Đối tượng nội dung phương pháp nghiên cứu
Đối tượng địa điểm thời gian nghiên cứu
- Các mẫu thịt lợn thu thập được tại một số chợ thuộc quận Long Biên, Hà Nội.
Trong điều kiện cho phép, phạm vi đề tài chỉ đề cập đến các chỉ tiêu: Vi khuẩn E coli, vi khuẩn Salmonella.
3.1.3 Địa điểm nghiên cứu. Địa điểm lấy mẫu: mẫu được thu thập tại một số chợ thuộc quận Long Biên,
Sau khi thu thập mẫu, các mẫu này sẽ được chuyển đến Phòng thí nghiệm Bộ môn Thú y cộng đồng thuộc Khoa Thú y của Học viện Nông nghiệp Việt Nam để thực hiện phân tích.
3.1.4 Thời gian nghiên cứu Đề tài được nghiên cứu và thực hiện từ tháng 12 năm 2018 đến tháng 07 năm 2019
Nội dung nghiên cứu
- Điều tra hiện trang phân phối thịt lợn tại Quận Long Biên
- Ngiên cứu xác dịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli và Salmonella trong thịt lợn tại một số chợ nhỏ lẻ trên địa bàn quận Long Biên.
- Xác định tính khánh kháng sinh của vi khuẩn phân lập được.
Vật liệu nghiên cứu
Mẫu thịt lợn được lấy vào 7-8 giờ sáng tại một số chợ thuộc quận Long Biên, Hà Nội.
3.3.2.1 Hóa chất, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn E coli
Môi trường Pepton Buffered Water (PBW), môi trường MacConkey (Mac)
3.3.2.2 Hóa chất, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella
Môi trường tăng sinh Pepton Buffered Water (PBW), môi trường canh
Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV) and Muller Kauffman Tetrathionate (MKTTn) are essential media for isolating Salmonella The Xyloze-Lysine-Tergitol 4 (XLT4) and Brilliant Green Agar (BGA) are effective for distinguishing enteric bacteria, while Triple Sugar Iron Agar (TSI) and SS agar are crucial for identifying fermentative organisms Blood agar provides a rich environment for the growth of fastidious microbes, and Kovac’s reagent is vital for detecting indole production in bacterial cultures.
3.3.2.3 Hóa chất, môi trường dùng làm kháng sinh đồ
The antibiotic susceptibility testing involves the use of paper discs impregnated with specific antibiotics, including Sulfamethoxazole/Trimethoprim (STX) at 25 µg, Ampicillin (AMP) at 10 µg, Colistin (COL) at 10 µg, Amoxicillin (AMX) at 10 µg, Neomycin (NEO) at 30 µg, Kanamycin (KAN) at 30 µg, Doxycycline (DOX) at 30 µg, Streptomycin (SSTH) at 10 µg, Tetracycline (TCY) at 30 µg, and Gentamicin (GEN) at 10 µg, on Muller-Hinton agar medium.
3.3.3 Trang thiết bị và dụng cụ a Trang thiết bị
Cân điện tử, máy dập mẫu, buồng cấy, nồi hấp, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, máy Vortex. b Dụng cụ
Ttúi PE vô trùng, hộp giữ lạnh, dao, kéo, kẹp, đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc đong, ống đong, pipet, que cấy…
Phương pháp nghiên cứu
Tiến hành điều tra tình hình phân phối thịt lợn tại quận Long Biên thông qua phỏng vấn trực tiếp người bán thịt lợn bằng bảng câu hỏi.
3.4.2 Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu thịt được lấy ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt tại chợ Long Biên, Hà Nội, theo tiêu chuẩn TCVN 4833 – 1:2002 và TCVN 4833 – 2:2002 Sau khi thu thập, mẫu phải được bảo quản trong hộp vô trùng và giữ lạnh trước khi vận chuyển về phòng thí nghiệm để đảm bảo chất lượng và độ chính xác trong phân tích.
3.4.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli và Salmonella
3.4.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli
Qui trình định lượng E coli (cfu/g) bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch Macconkey Theo TCVN 4833 – 2:2002
1/ Cân 10 g thịt mẫu, cắt nhỏ mẫu chứa trong túi dập mẫu Bổ sung 90ml dung dịch Pepton và nghiền nhỏ bằng máy nghiền mẫu
2/ Pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , … 10 -8 bằng cách hút
Chuyển 1ml dung dịch từ túi mẫu vào ống thủy tinh chứa 9ml dung dịch Peptop Tiến hành cấy 100µl dung dịch pha loãng lên đĩa thạch Mac, với mỗi nồng độ cấy 2 đĩa Sau đó, nuôi trong tủ ấm ở 37 ºC trong 24 giờ.
