NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Tụ cầu khuẩn Staphylococcus spp đã được phân lập từ đường hô hấp của gà nuôi tại huyện Gia Lâm, Hà Nội, cùng với một số tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Hải Dương.
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi đã thực hiện một số nội dung sau:
Phân lập và thuần khiết vi khuẩn;
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn; Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học của vi khuẩn;
Nghiên cứu biến động của quá trình sản sinh màng sinh học theo thời gian;
Nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học.
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 4/2015 đến tháng 3/2016.
Nguyên liệu
- Thạch thường của hãng Merck
- Môi trường lỏng: tryptone water, tryptic soy broth, peptone water của hãng Merck
- Yeast extract của hãng Oxoid
- Giấy tẩm kháng sinh, kháng sinh bột
- Đĩa nhựa 96 giếng vô trùng (SPL Life Sciences)
- Hóa chất dùng trong định lượng màng sinh học: methanol, đệm PBS 1x, dung dịch 1% tím kết tinh (crystal violet), dung dịch cồn 80% có bổ sung 5% sodium dodecyl sulfate
- Máy đọc ELISA (Biotek, ELx808).
Phương pháp nghiên cứu
Dịch hầu họng được thu thập ngẫu nhiên từ đàn gà nuôi tại huyện Gia Lâm, Hà Nội và các tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hải Dương Việc lấy mẫu được thực hiện bằng tăm bông vô trùng từ hầu họng và xoang mũi của gà Các mẫu tăm bông sau đó được bảo quản trong đệm trypton và giữ ở nhiệt độ 4 độ C trong suốt quá trình vận chuyển.
3.6.2 Phương pháp phân lập, thuần khiết vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí được phân lập và thuần khiết theo quy trình tiêu chuẩn của bộ môn Vi sinh vật- Truyền nhiễm, Khoa Thú y Quy trình bao gồm: (i) sử dụng ria cấy tăm bông để thấm dịch swab trên đĩa thạch thường, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm ở 37 o C trong 24 giờ; (ii) lựa chọn các khuẩn lạc có màu trắng hoặc vàng, hình dạng S, với kích thước lớn hoặc nhỏ để tiến hành thuần khiết; (iii) thực hiện nhuộm Gram và chọn mẫu có tụ cầu khuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.6.3 Phương pháp xác định khả năng sản sinh màng biofilm Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học được thực hiện trên đĩa 96 giếng (Stepanovic, 2007) Các bước được tóm tắt như sau: Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường lỏng
- Chuyển 1 ml huyễn dịch vi khuẩn (pha trong TSB+Y) vào 9 ml dung dịch
TSB+Y vô trùng Nuôi tĩnh ở 37 o C trong vòng 12 giờ Huyễn dịch vi khuẩn là nước rửa mặt thạch chủng tụ cầu khuẩn thuần khiết
Bước 2: Chuẩn bị huyễn dịch vi khuẩn 1/10
- Chuyển 1 ml vi khuẩn sau nuôi cấy 12 giờ trong môi trường TSB+Y vào ống nghiệm chứa 9 ml môi trường TSB+Y mới, vô trùng Trộn đều. Bước 3: Nuôi cấy tĩnh
- Chuyển 100 àl huyễn dịch vi khuẩn (1/10) vào mỗi giếng của đĩa nhựa vụ trựng 96 giếng (đó cú sẵn 100 àl mụi trường TSB+Y) Nuụi tĩnh ở 37 o C/24 giờ
Bước 4: Rửa trôi vi khuẩn không bám vào thành/ đáy đĩa
Để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn không nằm trong màng sinh học, hãy rửa mỗi giếng bằng 200 ml PBS 1x và lặp lại quy trình này 3 lần Sau đó, thấm khô giếng trước khi tiến hành bước tiếp theo là cố định màng sinh học.
