Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (ralstonia solanacearum smith) hại khoai tây tại quảng ninh và biện pháp sinh học phòng trừ bệnh

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Bệnh cây - Khoa Nông học- Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.

Các vùng trồng khoai tây nổi bật tại tỉnh Quảng Ninh bao gồm: xã Bình Khê thuộc thị xã Đông Triều, phường Minh Thành tại thị xã Quảng Yên, xã Bằng Cả huyện Hoành Bồ, và xã Tình Húc huyện Bình Liêu.

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm tổng hợp thuộc Trung tâm khoa học và sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh.

Thời gian nghiên cứu

-Thời gian nghiên cứu: từ tháng 11/2014 tới tháng 12/2015

Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

-Đề tài nghiên cứu bệnh HXVK hại trên cây khoai tây tại Quảng Ninh

- Mẫu bệnh héo xanh vi khuẩn của cây khoai tây.

- Cây kí chủ: Khoai tây (giống Atlantic – nguồn gốc Mỹ; giống Solara – nguồn gốc Đức), cà chua (Việt Nam), cà tím (Việt Nam).

- Đất cát pha (tầng canh tác) hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 0 C; 1,5at trong thời gian 45 phút, trấu hun.

- Chế phẩm sinh học BT15: Bacillus subtilis; Bacillus lichennifomic;

Sacharomyces cerevisiae và Lactobacillus plantarum được sản xuất dưới dạng dung dịch với mật độ tế bào 10^8 CFU/ml Các chủng vi sinh vật này đã được nuôi cấy và chế biến thành chế phẩm sinh học BT15 tại phòng thí nghiệm Tổng hợp thuộc Trung tâm khoa học và sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh.

Phòng thí nghiệm Tổng hợp tại Trung tâm khoa học và sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh cần một số dụng cụ và trang thiết bị thiết yếu để phục vụ cho nghiên cứu Những thiết bị này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các thí nghiệm.

- Các dụng cụ, trang thiết bị cần thiết phục vụ cho việc nghiên cứu: que cấy, hộp Petri, pipet, đèn cồn, ống nghiệm, khay, chậu vại nhựa, …

Nội dung nghiên cứu

3.4.1 Điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây khoai tây tại Quảng Ninh Điều tra ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái và kỹ thuật canh tác đến sự phát sinh phát triển của bệnh HXVK hại khoai tây tại một số vùng trồng thuộc các huyện, thị xã trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh.

Trong bài viết này, chúng tôi tiến hành điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây khoai tây tại Quảng Ninh, tập trung vào tình hình bệnh lý trong vụ đông năm 2014 và vụ xuân năm 2015 Nghiên cứu nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng của bệnh héo xanh vi khuẩn đến năng suất và chất lượng cây trồng, từ đó đưa ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả cho nông dân trong khu vực.

- Điều tra sự phát sinh phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây khoai tây ởvụ xuân 2015 tại Quảng Ninh:

+) Điều tra ảnh hưởng của giống khoai tây đến sự phát sinh phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn.

+) Điều tra ảnh hưởng của địa thế đất đến sự phát sinh phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn trên giống khoai tây Atlantic.

+) Điều tra ảnh hưởng của mật độ đến sự phát sinh phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn trên giống khoai tây Atlantic.

+) Điều tra ảnh hưởng của công thức luân canh đến sự phát sinh phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn trên giống khoai tây Atlantic.

+) Điều tra ảnh hưởng của lượng bón phân đạm urê đến sự phát sinh phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn trên giống khoai tây Atlantic.

3.4.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên môi trường nhân tạo

-Nuôi cấy các mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh khoai tây trên môi trường: PSA, PGA.

-Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát trển của các mẫu phân lập vi khuẩn héo xanh khoai tây.

3.4.3 Nghiên cứu tính gây bệnh, tính độc của vi khuẩn gây bệnh héo xanh khoai tây

-Lây bệnh trở lại trên cây khoai tây theo quy tắc Koch.

