Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm, nguyên liệu nghiên cứu
Ngan Pháp và vịt Super Meat tại các hộ gia đình và trang trại ở 6 xã: Nam Phong, Nam Triều, Hồng Thái, Chuyên Mỹ, Đại Thắng, Đại Xuyên đang nghi mắc bệnh nấm phổi (Aspergillosis) Các con ngan và vịt này có độ tuổi từ 5 đến 15 ngày.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm, bộ môn Bệnh lý, khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Địa điểm theo dõi và lấy mẫu: Tại 6 xã: Nam Phong, Nam Triều, Hồng Thái, Chuyên Mỹ,Đại Thắng, Đại Xuyên.
Mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán Aspergillosis ở ngan và vịt bao gồm các bộ phận như phổi, túi khí, tim, gan, não, ruột và dạ dày Để làm tiêu bản vi thể, cần sử dụng hóa chất như Formol 10%, cồn, xylen, paraffin, cùng với thuốc nhuộm heamatoxylin và eosin.
Máy đúc tự động, máy cắt Microtom, máy li tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh gel, tủ ấm 37 0 C, tủ lạnh.
Các dụng cụ khác gồm: lam kính, kính hiển vi, ống eppendoft, pipet, găng tay….
Nội dung nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết của đàn ngan, vịt bị bệnh nấm phổi tại Phú Xuyên – Hà Nội.
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi.
- Xác định sự biến đổi bệnh tích đại thể của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi ở Phú Xuyên – Hà Nội.
- Xác định sự biến đổi bệnh tích vi thể của bệnh.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp xác định triệu chứng lâm sàng và bệnh tích Để xác định triệu chứng lâm sàng của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi được xác định bằng phương pháp khám thường quy, theo dõi các chỉ tiêu về trạng thái bên ngoài: ăn uống, hô hấp và trạng thái cơ thể
Mổ khám ngan và vịt bị bệnh giúp kiểm tra các bệnh tích bằng cách quan sát sự biến đổi của niêm mạc phổi, túi khí, yết hầu, màng ngực, bao tim, gan, màng treo ruột và não của con vật.
3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi
Căn cứ vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích Xác định tỷ lệ mắc bệnh , tỷ lệ chết, tỷ lệ tử vong theo công thức:
3.3.3 Phương pháp điều tra lấy mẫu
3.3.4 Phương pháp làm tiêu bản vi thể
* Lấy mẫu bệnh phẩm để kiểm tra bệnh tích vi thể
Khi thực hiện phẫu thuật khám để quan sát hạt nấm trong các cơ quan phủ tạng, việc lấy mẫu bệnh phẩm là rất quan trọng nhằm kiểm tra những biến đổi bệnh tích không thể nhìn thấy bằng mắt thường Để đảm bảo độ chính xác trong kết quả, cần phải chọn lọc, bảo quản và cố định mẫu bệnh phẩm đúng phương pháp.
+ Bệnh phẩm lấy không dày quá 0,5 cm, đủ rộng để định được tổ chức gốc, hai mặt cắt phải song song.
Bệnh phẩm cần được lấy từ cả phần lành và phần bệnh, với tổ chức tươi, tốt nhất là thực hiện ngay sau khi giết mổ Đối với ngan và vịt chết, cần lấy mẫu trong vòng 6 giờ sau khi chết để tránh hiện tượng hoại tử.
+ Động tác lấy mẫu phải nhẹ nhàng, chính xác tránh đụng chạm mạnh vì dễ gây dập nát do tác nhân cơ học.
+ Không dùng kẹp, panh kẹp vào những vùng tổ chức sẽ lấy mẫu Không bóp mạnh, rửa mẫu.
+ Khi cắt phải dùng dao sắc và cắt theo một hướng.
+ Lấy mẫu xong phải cố định ngay, tránh hiện tượng tự hoại tử sau khi chết của tế bào.
Tất cả các tổ chức cơ thể lấy bệnh phẩm đều cần được ngâm trong dung dịch cố định Đặc biệt, đối với phổi, thường được bọc trong một lớp bông trước khi ngâm vào thuốc cố định để bảo quản tốt hơn.
- Chiều dày mẫu vật có ảnh hưởng đến kết quả cố định, do vậy chiều dày bệnh phẩm không được quá 0,5cm.
- Khối lượng thuốc cố định tối thiểu là một phần mẫu vật, chín phần thuốc cố định.
Thời gian cố định mẫu vật thay đổi tùy thuộc vào từng loại thuốc cố định, thường dao động từ 24-48 giờ Nếu vượt quá thời gian này, cần phải loại bỏ hóa chất cũ và thay thế bằng chất cố định mới.
- Nhiệt độ cố định cao thì khả năng ngấm của chất cố định tăng, nhiệt độ thông thường là 30-37 O C.
- Rửa mô sau khi cố định để làm mất các chất cố định, thời gian rửa ngang với thời gian cố định là tốt nhất.
