Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
+ Đàn vịt nuôi mắc bệnh Dịch tả trên địa bàn huyện Thái Thụy tỉnh Thái Bình với số hộ điều tra đại diện là 250 hộ.
+ Địa điểm nghiên cứu các bệnh tích vi thể và chỉ tiêu huyết học: phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú Y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam
+ Địa điểm lấy mẫu: một số hộ gia đình chăn nuôi có vịt mắc bệnh Dịch tả
Thời gian: từ tháng 9/2016 đến tháng 7/2017.
3.3 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Vịt mắc bệnh dịch tả (được chẩn đoán nhanh bằng phương phápPCR (Polymerase Chain Reactio.
- Máu của vịt mắc bệnh Dịch tả và vịt khỏe.
- Mẫu bệnh phẩm: Gồm các loại mẫu lấy từ cơ thể vịt mắc Dịch tả vịt bao gồm: gan, thận, lách, ruột…
Để thực hiện các thí nghiệm và quy trình nghiên cứu, cần sử dụng một số dụng cụ thiết yếu như tủ lạnh, tủ sấy, tủ ấm 37°C và 56°C, máy đúc Block, khuôn đúc, máy cắt mảnh Microtom và kính hiển vi quang học Ngoài ra, các dụng cụ khác như đũa thủy tinh, ống nghiệm, máy li tâm, vòng vớt, lam kính, la men, dao, pank, kẹp, cốc đựng hóa chất, đèn cồn, xylanh, kim lấy máu và buồng đếm Mc.Master cũng rất quan trọng trong việc tiến hành các thí nghiệm chính xác và hiệu quả.
+ Hóa chất: Nước cất, Formol 10%, thuốc nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE), cồn, xylen, paraffil đã nấu với sáp ong…
- Khảo sát tình hình chăn nuôi, tình hình dịch bệnh Dịch tả vịt trên đàn vịt nuôi tại huyện Thái Thụy tỉnh Thái Bình.
- Nghiên cứu một số triệu chứng lâm sàng chủ yếu của vịt mắc bệnh Dịch tả.
- Nghiên cứu một số bệnh tích đại thể của vịt mắc bệnh Dịch tả.
- Nghiên cứu bệnh tích vi thể của một số cơ quan của vịt mắc bệnh Dịch tả
- Nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học của vịt mắc bệnh Dịch tả. 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để điều tra và xác định tình hình bệnh Dịch tả vịt, chúng tôi tiến hành khảo sát thực trạng thông qua phương pháp phỏng vấn trực tiếp các hộ nuôi vịt và cán bộ thú y cơ sở Dữ liệu được thu thập từ phiếu điều tra và tổng hợp thông tin về dịch bệnh từ Chi cục Chăn nuôi và Thú y, cũng như Trạm Chăn nuôi và Thú y huyện Thái Thụy.
3.5.2 Nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học
Chúng tôi tiến hành lấy máu ở tim của vịt mắc Dịch tả vịt vào lúc sáng sớm, trước khi cho vịt ăn.
Máu lấy xong đưa nhanh vào ống EDTA, lắc nhẹ, bảo quản trong bình lạnh từ 2 - 8 0 C.
Các chỉ tiêu huyết học được đo trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu.
- Chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học như sau: + Số lượng hồng cầu (RBC, triệu/àl), (1mm 3 = 1àl)
+ Hàm lượng huyết sắc tố (HGB, g/l) + Tỷ khối huyết cầu (HCT, %)
+ Thể tích trung bình hồng cầu (MCV, fl)
+ Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH, pg)
+ Số lượng bạch cầu (WBC, nghỡn/àl) và cụng thức bạch cầu (%). 3.5.3 Phương pháp mổ khám
Vịt mắc bệnh được cố định trên bàn mổ để tiến hành khám bệnh theo trình tự từ trên xuống dưới Quá trình này bao gồm việc bộc lộ tất cả các cơ quan nhằm quan sát và phát hiện những biến đổi bệnh lý Các mẫu như gan, lách, thận sẽ được lấy ra và ngâm bảo quản trong dung dịch formol 10% để phục vụ cho việc làm tiêu bản vi thể.
3.5.4 Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản tẩm đúc parafin theo Robert (1969), Burn (1974), cắt dán mảnh bằng máy cắt chuyên dụng, nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE).