- Cố định vi khuẩn bỏm vào thành/ đỏy đĩa bằng 200 àl methanol;
- Giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 20 phút;
- Loại bỏ hoàn toàn methanol trong giếng bằng cách thấm khô Bước 6: Nhuộm màng sinh học
- Bổ sung vào mỗi giếng 200 àl dung dịch tớm kết tinh 1%;
- Giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 phút;
- Loại bỏ hoàn toàn dung dịch tím kết tinh;
Để loại bỏ hoàn toàn thuốc nhuộm thừa không thấm vào lớp màng sinh học, cần rửa mỗi giếng bằng 200 µl PBS 1x Quy trình này nên được lặp lại ít nhất 3 lần cho đến khi không còn dấu hiệu màu sắc của thuốc nhuộm sau khi giếng đã thấm khô.
Bước 7: Đo mật độ quang
- Hòa tan thuốc nhuộm tím kết tinh thấm vào màng sinh học bằng cỏch bổ sung vào mỗi giếng 200 àl dung dịch ethanol 95%;
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút;
- Đo giá trị OD ở bước sóng 595 nm
Bước 8: Phân tích kết quả sản sinh màng sinh học theo phương pháp của Stepanovic (2000) được thực hiện bằng cách tính toán giá trị OD với công thức ODc = ODđc + 3SD, trong đó ODđc là giá trị OD trung bình của các mẫu đối chứng âm và SD là độ lệch chuẩn của giá trị OD của các mẫu đối chứng âm Mẫu dương tính được xác định khi giá trị ODmẫu > ODc, từ đó đánh giá mức tạo màng sinh học.
ODmẫu ≤ ODc ODc < ODmẫu ≤ 2ODc 2ODc < ODmẫu ≤ 4ODc 4ODc < ODmẫu
3.6.4 Phương pháp nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian Để nghiên cứu biến động của sự sản sinh màng sinh học theo thời gian, chúng tôi nuôi vi khuẩn vào các giếng của đĩa 96 giếng Nuôi tĩnh ở 37 o C, loại bỏ dung dịch trong giếng, cố định lớp biofilm hình thành (nếu có) sau mỗi 4 giờ Các bước định lượng lớp biofilm tại mỗi thời điểm được thực hiện theo phương pháp trình bày ở mục 3.6.3 Các bước thực hiện được tóm tắt ở hình 3.1.
Hình 3.1 Các bước nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian
3.6.5 Phương pháp xác định khả năng đề kháng kháng sinh
Khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành biofilm được tóm tắt như sau: đầu tiên, cần xác định loại kháng sinh mà vi khuẩn phân lập có khả năng mẫn cảm.
Để xác định nồng độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn, cần nuôi cấy tĩnh vi khuẩn trên đĩa 96 giếng trong vòng 20 giờ nhằm hình thành biofilm.
Để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn không nằm trong lớp biofilm, cần giữ lại biofilm và sau đó thêm kháng sinh với nồng độ cao hơn MIC, lưu trữ trong khoảng thời gian từ 12 đến 24 giờ.
(vi) loại bỏ kháng sinh, bổ sung môi trường và nuôi thêm trong vòng 24 giờ ở
Nghiên cứu được thực hiện ở nhiệt độ 37 độ C, bao gồm việc thu hồi vi khuẩn từ các giếng, đo giá trị OD 630 và xác định tỷ lệ vi khuẩn tại các nồng độ kháng sinh khác nhau so với giếng đối chứng không có kháng sinh Các bước thực hiện được tóm tắt trong hình 3.2.
Hình 3.2 Tóm tắt các bước nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn
Hình 4.1 trình bày tóm tắt kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí trực tiếp từ mẫu swab trên môi trường thạch thường
Hình 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu swab
Từ các mẫu swab, chúng tôi đã phân lập nhiều loại vi khuẩn hiếu khí với các khuẩn lạc dạng S, có kích thước khác nhau Nhằm mục tiêu thuần khiết tụ cầu khuẩn, chúng tôi đã chọn những khuẩn lạc có màu vàng (bao gồm vàng rơm, vàng chanh và không màu) Hình 4.2 minh họa kết quả thuần khiết của vi khuẩn Staphylococcus spp.