Thuốc cố định chất khoáng: axit khoáng và muối khoáng
Thuốc cố định axit khoáng: acid chromic, acid osmic.
Thuốc cố định muối khoáng: bichromat kiềm, bichromat acid… Thuốc cố định hữu cơ:
Các acid hữu cơ: acid acetic, acid picric.
Các chất khử oxy hữu cơ: methylic, ethylic, folmandehyd. Thuốc cố định hỗn hợp
Dung dịch Bouin (acid acetic, acid picric, focmol)
Dung dịch Duboscq – Brasin (cồn, focmol, acid acetic, acod picric) Dung dịch Carnoy (cồn, chloroform, acid acetic)
Những thuốc cố định thường dùng là:
Dung dịch acid picric bão hoà
* Phương pháp tạo khuôn mẫu vật:
Mục đích của việc tạo khuôn mẫu vật là gắn mẫu vào khối nến, giúp nến thấm vào các chi tiết nhỏ nhất của tổ chức và tế bào Khi nến đông lại, nó tạo thành một khối duy nhất, cho phép việc cắt mô thành những lát mỏng trở nên dễ dàng Điều này là cần thiết cho việc chẩn đoán vi thể trên kính hiển vi quang học.
Nến là một chất được chiết xuất từ dầu mỏ, có nhiều điểm nóng chảy khác nhau, dao động từ 35-65 độ C Nó không hòa tan trong nước và chỉ tan một chút trong cồn, nhưng dễ dàng hòa tan trong chloroform, toluene và xylen Để tẩm nến và tạo khuôn, cần thực hiện một số giai đoạn nhất định.
Khử nước là bước quan trọng trong quá trình xử lý bệnh phẩm Sau khi cố định, bệnh phẩm được rửa qua nước và ngâm trong các nồng độ cồn khác nhau (70°, 90°, 100°) để loại bỏ nước Mỗi cốc cồn chỉ cần ngâm sâu khoảng 1cm trên bề mặt bệnh phẩm, và thời gian khử nước phụ thuộc vào độ dày của mẫu Mục tiêu của quá trình này là loại bỏ hoàn toàn nước mà không làm thay đổi cấu trúc bên trong của bệnh phẩm Để kiểm tra xem bệnh phẩm đã khử nước hoàn toàn hay chưa, chỉ cần cho mẫu vào cốc xylol; nếu xylol trong, bệnh phẩm đã khô, còn nếu xylol đục màu trắng sữa thì cần tiếp tục khử nước trong cồn 100°.
Dung dịch để khử nước là loại cồn etylic, methylic, butylic.
Để xử lý bệnh phẩm, dung dịch nến được sử dụng để tẩy cồn sau khi rút nước Dung dịch này cần có khả năng hòa tan cả cồn và nến, thường là xylol Thời gian ngâm sẽ phụ thuộc vào loại dung dịch, thường cần chuyển qua hai cốc cho đến khi bệnh phẩm trong suốt như miếng thạch.
+ Làm ngấm nến: Miếng bệnh phẩm đã được làm trong chuyển qua 3 bát nến nóng chảy với nhiệt dộ phù hợp.
Để tạo khuôn bệnh phẩm, đầu tiên, lấy miếng bệnh phẩm ngấm nến từ bát nến và đặt vào đáy khuôn đã chứa nến nóng chảy, đảm bảo mặt cắt của miếng bệnh phẩm hướng xuống dưới Sau đó, làm lạnh khuôn trong nước hoặc tủ lạnh Cuối cùng, đánh dấu bệnh phẩm bằng cách sử dụng que nhọn để ghi vào cạnh khối nến.
Phương pháp cắt bệnh phẩm nhằm mục đích tạo ra những lát mỏng cho phép ánh sáng xuyên qua, phục vụ cho việc nghiên cứu bằng kính hiển vi quang học Quá trình cắt bệnh phẩm được thực hiện qua 4 giai đoạn trên máy chuyên dụng.
Chuẩn bị khuôn nến bằng cách gọt khối nến thành hình chóp cụt và làm phẳng mặt cắt của khối nến sát với miếng bệnh phẩm Sau đó, gắn khối nến vào bộ phận mang trên máy.
- Đặt dao vào máy: độ lệch của lưỡi dao khoảng từ 15 – 30 o so với mặt của khối nến
Trước khi cắt bệnh phẩm, cần điều chỉnh độ dày, bắt đầu từ 10-16µm Sau đó, sử dụng khối nến để cắt và điều chỉnh độ dày xuống còn 3-5µm.
Để dán lát cắt vào phiến kính, trước tiên cần nhẹ nhàng lấy băng cắt ra khỏi lưỡi dao và đặt lên phiến giấy đen Sau đó, tách một lát cắt và đặt lên phiến kính Trước khi dán, cần làm cho lát cắt giãn phẳng bằng cách ngâm nó trong nồi nước nóng 40 độ C Cuối cùng, vớt lát cắt ra và dán lên phiến kính bằng dung dịch lòng trắng trứng.