Mỗi con vịt bệnh sẽ được lấy mẫu từ hai cơ quan khác nhau, sau đó tạo thành hai block mẫu Các block này sẽ được cắt và nhuộm để tạo tiêu bản, rồi được soi dưới kính hiển vi nhằm xác định kết quả bệnh tích vi thể Nếu một block có từ hai tiêu bản trở lên có bệnh tích, nó sẽ được coi là dương tính.
Quy trình làm tiêu bản: Các bước tiến hành
Để tiến hành thí nghiệm, cần chuẩn bị các dụng cụ và hóa chất như: lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37ºC, máy cắt mảnh microtom, nước ấm từ 48 – 52ºC, xylen, paraffin, và thuốc nhuộm Hematoxylin – Eosin.
- Lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm là gan, thận, lách,…
- Cố định bệnh phẩm (mục đích để giết chết tổ chức).
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol).
- Vùi bệnh phẩm: Mục đích tạo ra các chất nền cho tổ chức dễ cắt.
Để rửa formol, trước tiên cần lấy tổ chức ra khỏi bình chứa formol 10%, sau đó cắt thành các miếng có kích thước khoảng 4 – 5mm Tiếp theo, rửa các miếng này dưới vòi nước chảy nhẹ trong khoảng 12 – 24 giờ để loại bỏ hoàn toàn formol.
+ Khử nước: Cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn
Mục đích để khử nước ra khỏi tổ chức.
+ Khử cồn: Cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen Xylen I: 4 giờ
Mục đích để khử hết cồn ra khỏi tổ chức.
Yêu cầu: Khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được Nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
Khử xylen bằng cách cho qua hệ thống paraffin ổn định, trong đó paraffin chứa từ 3-5% sáp ong đã được nấu chảy Quá trình này cần đảo nhiều lần để tạo ra môi trường đồng nhất, ổn định và đặc chắc, không lẫn tạp chất hay bọt Hệ thống này bao gồm ba lọ.
Parafin I: 6 giờ trong tủ ấm 56ºC
Parafin II: 6 giờ trong tủ ấm 56ºC
Parafin III: 12 giờ trong tủ ấm 56ºC
Mục đích để khử hết xylen trong tổ chức Trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm đều trong các kẽ mô bào.
Nếu nhiệt độ trên 56ºC thì miếng tổ chức sẽ giòn và dễ vỡ, khó cắt.
+ Mục đích: Đưa bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất.
+ Chuẩn bị: Máy đúc block, paraffin.
Để tiến hành, đặt miếng bệnh phẩm vào giữa khuôn block, sau đó nhanh chóng đổ paraffin lỏng vào khuôn Tiếp theo, chuyển khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block cho đến khi block đông cứng và chắc chắn.
+ Chuẩn bị: Máy cắt, dao cắt, nước ấm 48 - 52ºC, phiến kính, pank kẹp…
+ Cắt mảnh: Cắt bằng máy microtom với độ dày khoảng 2 - 5àm, sao cho mảnh cắt khụng rỏch, nỏt phần tổ chức.
Để tãi mảnh, trước tiên hãy dùng pank kẹp mảnh cắt và đặt vào nước lạnh, nhẹ nhàng dàn đều sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt hoàn toàn Tiếp theo, dùng phiến kính hớt mảnh cắt sang nước ấm ở nhiệt độ 48 - 52ºC, sau đó vớt mảnh cắt sao cho vị trí của nó nằm ở 1/3 phiến kính Cuối cùng, để mảnh cắt trong tủ ấm ở 37ºC cho đến khi bệnh phẩm khô, rồi tiến hành nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm HE.
- Nhuộm tiêu bản: Bao gồm các bước sau:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 cốc Xylen I: 15 - 30 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc Cồn 100ºC: 5- 10 phút
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 5 - 10 phút
Để nhuộm Hematoxylin cho tiêu bản, trước tiên cần lau khô nước trên bề mặt Sau đó, nhỏ Hematoxylin lên tiêu bản và để trong khoảng 5 - 10 phút Sau thời gian này, đổ thuốc nhuộm đi và rửa sạch tiêu bản bằng nước Cuối cùng, lau khô nước xung quanh tiêu bản và kiểm tra màu sắc; nếu tiêu bản có màu xanh tím là đạt yêu cầu.
Nếu nhạt màu nhúng tiêu bản qua NaHCO 3 1% (30 giây).