Hình 4.2 Kết quả thuần khiết tụ cầu khuẩn từ mẫu swab
Các mẫu có màu vàng rơm, vàng chanh và không màu lần lượt được sắp xếp ở hàng trên cùng, hàng thứ hai và hàng dưới cùng.
Sau 2 lần thuần khiết liên tiếp, chúng tôi đã thu được những thạch trong đó chỉ quan sát được một loại khuẩn lạc (giống nhau về dạng khuẩn lạc, màu sắc) Các loại khuẩn lạc thuần có màu phổ biến là vàng rơm, vàng chanh hoặc không màu (hình 4.2) Hình 4.3 là kết quả nhuộm Gram để khẳng định chắc chắn sự thuần khiết của khuẩn lạc
Hình 4.3 Hình thái của chủng tụ cầu khuẩn thuần khiết
Hình ảnh vi khuẩn ở độ phòng đại 1000 lần (ảnh nhỏ), vi khuẩn xếp cạnh nhau có dạng chùm nho (mũi tên, ảnh lớn).
Dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần, tụ cầu khuẩn hiện rõ với đặc điểm Gram dương (màu tím xanh) và thường tập trung thành đám giống như chùm nho Quan sát vi trường cho thấy chỉ có hình thái của một loại vi khuẩn duy nhất Những kết quả này chứng minh rằng các chủng tụ cầu khuẩn đã được thuần khiết thành công Thông tin chi tiết về quá trình phân lập và thuần khiết vi khuẩn được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn Địa điểm lấy mẫu Bắc Giang Vĩnh Phúc Hải Dương
Trong nghiên cứu về đường hô hấp trên của gà, chúng tôi đã thu thập 63 mẫu dịch và thuần khiết được 88 chủng vi khuẩn Gram dương Đặc biệt, trong số này, 31 chủng tụ cầu khuẩn đã được thuần khiết để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu về hệ vi sinh vật đường hô hấp của gia cầm do nhóm tác giả Poorniya và Upadhey thực hiện đã phân lập được 64 loại vi khuẩn, trong đó Staphylococcus epidemidis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium, Corynebacterium xerosis và Micrococcus spp là các vi khuẩn Gram dương chiếm ưu thế Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli, Citrobacter freundii và Enterobacter aerogenes cũng được ghi nhận Một nghiên cứu khác của Byrum và Slemons chỉ ra sự đa dạng của hệ vi sinh vật đường hô hấp trên gia cầm, bao gồm các vi khuẩn Gram âm và Gram dương như Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermis và Staphylococcus sciuri Tụ cầu khuẩn là loại vi khuẩn phổ biến nhất, với tỷ lệ phân lập đạt 49,21%, phù hợp với các nghiên cứu trước đó Tuy nhiên, do giới hạn của đề tài, việc định loài các chủng tụ cầu khuẩn phân lập được chưa được thực hiện.
Kết quả nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng môi trường dinh dưỡng dạng lỏng tryptic soy broth (TSB) với 0,05% yeast extract (Y) để khảo sát sự hình thành biofilm của các chủng tụ cầu khuẩn, kế thừa từ các nghiên cứu trước (Stepanovic, 2000; Stepanovic, 2007) Loại môi trường tăng sinh có ảnh hưởng lớn đến khả năng sản xuất màng sinh học của vi khuẩn, vì vậy chúng tôi đã kiểm tra khả năng phát triển của 31 chủng tụ cầu khuẩn trước khi định lượng mức sản xuất biofilm nhằm loại trừ sai số do môi trường không phù hợp Kết quả theo dõi sự sinh trưởng theo thời gian được trình bày trong hình 4.4.