- Lây nhiễm bệnh chéo trên một số cây ký chủ như: cà chua, cà tím, trong điều kiện chậu vại.

3.4.4 Khảo sát hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại khoai tây bằng vi khuẩn Bacillus subtilis và chế phẩm sinh học BT15

Thử nghiệm phòng trừ bệnh HXVK hại khoai tây bằng vi khuẩn đối kháng -

B.subtilis và chế phẩm sinh học BT15 (Bacillus subtilis; Bacillus lichennifomic; Sacharomyces cerevisiae; Lactobacilus plantarum).

- Khảo sát hiệu lực đối kháng của vi khuẩn B.subtilis trên môi trường nhân tạo.

- Khảo sát hiệu quả phòng trừ bệnh của chế phẩm sinh học BT15 trong điều kiện chậu vại.

- Khảo sát hiệu quả phòng trừ bệnh của chế phẩm sinh học BT15 ở điều kiện ngoài đồng ruộng.

Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn ngoài đồng ruộng

3.5.1.1 Ch ẩ n đ oán và nh ậ n bi ế t héo xanh vi khu ẩ n trên đồ ng ru ộ ng

Để chẩn đoán nhanh bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK), cắt đoạn gốc thân cây bị bệnh và nhúng vào nước sạch Sau vài phút, nếu thấy dịch trắng sữa chảy ra từ đầu lát cắt và trong cốc, kết luận rằng cây bị bệnh HXVK Quan sát triệu chứng cây héo, nếu cắt ngang thân thấy màu nâu, thâm đen, cắt đoạn dài 3-5cm và đặt trong nước sạch Nếu thấy dịch vi khuẩn màu trắng sữa tiết ra, đó là do bệnh héo xanh R solanacearum Smith gây ra.

3.5.1.2 Đ i ề u tra b ệ nh héo xanh vi khu ẩ n h ạ i khoai tây ngoài đồ ng ru ộ ng

* Điều tra tình hình chung của bệnh HXVK hại trên cây khoai tây tại Quảng Ninh:

Điều tra thực trạng bệnh HXVK ngoài đồng ruộng được thực hiện theo phương pháp của Cục Bảo vệ Thực vật (1995) và Viện BVTV (1997) Tại các ruộng đã chọn, điều tra diễn ra theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm khảo sát 50 cây, thực hiện tại 3 ruộng và nhắc lại 3 lần, bao gồm cả chân đất vàn cao và vàn thấp, với mật độ trồng từ 4 củ/m² đến 6 củ/m² Dựa vào triệu chứng điển hình của bệnh HXVK trên đồng ruộng, mức độ nhiễm bệnh được đánh giá một cách chính xác.

- Thời gian điều tra được tiến hành vào vụ đông năm 2014 và vụ xuân năm 2015.

Trong đó: A: tổng số cây bị bệnh;

B: tổng số cây điều tra;

* Điều tra tình hình phát sinh phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại trên cây khoai tây vụ xuân năm 2015 tại Quảng Ninh:

+) Điều tra theo phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng của của Cục bảo vệ thực vật (1995), Viện BVTV (1997).

+) Các thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh RCB.

Chúng tôi đã tiến hành trồng và theo dõi hai giống khoai tây Atlantic và Solara tại thị xã Quảng Yên và huyện Bình Liêu, với diện tích thí nghiệm là 360m², thực hiện 3 lần Bố trí thí nghiệm được thiết lập theo các công thức, trong đó mỗi công thức điều tra tại 5 điểm cố định trên đường chéo, với 50 cây tại mỗi điểm Việc điều tra diễn ra định kỳ 7 ngày một lần, dựa vào triệu chứng điển hình của bệnh HXVK trên đồng ruộng để đánh giá tỷ lệ bệnh.

Kỹ thuật trồng trọt được thực hiện theo “Kỹ thuật sản xuất khoai tây” của Cục Trồng trọt năm 2009.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%).

Bố trí thí nghiệm để theo dõi và đánh giá mức độ gây hại của bệnh HXVK trên cây khoai tây được thực hiện thông qua các biện pháp kỹ thuật canh tác cụ thể.