Nếu đậm nhúng qua lọ cồn axit (cồn 96º + HCl 1%) trong 30 giây.
+ Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 - 10 phút, tùy theo thực tế màu Eosin
Sau đó rửa nước chảy 5 - 10 phút cho hết Eosin thừa.
+Tẩy nước: Cho tiêu bản hai lọ cồn tuyệt đối, mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản đi qua hệ thống xylen I, xylen
II sau đó cho vào xylen đã làm nóng trong tủ ấm 37ºC trong vòng 2 phút
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
Để đánh giá kết quả, hãy sử dụng kính hiển vi quang học với vật kính 10x Nếu quan sát thấy màu xanh tím, bào tương có màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước và không có bọt khí, thì kết quả được coi là đạt yêu cầu.
3.5.5 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được trong quá trình điều tra, thí nghiệm được xử lí bằng phương pháp thống kê sinh học, các phần mềm Excel, Minitab.
Sử dụng phần mềm phân tích dịch tễ học WinEpiscope và chương trình
MS Excel để tổng hợp, phân tích và so sánh các tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết với độ tin cậy 95%.
Phương pháp nghiên cứu phân tích dịch tễ học, bao gồm nghiên cứu bệnh chứng và nghiên cứu thuần tập hồi cứu, được áp dụng theo tác giả Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2001) Để ước đoán tỷ lệ lưu hành thực tế, sử dụng công thức của Cameron (1999) nhằm xác định khoảng giao động của tỷ lệ này.
+ LCL (Lower Confidence level) cận dưới của độ tin cậy
+ HCL (High Confidence level) cận trên của độ tin cậy.
PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, THẢO LUẬN
4.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI, TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH DỊCH TẢ VỊT TRÊN ĐÀN VỊT NUÔI TẠI HUYỆN THÁI THỤY TỈNH THÁI BÌNH
4.1.1 Kết quả điều tra tình hình chăn nuôi vịt tại huyện Thái Thụy năm
Huyện Thái Thụy tỉnh Thái Bình sở hữu điều kiện tự nhiên thuận lợi cho phát triển chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi vịt Nhu cầu tiêu thụ thịt và trứng gia cầm là yếu tố thiết yếu cho người dân trong huyện và các vùng lân cận Vịt được nuôi theo hình thức chăn thả tự do trên đồng ruộng và kênh mương, tận dụng thức ăn thừa và phụ phẩm nông nghiệp, kết hợp với thức ăn công nghiệp Giống vịt chủ yếu là vịt cỏ, vịt bầu và vịt lai ngan, được nhập từ các địa phương khác.
Bảng 4.1 Kết quả điều tra tình hình chăn nuôi vịt tại huyện Thái
Quy mô đàn vịt tăng mạnh trong thời gian gần đây; tuy nhiên việc chăn
29 chắn, không rõ nguồn gốc, việc chăn thả không đảm bảo yêu cầu vệ sinh thú y; không thực hiện các quy trình phòng chống dịch bệnh theo quy định.
Thụy Thụy Thụy Thụy Thụy Thái Thái Thái
Ninh Chính Phong Hưng Sơn Hồng Thành Thủy
Để khảo sát tình hình chăn nuôi vịt tại huyện Thái Thụy, chúng tôi đã thực hiện điều tra tại các xã trong khu vực Kết quả điều tra được trình bày trong bảng 4.1, phản ánh số hộ chăn nuôi vịt tại từng xã.
Xã Thụy Ninh có điều kiện tự nhiên thuận lợi với nhiều ao hồ và sông, tạo điều kiện cho hoạt động chăn nuôi Người dân chủ yếu sống dựa vào sản xuất nông nghiệp và chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi vịt Toàn xã có 50 hộ chăn nuôi vịt, trong đó 50% hộ nuôi từ 200 đến 500 con, 30% hộ có đàn vịt trên 500 con, và 20% hộ nuôi dưới 200 con.
- Tại xã Thụy Chính có 25 hộ chăn nuôi trong đó: số hộ chăn nuôi có tổng đàn dưới 200 con chiếm đa số với 20 hộ chiếm tỷ lệ 80
% Số hộ nuôi vịt có tổng đàn từ 200 – 500 con chiếm 12 %, hộ chăn nuôi trên 500 con vịt có 02 hộ chiếm tỷ lệ 8 %.