Pha tiềm phát (lag phase)
Hình 4.4 Đường cong sinh trưởng của tụ cầu khuẩn ở môi trường TSB-Y.
Giá trị OD trung bình được ký hiệu tại mỗi thời điểm thu mẫu, trong khi đường giới hạn cận trên và cận dưới phản ánh độ lệch chuẩn của giá trị OD từ 31 mẫu.
Số lượng vi khuẩn trong môi trường TSB-Y tăng dần theo thời gian, với giá trị OD 630 sau nuôi lớn hơn trước Đường cong sinh trưởng của 31 chủng tụ cầu khuẩn được chia thành 3 giai đoạn rõ rệt: (i) pha tiềm phát trong 3 giờ đầu, (ii) pha lũy thừa từ 3 - 9 giờ với mức tăng cao nhất là 2,5 lần so với thời điểm 0 giờ, và (iii) pha cân bằng từ 15 - 30 giờ Nghiên cứu dừng lại sau 30 giờ nên không quan sát được pha suy vong của vi khuẩn Kết quả cho thấy TSB-Y là môi trường phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả định lượng khả năng sản sinh màng sinh học
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học của 31 chủng tụ cầu khuẩn, và kết quả định lượng khả năng sản xuất biofilm được trình bày chi tiết trong hình 4.5.
Hình 4.5 Kết quả kiểm tra khả năng tạo màng sinh học
Mỗi chủng tụ cầu được nuôi trên bốn giếng theo cột, trong đó các giếng đối chứng âm (Đ.c) được đánh dấu rõ ràng Các mẫu được phân loại dựa trên khả năng sinh biofilm, bao gồm mạnh (M), trung bình (TB), yếu (Y) và không sản sinh biofilm (-).
Trong nghiên cứu, 8 giếng đối chứng âm chỉ sử dụng môi trường TSB-Y và không có vi khuẩn cho thấy không có hiện tượng giữ màu của thuốc nhuộm Ngược lại, các mẫu nuôi vi khuẩn thể hiện hiện tượng giữ màu thuốc nhuộm tím với các mức độ khác nhau Một số mẫu có màu sắc tương tự như đối chứng âm và được đánh giá là âm tính, không hình thành biofilm Các mẫu được ký hiệu Y, TB và M cho thấy hiện tượng giữ màu thuốc nhuộm và được đánh giá dương tính ở các mức độ khác nhau Hình ảnh minh họa sự hình thành của lớp biofilm được trình bày trong hình 4.6.
Hình 4.6 Màng sinh học nhuộm bằng tím kết tinh 1% (200X)
Sự hình thành biofilm được đánh giá ở mức mạnh (A), trung bình (B) và yếu (C) so với đối chứng (D) không hình thành biofilm.
Hình 4.6 cho thấy giếng đối chứng âm (hình 4.6D) không có sự phát triển của vi khuẩn và không giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh Ngược lại, ở các giếng nuôi cấy vi khuẩn, sự hình thành biofilm được quan sát ở mức độ mạnh (hình 4.6A), trung bình (hình 4.6B) và yếu (hình 4.6C), với hiện tượng giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh trong lớp biofilm Giếng có biofilm hình thành ở mức mạnh cho thấy một lớp vi khuẩn bám chặt trên bề mặt, trong khi giếng có biofilm yếu chỉ có ít lớp vi khuẩn Để đánh giá mức độ hình thành biofilm, chúng tôi đã đo mật độ quang của thuốc nhuộm giữ lại và so sánh với giá trị ODc, 2ODc, 4ODc của đối chứng âm để xác định mẫu có hình thành biofilm hay không cũng như mức độ sản sinh biofilm.