- Ảnh hưởng của giống đến bệnh HXVK hại khoai tây Thí nghiệm được bố trí 2 công thức, trên 2 giống khoai tây: +)

- Ảnh hưởng của địa thế đất đến bệnh HXVK hại khoai tây

Thí nghiệm được bố trí 3 công thức:

+) Công thức 1: Chân đất vàn thấp.

+) Công thức 2: Chân đất vàn.

+) Công thức 3: Chân đất vàn cao.

- Ảnh hưởng của mật độ trồng đến bệnh HXVK hại khoai tây Thí nghiệm được bố trí 3 công thức:

+) Công thức 1: Mật độ trồng 4 củ/m 2

+) Công thức 2: Mật độ trồng 6 củ/m 2

+) Công thức 3: Mật độ trồng 8 củ/m 2

- Ảnh hưởng của chế độ luân canh đến bệnh HXVK hại khoai tây

Thí nghiệm được bố trí 3 công thức:

+) Công thức 1: Lúa - Lúa - Khoai tây.

+) Công thức 2: Lúa - Rau màu - Khoai tây (Rau màu: rau ăn lá, bí, dưa chuột) +) Công thức 3: Lúa - Lạc - Khoai tây.

- Ảnh hưởng của lượng bón phân đạm urê đến bệnh HXVK hại khoai tây.

+) Công thức 1: Phân chuồng 700kg; phân đạm urê 10kg; phân lân super 15kg; phân kali 8kg.

+) Công thức 2: Phân chuồng 700kg; phân đạm urê 12kg; phân lân super 15kg; phân kali 8kg.

+) Công thức 3: Phân chuồng 700kg; phân đạm urê 14kg; phân lân super 15kg; phân kali 8kg.

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

3.5.2.1 Ph ươ ng pháp phân l ậ p và nuôi c ấ y vi khu ẩ n

Để phân lập vi khuẩn, sử dụng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn để lấy mẫu dịch từ bề mặt cắt của thân cây hoặc củ khoai tây bị nhiễm bệnh Sau đó, cấy mẫu vào môi trường PSA và PGA, và nuôi trong điều kiện nhiệt độ 28°C Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau 24 và 48 giờ để đánh giá kết quả.

- Môi trường phân ly nuôi cấy vi khuẩn R solanacearum:

+) Môi trường PSA (Peptone - Sacarose - Agar) (Hayward, A.C, 1960). Thành phần: Sacarose:

+) Môi trường PGA (Potato - Glucose - Agar).

Các ống dịch vi khuẩn này được bảo quản ở 25 0 C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

- Thành phần môi trường nuôi cấy VKĐK- B.subtilis và chế phẩm BT15:

Các thành phần môi trường nuôi cấy được pha chế theo công thức đã chỉ định và chia vào các ống nghiệm Sau đó, môi trường được hấp trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,5 atm trong 25 phút Cuối cùng, thực hiện thí nghiệm bằng cách đổ môi trường ra đĩa petri và để nguội.

3.5.2.2 Ph ươ ng pháp nghiên c ứ u đặ c đ i ể m hình thái, đặ c tính sinh h ọ c c ủ a các m ẫ u phân l ậ p vi khu ẩ n Ralstonia solanacearum

Nghiên cứu vi khuẩn R solanacearum trong điều kiện nuôi cấy invitro:

Cấy các mẫu phân lập vi khuẩn trên môi trường: PSA, PGA đặt trong điều kiện nhiệt độ 28 0 C.

-Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum.

Bố trí thí nghiệm bao gồm hai công thức được thực hiện trên hai môi trường khác nhau là PSA và PGA Mỗi công thức được lặp lại ba lần, với mỗi lần lặp lại sử dụng ba đĩa petri.