4/ Đếm các khuẩn lạc có màu hồng cánh sen trên đĩa thạch Chọn 2 nồng độ pha loãng liền nhau có số khuẩn lạc đếm được trên mỗi đĩa ≤ 250 để đếm số lượng khuẩn lạc trên mỗi đĩa và tính toán kết quả theo công thức sau:
N: là số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.
∑ : là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn.
: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 1
: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 2 d : là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
3.4.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Phương pháp phát hiện
Salmonella trên đĩa thạch TCVN 4829 : 2005 (ISO 6579 : 2002).
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút Ủ ở 37 º C trong 18-24 giờ.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1 ml sang ống chứa 10 ml môi trường tăng sinh Rappaport-Vassliadis Soya Pepton (RV) đã được ủ ấm đến 42 º C.
Ủ ở 42 ºC trong 18-24 giờ, có thể kéo dài thêm 24 giờ nếu cần Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh vào ống chứa 1 ml Muller Kauffmann tetrathionat và ủ ở 37 ºC trong 24 giờ.
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Từ môi trường Rappaport–Vassliadis Soya Pepton, chuyển cấy sang môi trường BGA và ủ ở 37 ºC trong 24 giờ, kết quả cho thấy khuẩn lạc có màu đỏ hồng, hình dạng tròn bóng và lồi Tiếp theo, từ môi trường Muller Kauffmann ria, cấy sang môi trường XLT4 và ủ ở 37 ºC trong 24 giờ, kết quả cho thấy khuẩn lạc có màu đen, tròn bóng và lồi Bước 4 là khẳng định kết quả.
Thử nghiệm H2S cho thấy Salmonella chỉ lên men đường glucose, dẫn đến phần thạch nghiêng có màu đỏ và phần sâu có màu vàng Hầu hết các dòng Salmonella đều sinh H2S, tạo ra các vệt màu đen trong môi trường Vi khuẩn sinh hơi có thể làm rạn nứt thạch hoặc đẩy môi trường lên, tạo khoảng không dưới đáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea cho thấy Salmonella không phân giải ure, do đó không làm thay đổi pH của môi trường Sau khi nuôi cấy, môi trường canh thang ure vẫn giữ nguyên màu vàng cam.
Thử nghiệm Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường
Tryptophan Ủ ở 37 º C trong 24 giờ Sau khi ủ nhỏ 1 giọt thuốc thử Kovac’s Nếu xuất hiện vòng màu đỏ - phản ứng dương tính Nếu xuất hiện vòng màu nâu vàng
3.4.3.3 Phương pháp kháng sinh đồ
Phương pháp Bauer - Kirby, được mô tả bởi Carter và Cole năm 1990, được sử dụng để đánh giá tính mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh trong thí nghiệm này Kết quả thử khả năng mẫn cảm được đánh giá dựa trên bảng M100-S24 theo Wayne (2014) Vi khuẩn được phân lập từ mẫu bệnh phẩm và nuôi cấy trên môi trường thạch ống nghiêng NA ở 37ºC trong 24 giờ Sau đó, sinh khối vi khuẩn được pha loãng trong dung dịch NaCl 0,9% vô trùng để đạt độ đục Mc Farland 0,5 Tiếp theo, tăm bông vô trùng được sử dụng để trải đều huyễn dịch vi khuẩn trên bề mặt đĩa thạch Muller – Hinton (MH), và các đĩa giấy tẩm kháng sinh được đặt lên bề mặt thạch, với mỗi đĩa có 5-6 khoanh giấy, rồi ủ ở 37ºC trong 18-24 giờ.
Các bước tiến hành như sau:
- Bước 1: chuẩn bị môi trường thạch Muller – Hinton.
- Bước 2: các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp được dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller – Hinton.
- Bước 3: giấy tẩm kháng sinh được đặt khoảng cách đều nhau trong đĩa.
- Bước 4: nuôi dưỡng ở 37ºC trong 18-24 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn để đánh giá mức độ nhảy cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn
Hình 3.1 Vòng vô khuẩn của vi khuẩn trên thạch Mueller-Hinton
Kết quả được xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, nhằm đánh giá tính mẫn cảm hoặc đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh tương ứng, như thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm với một sốloại kháng sinh của vi khuẩn
Trong nghiên cứu này, các loại kháng sinh được lựa chọn để kiểm tra khả năng mẫn cảm của vi khuẩn E coli và Salmonella dựa trên tiêu chuẩn quốc tế về danh mục kháng sinh cần kiểm soát đối với vi khuẩn kháng thuốc.
3.4.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2010.
Trong đó: : Số trung bình xi: Số hạng thứ i n: Dung lượng mẫu