3M 5 8 1M 5 8 4 M 5 6 2 M 5 6 5 M 5 4 3M 5 4 3M 5 3 1M 5 3 5 M 5 2 9 M 5 1 M 5 1 7 5 M 5 0 2 M 4 9 M 49 1 3M 4 7 1M 4 7 4 M 39 2 M 39 4 M 2 4 3M 2 4 2 M 2 4 1M 2 4 M 20 M 19 M 18 M 17 M 16 M 15 M 14 M 1 3 M 12 (+ ) M ạn h (+ ) T ru n g b ìn h (+ ) Y ếu  m tí n h
Hình 4.7 Mức tạo màng sinh học của tụ cầu khuẩn
Kết quả nghiên cứu cho thấy 51,61% mẫu (16/31) có khả năng hình thành màng sinh học ở ba mức độ khác nhau, trong khi 15/31 mẫu không sản sinh màng sinh học Tụ cầu khuẩn, loại vi khuẩn phổ biến trong môi trường và trên cơ thể động vật, có khả năng sản xuất biofilm từ 37,5% đến 57% theo một số nghiên cứu toàn cầu (Mirani, 2013; Oliveira, 2006) Điều này chứng tỏ rằng khả năng sản sinh màng sinh học là đặc trưng chung của các chủng tụ cầu khuẩn.
4.4 BIẾN ĐỘNG CỦA QUÁ TRÌNH SẢN SINH MÀNG SINH HỌC
Dựa trên nghiên cứu về khả năng hình thành màng sinh học, chúng tôi đã lựa chọn 7 chủng vi khuẩn với khả năng sản sinh biofilm khác nhau để phân tích đặc điểm quá trình hình thành màng sinh học theo thời gian Hình 4.8 cho thấy kết quả phân tích sự biến động của lớp biofilm từ 4 giờ đến 40 giờ.
Hình 4.8 Biến động về lượng biofilm sản sinh theo thời gian
Chiều cao cột tại mỗi thời điểm tương ứng với giá trị OD 595 cho thấy sự hình thành biofilm Mẫu có biofilm được biểu thị bằng màu hồng, trong khi mẫu không có biofilm được biểu thị bằng màu xanh Đối với mẫu M12, không có sự hình thành biofilm, với giá trị OD luôn thấp hơn ngưỡng ODc trong suốt thời gian theo dõi Ngược lại, mẫu M49.1 và M24.2 chỉ sản sinh biofilm ở mức yếu, với giá trị OD ít biến động Trong khi đó, các mẫu M47.1, M54.3 và M49.2 có sự hình thành biofilm ở mức trung bình và mạnh, với giá trị OD tăng dần từ 4 giờ đến 20 giờ, sau đó giảm từ 24 giờ đến 40 giờ, minh họa rõ ràng sự biến động của biofilm theo thời gian.
Hình 4.9 Biến động màu thuốc nhuộm giữ lại bởi lớp biofilm
Hình 4.9 trình bày sự phát triển của biofilm qua thời gian ở các chủng vi khuẩn với mức độ sản sinh biofilm yếu, trung bình và mạnh Mẫu đối chứng (Đ.c) và mẫu M12 không giữ màu thuốc nhuộm trong các thời điểm lấy mẫu từ 4 giờ đến 40 giờ Ngược lại, mẫu M49.2 (với biofilm mạnh) cho thấy sự gia tăng rõ rệt về màu tím gentian từ 4 giờ đến 20 giờ, sau đó có xu hướng giảm từ 24 giờ đến 40 giờ.
Kết quả từ hình 4.8 và hình 4.9 cho thấy sự hình thành biofilm là một quá trình động và phụ thuộc vào thời gian Lượng biofilm sản sinh không luôn tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy tĩnh vi khuẩn, mà đạt cực đại rồi sau đó giảm xuống Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự giảm dần các chất dinh dưỡng trong giếng nuôi vi khuẩn theo thời gian, cùng với việc cấu trúc biofilm bị phá vỡ một phần để giải phóng vi khuẩn.