Phương pháp tiến hành nghiên cứu bao gồm việc chuẩn bị mẫu phân lập vi khuẩn QN41 từ cây khoai tây giống Atlantic tại huyện Bình Liêu Các đĩa Petri chứa môi trường PSA và PGA được sử dụng để hòa vi khuẩn thuần trong nước vô trùng với mật độ tế bào 10^8 CFU/ml Sau đó, 0,1ml dịch vi khuẩn được pipet và láng đều lên bề mặt môi trường Cuối cùng, các đĩa môi trường được đặt trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28°C để nuôi cấy vi khuẩn.

Quan sát hình thái, số lượng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, đường kính khuẩn lạc sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy.

3.5.2.3 Thí nghi ệ m kh ả o sát kh ả n ă ng phòng tr ừ vi khu ẩ n Ralstonia solanacearum trên môi tr ườ ng nhân t ạ o

Phương pháp tiến hành thí nghiệm bao gồm việc chuẩn bị hộp Petri chứa 15ml môi trường PSA (pH=7) Sau đó, hòa vi khuẩn mẫu phân lập bệnh héo xanh trong nước vô trùng để đạt mật độ bào tử 10^8 CFU/ml, rồi dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn và trang đều lên bề mặt môi trường Tiếp theo, sử dụng giấy lọc hình tròn (đã được hấp vô trùng) có đường kính 5mm nhúng vào dịch B subtilis với mật độ tế bào 10^8 CFU/ml đã pha ở các nồng độ 10%, 20%, 30%, và đặt vào các đĩa môi trường Cuối cùng, thí nghiệm được thực hiện trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28°C.

Nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh được sử dụng trong thí nghiệm là mẫu phân lập QN41 được lấy tại Tình Húc - Bình Liêu - Quảng Ninh.

Thí nghiệm được tiến hành với 4 công thức, mỗi công thức 3 đĩa, nhắc lại 3 lần.

- Thí nghiệm sử dụng vi khuẩn đối kháng B subtilis, mật độ tế bào 10 8 CFU/ml được pha ở nồng độ 10%; 20%; 30%.

CT1 (đối chứng): Giấy lọc thấm nước vô trùng.

CT2: Giấy lọc thấm B subtilis 10%.

CT3: Giấy lọc thấm B subtilis 20%.

CT4: Giấy lọc thấm B subtilis 30%.

Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính vòng vô khuẩn ở các công thức thí nghiệm sau nuôi cấy 24, 48 và 72 giờ.

3.5.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn trong điều kiện chậu vại và ngoài đồng ruộng

3.5.3.1 Ph ươ ng pháp nghiên c ứ u tính gây b ệ nh c ủ a m ẫ u phân l ậ p vi khu ẩ n gây b ệ nh héo xanh

- Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo trên khoai tây (theo quy tắc Koch):

Tiến hành trồng củ khoai tây trong các chậu chứa đất canh tác đã được hấp ở 121°C với áp suất 1,5 atm trong 45 phút Khi cây phát triển đến giai đoạn có 3 - 5 lá thật, tiến hành lây bệnh nhân tạo bằng cách sử dụng nguồn vi khuẩn đã được phân lập với mật độ bào tử 10^8 cfu/1ml Phương pháp lây bệnh được thực hiện bằng cách tiêm vi khuẩn vào nách lá thứ 3-4 của cây Mỗi công thức được thực hiện lặp lại 3 lần, với mỗi lần áp dụng cho 30 cây.

+ Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%) sau 7, 14, 21, 28 ngày lây nhiễm.

3.5.3.2 Thí nghi ệ m kh ả o sát kh ả n ă ng phòng tr ừ b ệ nh héo xanh vi khu ẩ n trong đ i ề u ki ệ n ch ậ u v ạ i t ạ i nhà l ướ i

Thí nghiệm bao gồm 4 công thức trên giống khoai tây Atlantic và Solara, được lặp lại 3 lần với mỗi lần 30 cây trong chậu nhựa 18cm x 22cm Củ giống khoai tây được ngâm trong dung dịch chế phẩm sinh học BT15 và mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum trong 30 phút khi củ đã nảy mầm, với mật độ tế bào 10^8 CFU/ml Giá thể trồng bao gồm đất tầng canh tác và trấu hun theo tỷ lệ 1:1, được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 độ C và áp suất 1,5 atm trong 45 phút.

