việc theo dõi thường xuyên và quan sát từng ô chuồng, kiểm tra từng cá thể lợn là rất quan trọng nhằm phát hiện bệnh phổi hoặc các bệnh khác có thể xảy ra.
Để nhận biết lợn mắc bệnh phổi, bạn có thể dựa vào các dấu hiệu như: con vật có biểu hiện ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn, da có màu xanh, khịt mũi, thở khò khè, khó thở, hắt hơi và ho khan.
Sau khi ghi chép cẩn thận vào nhật ký về số tai, số nái, nhóm tuổi và ô chuồng cùng ngày tháng xảy ra bệnh, chúng ta có thể dự đoán nguyên nhân gây bệnh và xác định các vấn đề quan trọng cần lưu ý khi kết thúc thí nghiệm.
Tỷ lệ mắc bệnh phổi 3.4.2.2 Phương pháp mổ khám
Xác lợn chết được mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Công nghệ, 2010).
Mổ khám lợn mắc bệnh phổi là cần thiết để xác định biến đổi đại thể của các cơ quan Cần tiến hành mổ trên những lợn có triệu chứng lâm sàng rõ ràng Sau khi cố định lợn bệnh, lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, sau đó lột da để bộc lộ xoang ngực và bụng Tiến hành tách các cơ quan nội tạng như phổi, tim, gan, lách, thận, ruột, và hạch để quan sát và chụp ảnh Một số mẫu cần được bảo quản trong dung dịch formol 10% ít nhất trong một khoảng thời gian nhất định để phục vụ cho các mục đích nghiên cứu khác nhau.
1 tuần) để làm tiêu bản vi thể (Cao Xuân Ngọc, 1997).
Phương pháp lấy bệnh phẩm
Sử dụng kéo để cắt lấy một số bộ phận có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng ở cơ quan của lợn mắc bệnh phổi, như mẫu phổi, gan và ruột, với kích thước khoảng 3cm, sau đó cho vào lọ chứa dung dịch formol 10%.
3.4.2.3 Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Các mẫu bệnh phẩm với biến đổi đại thể được ngâm trong dung dịch formol 10% để tạo tiêu bản, nhằm xác định các bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh.
Tiêu bản vi thể được thực hiện theo phương pháp của Prophet, E.B (1992) qua các bước sau: lấy mẫu, khử nước và làm trong, tẩm parafin, đúc block, cắt dán mảnh, nhuộm Hematoxilin và Eosin, sau đó gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi.
* Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Các mẫu bệnh phẩm có biến đổi đại thể được ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể Việc này là cần thiết để xác định các bệnh tích vi thể chủ yếu Quy trình làm tiêu bản vi thể bao gồm tẩm đúc bằng paraffin và nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE).
Để chẩn đoán bệnh ở lợn, chúng tôi tiến hành lấy mẫu từ mỗi cơ quan, mỗi cơ quan lấy hai miếng bệnh phẩm và đúc thành hai block Sau đó, chúng tôi cắt và nhuộm tiêu bản từ mỗi block, lựa chọn những tiêu bản đẹp nhất để soi dưới kính hiển vi nhằm đọc kết quả bệnh tích vi thể Nếu cả hai tiêu bản từ một block đều có bệnh tích, block đó được coi là dương tính.
Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Để tiến hành quy trình, cần chuẩn bị đầy đủ dụng cụ và hóa chất bao gồm: lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37 độ C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm từ 48 – 52 độ C, xylem, paraffin, cùng với thuốc nhuộm hematoxylin và eosin.
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách…
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trọng 24h.
Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn
Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức.
Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen
Mục đích: khử hết cồn ra khỏi rổ chức
Yêu cầu: khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được, nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
Khử Xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, không lẫn tạp chất, không bọt, có từ 3 – 5% sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ.
Paraffin II: 6h trong tủ ấm 56 o C
Paraffin III: 12h trong tủ ấm 56 o C
Mục đích của quá trình này là loại bỏ hoàn toàn xylen trong tổ chức, để lại chỉ paraffin thấm vào các kẽ mô bào Cần lưu ý rằng nếu nhiệt độ vượt quá 56 độ C, tổ chức sẽ trở nên giòn, dễ vỡ và khó cắt.
22 Đúc block: Mục đích: đưa mẫu bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: máy đúc block, paraffin.
Để tiến hành, đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang ở giữa khuôn block, sau đó nhanh chóng đổ paraffin lỏng vào khuôn Tiếp theo, chuyển khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy đúc khuôn block và để nguội cho đến khi block đông cứng và chắc chắn.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Chuẩn bị dụng cụ cắt bao gồm máy cắt, dao cắt, nước ấm từ 48 đến 52 độ C, phiến kính và pank kẹp Sử dụng mỏ cắt microtom để cắt mảnh với độ dài từ 3 đến 5 mm, đảm bảo rằng mảnh cắt không bị rách hay nát trong quá trình thao tác.
Để thực hiện quy trình tãi mảnh, bạn cần sử dụng pank kẹp mảnh cắt và đặt chúng vào nước lạnh Hãy dàn nhẹ để đảm bảo mặt dưới của mảnh cắt ướt đều Sau đó, sử dụng phiến kính để hớt mảnh cắt và chuyển sang nước ấm.
48 - 52 o C rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính Sau đó để ở tủ ấm 37 o C trong vòng 24h.
Nhuộm tiêu bản: Các bước tiến hành:
Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Lưu ý: có thể để tiêu bản cần nhuộm vào xylen từ sáng, đến chiều nhuộm để tiêu bản sạch hết paraffin.
Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ:
Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 10 phút.
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước, lau sạch quanh tiêu bản, kiểm tra màu sắc thấy tiêu bản xanh tím là được.
Sau đó cho tiêu bản rửa nước 5 phút loại bỏ hết haematoxylin thừa:
Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương): Nhỏ eosin ngập tiêu bản khoảng 5 –
10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa.
Tẩy nước: Cho tiêu bản qua 3 lọ cồn 100 o mỗi lọ 1 phút.
Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản đi qua 3 lọ xylen, mỗi lọ 3 – 5 phút.
Gắn Baume canada: Nhỏ một giọt Baume Canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản.
Kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với vật kính 10 Nếu quan sát thấy màu xanh tím và bào tương có màu đỏ tươi, tiêu bản sẽ trong sáng, không có nước và bọt khí.
3.4.2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm microsoft excel 2010 và phần mềm thống kê EpiTools Epidemiological Calculators (Ausvet, Australia).
Sau khi thu thập số liệu, tổng kết sơ bộ được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học với các tham số và công thức sau.
- Sai số của số trung bình: mx Trong đó: X
: số trung bình xi: số hạng thứ i n: dung lượng mẫu.