Nghiên cứu năm 2006 của Holá cho thấy rằng nhiệt độ, thời gian và chất dinh dưỡng ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành biofilm của vi khuẩn Staphylococcus epidermidis Cụ thể, ở nhiệt độ 25 o C, quá trình hình thành màng sinh học diễn ra rất chậm, trong khi ở 37 o C, vi khuẩn này hình thành biofilm nhanh chóng chỉ sau 2-4 giờ nuôi cấy, và lớp màng này hoàn chỉnh sau 12-14 giờ Tuy nhiên, nếu tiếp tục nuôi cấy từ 34-42 giờ, sự hình thành biofilm sẽ giảm dần Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy sự biến động tương tự trong quá trình hình thành lớp biofilm theo thời gian.
Nghiên cứu về sự biến động của biofilm theo thời gian nhấn mạnh tầm quan trọng của việc hiểu rõ đặc điểm hình thành biofilm ở các chủng tụ cầu khuẩn Điều này là cần thiết trước khi tiến hành các nghiên cứu định lượng biofilm hay thử nghiệm khả năng đề kháng kháng sinh của lớp biofilm, do lớp biofilm thường hình thành mạnh mẽ.
Thời gian nuôi vi khuẩn có ảnh hưởng đáng kể đến sự sản sinh biofilm, điều này phù hợp với khuyến cáo trước đây của Stepanovic (2007) Việc nghiên cứu sự phát triển của biofilm cần chú ý đến các thời điểm khác nhau để đạt được kết quả chính xác.
4.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC Để nghiên cứu ảnh hưởng của biofilm tới khả năng đề kháng kháng sinh, trước hết cần phải tìm được loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm Tham khảo cơ sở dữ liệu của EUCAST về các loại kháng sinh mà tụ cầu khuẩn mẫn cảm (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, 2017), chúng tôi đã tiến hành thử tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh Kết quả được trình bày tóm tắt ở hình 4.10
Hình 4.10 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh
31 chủng tụ cầu khuẩn được thử tính mẫn cảm với 8 loại kháng sinh gồm:
Neomicin (Ne), Doxycycline (Dx), Penicillin (Pn), Tetracycline (Te), Kanamycin (Kn), Gentamicin (Ge), Norfloxacin (Nr) và hprime/sulfam ethoxazol (Bt).
Trục Ox trên biểu đồ thể hiện đường kính vòng vô khuẩn (mm), trong khi trục Oy biểu thị số lượng chủng thử kháng sinh đồ Mỗi loại kháng sinh được phân chia bởi đường nét đứt màu đỏ, với mức kháng được xác định ở phía bên trái và mức mẫn cảm ở phía bên phải.
Kết quả hình 4.10 cho biết 31/31 chủng đều kháng penicillin
(đường kính vòng vô khuẩn < 26 mm, theo tiêu chuẩn của
EUCAST) Kết quả này phù hợp với đặc điểm của các chủng tụ cầu khuẩn đều sản sinh enzyme penicillinase.
Tất cả 31 chủng tụ cầu khuẩn đều kháng tetracycline, trong khi đó, mức độ mẫn cảm và kháng với 6 loại kháng sinh khác nhau giữa các chủng không đồng nhất Tổng hợp kết quả cho thấy đa số các chủng tụ cầu khuẩn có sự khác biệt rõ rệt trong khả năng kháng thuốc.
Kết quả nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học
Để nghiên cứu ảnh hưởng của biofilm đến khả năng đề kháng kháng sinh, trước tiên cần xác định loại kháng sinh mà vi khuẩn nhạy cảm Dựa vào cơ sở dữ liệu của EUCAST về sự nhạy cảm của tụ cầu khuẩn với các loại kháng sinh (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, 2017), chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm tính nhạy cảm với một số kháng sinh, và kết quả được tóm tắt trong hình 4.10.