- Kỹ thuật trồng trọt theo “Kỹ thuật sản xuất khoai tây” (2009) của Cục Trồng trọt.

Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức, cụ thể:

+) CT1 (đối chứng): Ngâm củ khoai tây trong 300ml dung dịch mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum – QN41.

Ngâm củ khoai tây vào 300ml dung dịch chế phẩm sinh học BT15 Khi củ khoai tây đã nảy mầm lên mặt đất, tiến hành tưới 300ml dịch vi khuẩn R solanacearum.

+) CT3: Ngâm củ khoai tây đồng thời vào 300ml dung dịch vi khuẩn R. solanacearum và 300ml dung dịch chế phẩm sinh học BT15, sau đó trồng.

Ngâm củ khoai tây trong 300 ml dung dịch vi khuẩn R solanacearum Sau khi củ khoai tây nảy mầm lên mặt đất, tưới 300 ml dịch chế phẩm sinh học BT15.

Thời gian ngâm củ khoai tây trong các dịch vi khuẩn R solanacearum và dịch chế phẩm sinh học BT15 là 30 phút, mỗi bình ngâm 10 củ.

Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%) sau 7, 14, 21, 28 ngày lây nhiễm.

3.5.3.3 Thí nghi ệ m kh ả o sát kh ả n ă ng phòng tr ừ b ệ nh héo xanh vi khu ẩ n h ạ i khoai tây b ằ ng ch ế ph ẩ m sinh h ọ c BT15 trong đ i ề u ki ệ n ngoài đồ ng ru ộ ng

- Thí nghiệm được bố trí trên giống khoai tây Atlantic và Solara ở vụ đông năm 2015 tại Quảng Yên - Quảng Ninh.

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh với 3 công thức, mỗi công thức được lặp lại 3 lần Diện tích ô thí nghiệm cho mỗi lần lặp lại là 8m², tương ứng với 48 cây Mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh được sử dụng trong thí nghiệm này.

- Kỹ thuật trồng trọt theo “Kỹ thuật sản xuất khoai tây” (2009) của Cục Trồng trọt.

Các công thức được bố trí thí nghiệm như sau:

+) CT1 (đối chứng): Tưới 300ml dịch vi khuẩn R solanacearum (mật độ tế bào 10 8 CFU/ml) cho 1 cây, sau 10 ngày tưới 300ml nước lã.

+) CT2: Tưới 300ml dịch vi khuẩn R solanacearum cho 1 cây, sau 10 ngày tưới 200ml chế phẩm sinh học BT15 (mật độ tế bào 10 8 CFU/ml).

+) CT3: Tưới 300ml dịch vi khuẩn R solanacearum cho 1 cây, sau 10 ngày tưới 300ml chế phẩm sinh học BT15 (mật độ tế bào 10 8 CFU/ml).

- Thời gian tưới dung dịch vi khuẩn R solanacearum lây bệnh HXVK là 20 ngày sau trồng (cây khoai tây đã cao 15cm - 20cm).

Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%) và hiệu lực phòng trừ bệnh HXVK (%) của chế phẩm BT15 sau 7, 14 ngày.

- Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm sinh học BT15 trong điều kiện chậu vại và ngoài đồng ruộng được tính theo công thức Abbott.

HLPT (%): Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm sinh học.

C: số cây chết ở công thức đối chứng (không xử lý chế phẩm).

T: số cây chết ở công thức thí nghiệm (có xử lý chế phẩm).

3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm IRRISTART 4.0 và Excel Giá trị trung bình của các nghiệm thức được so sánh thông qua các phương pháp F, t, LSD, và Dulcan với mức xác suất P = 0,95 (α = 0,05) Các ký hiệu chữ cái a, b, c… được sử dụng để chỉ ra rằng các giá trị trung bình có chữ giống nhau có ý nghĩa tương đương theo trắc nghiệm Dulcan.