Hình 4.10 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh
31 chủng tụ cầu khuẩn được thử tính mẫn cảm với 8 loại kháng sinh gồm:
Neomicin (Ne), Doxycycline (Dx), Penicillin (Pn), Tetracycline (Te), Kanamycin (Kn), Gentamicin (Ge), Norfloxacin (Nr) và hprime/sulfam ethoxazol (Bt).
Trục Ox trên biểu đồ thể hiện đường kính vòng vô khuẩn (mm), trong khi trục Oy biểu thị số lượng chủng thử kháng sinh đồ Đối với từng loại kháng sinh, đường nét đứt màu đỏ đánh dấu giới hạn mức kháng (bên trái) và mức mẫn cảm (bên phải).
Kết quả hình 4.10 cho biết 31/31 chủng đều kháng penicillin
(đường kính vòng vô khuẩn < 26 mm, theo tiêu chuẩn của
EUCAST) Kết quả này phù hợp với đặc điểm của các chủng tụ cầu khuẩn đều sản sinh enzyme penicillinase.
Tất cả 31 chủng tụ cầu khuẩn đều kháng tetracycline, trong khi đó, độ nhạy cảm và kháng của các chủng này đối với 6 loại kháng sinh còn lại có sự khác biệt Kết quả cho thấy đa số các chủng tụ cầu khuẩn có tính mẫn cảm không đồng nhất với từng loại kháng sinh.
Chúng tôi đã chọn norfloxacin để chứng minh khả năng đề kháng kháng sinh, sử dụng nồng độ cao gấp 10 lần và 100 lần nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) nhằm tác động lên vi khuẩn trong lớp màng sinh học trong vòng 12 giờ Sau thời gian tác động, môi trường TSB-Y được bổ sung và tiếp tục nuôi trong 24 giờ Kết quả xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trong màng sinh học sau khi chịu tác động của kháng sinh được trình bày trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả xác định khả năng đề kháng kháng sinh
Mẫu thử nghiệm M24.1 M24.2 M39.2 M47.1 M49.1 M49.2 Trung bình
Các mẫu đối chứng không có vi khuẩn cho thấy môi trường nuôi không vẩn đục, với giá trị OD 630 từ 0,032 đến 0,044 Ngược lại, các mẫu nuôi vi khuẩn trong lớp biofilm sau khi tiếp xúc với kháng sinh có hiện tượng vẩn đục, với giá trị OD 630 tăng tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng sinh Ở nồng độ kháng sinh 100x, 10x và 1x, đậm độ vi khuẩn giảm lần lượt khoảng 7,4 lần, 6,2 lần và 3,4 lần so với đậm độ vi khuẩn ở giếng không có kháng sinh Kết quả cho thấy vi khuẩn vẫn sống sót trong lớp màng sinh học sau khi tiếp xúc với kháng sinh, chứng tỏ vi khuẩn trong màng sinh học có khả năng kháng lại nồng độ kháng sinh cao gấp 10 lần và 100 lần nồng độ MIC.
Trong nghiên cứu về khả năng đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus, Urish (2016) cho thấy rằng nồng độ cao của cefazolin chỉ làm giảm lượng biofilm mà không loại bỏ hoàn toàn Tỷ lệ vi khuẩn sống sót trong biofilm sau khi tiếp xúc với cefazolin, gentamicin và vancomycin dao động từ 2,0% đến 57,9% khi sử dụng nồng độ gấp 10 lần nồng độ tối thiểu ức chế Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi, xác nhận khả năng đề kháng kháng sinh cao của vi khuẩn sản sinh biofilm.
Nghiên cứu cho thấy các chủng tụ cầu khuẩn phân lập có khả năng sản sinh biofilm với mức độ khác nhau, và lớp biofilm này giúp vi khuẩn kháng lại nồng độ kháng sinh cao gấp 100 lần nồng độ MIC Tuy nhiên, do giới hạn của đề tài, chúng tôi chưa thể khảo sát giới hạn đề kháng với nồng độ kháng sinh lớn nhất của vi khuẩn trong lớp biofilm.